王亞蘭，張 笑，韓邦興，歐陽臻，魏 淵*

（1.江蘇大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012）

石斛為我國名貴中藥植物，其藥用始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［1］：“味甘平，主傷中，除弊，下氣……”?，F(xiàn)代研究表明石斛具有廣泛的藥理活性，包括抗氧化［2］、抗腫瘤［3］、抗肝損傷［4］、抗炎［5］等作用。石斛堿和石斛酚分別是石斛屬植物的生物堿類和酚酸類成分，廣泛存在于金釵石斛［6］、鐵皮石斛［7］和霍山石斛［8］等植物中。石斛堿是一種倍半萜生物堿［9］，2020 版《中國藥典》規(guī)定金釵石斛中石斛堿的含量不少于0.40%［10］?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)石斛堿具有抗腫瘤［11］、抗糖尿?。?2］、抗流感病毒［13］以及抗肝損傷［14］等多種藥理活性。石斛酚是石斛屬植物中特有的雙芐基化合物，具有抗腫瘤［15］、抗炎［16］、抗白內(nèi)障［17］和抗氧化［18］生物活性。但石斛堿和石斛酚對細(xì)胞色素P450酶的表達與活性的作用鮮有文獻報道。

細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450）又稱混合功能氧化酶和單加氧酶，主要在肝臟細(xì)胞中表達，是生物轉(zhuǎn)化中重要的I 期酶［19］，對外源物質(zhì)的解毒、細(xì)胞代謝和體內(nèi)平衡起著關(guān)鍵作用。在所有化合物（普通化學(xué)品、天然和生理化合物以及藥物）的代謝過程中，超過90%的酶反應(yīng)是由P450 酶催化的［19］。人體內(nèi)參與藥物代謝的主要P450 酶有CYP3A4（27%）、2D6（13%）、2C9（10%）、2C19（9%）、1A2（9%）、3A5（6%）、1A1（5%）、2B6（4%）和2E1（3%）等成員［20］。因此，誘導(dǎo)或抑制P450 酶是導(dǎo)致藥物-藥物相互作用（Drug-drug interaction，DDI）主要機制。例如，許多化療藥物能夠抑制或誘導(dǎo)CYP 酶系統(tǒng)引起藥物相互作用［21］。然而藥物可以由一種或多種P450 酶代謝［22］：例如新型口服抗凝藥依度沙班通過CYP3A4 代謝，但另一種新型口服抗凝藥阿哌沙班則 由 CYP3A4、CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9 和CYP2C19 代謝。多種藥物也可能被同一種酶（例如紅霉素）代謝或抑制相同的酶，或者可以被一種酶代謝并抑制另一種酶（例如特比萘芬）［23］。因此如果由某個CYP 酶代謝的藥物與另一種作為該酶抑制劑的藥物聯(lián)合使用，就會受到DDI的影響：例如美托洛爾和達克替尼合用可導(dǎo)致美托洛爾的血藥濃度大幅度升高，從而導(dǎo)致肝損傷［24］。

中藥復(fù)雜的活性成分可能影響P450 酶的表達與活性［25］。給長期服用中藥的人聯(lián)合用藥時，中藥中的活性成分可以通過誘導(dǎo)或抑制P450 酶而改變其他藥物的代謝，影響其療效。例如，Ji等人［26］報道了急性腎功能衰竭患者的七葉皂苷鈉和銀杏葉提取物注射液的聯(lián)合治療，銀杏葉提取物對CYP2C9和CYP3A4酶的抑制作用可能影響其治療效果。

石斛具有很高的藥用價值，目前還被列入了中國保健品目錄和歐盟新食品目錄，廣泛應(yīng)用于中國臨床和中藥復(fù)方［27］。本課題組前期對石斛與細(xì)胞色素P450酶的相互作用做了相關(guān)研究。結(jié)果表明，霍 山 石 斛 可 以 誘 導(dǎo)CYP1A1、CYP1A2、CYP2B 和CYP3A 蛋白表達［28-29］，在此并基礎(chǔ)上進一步研究了石斛活性成分與P450 酶之間的關(guān)系。通過探究石斛堿和石斛酚對小鼠肝臟P450 酶表達和活性的影響，為石斛的安全用藥提供指導(dǎo)，以減少不良反應(yīng)和副作用的發(fā)生，確保聯(lián)合用藥的安全性。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器

Spectra Max 190 型酶標(biāo)儀（美國MD 公司）；SK-1 快速混勻器（江蘇中大儀器廠）；Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），TE601-L 電子天平（北京Sartorius 儀器系統(tǒng)有限公司）；Pic017 臺式離心機（美國Thermo Fisher 公司）；倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）；Light Cycle 96 熒光定量PCR 儀（瑞士巴賽爾羅氏）；超微量紫外分光光度計（DUO 型號，Bio-Drop 公司）；電泳儀（DYY-6C，北京市六一儀器廠）。

1.2 主要試劑

石斛堿（上海源葉生物科技有限公司，批號：Y09J9L62594，HPLC≥95%）；石斛酚（上海源葉生物科技有限公司，批號：Y14D9L77641，HPLC≥98%）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）等檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；山羊抗鼠二抗（A0216）和山羊抗兔二抗（A0208）購自南通碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗人CYP1A1 多克隆抗體（sc-20772）、鼠抗 人CYP1A2 單克 隆 抗體（sc-53241）、兔 抗 人CYP2A 多克隆抗體（sc-33214）、鼠抗人CYP2B1/2單克隆抗體（sc-73546）和兔抗人CYP3A 多克隆抗體（sc-25845）購自美國SantaCruz 公司；兔抗人CYP2E1 單克隆抗體（BML-CR3271）購自美國Enzo公司；兔抗人CYP2C19 多克隆抗體（ab137015）從美國Abcam 購買；兔抗人CYP2D6 單克隆抗體（PAB19502）購自中國臺北Abnova 公司。兔抗人Calnexin 單克隆抗體（10427-2-AP）購自美國Proteintech Group 公司；乙氧基間苯二酚、間苯二酚和β-NADPH 購自上海Aladdin；非那西丁、安非他酮、苯妥英鈉和硝苯地平購自薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司。所有其他試劑均為分析純。

1.3 試驗動物

SPF 級C57BL/6 小鼠35 只，8 周齡，雄性，體重20±2 g，購自江蘇大學(xué)實驗動物中心（動物許可證號：SCXK［京］2018-0053）。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后用于實驗（25±2℃，相對濕度60%，光/暗周期12h）。在實驗期間提供標(biāo)準(zhǔn)的實驗室飼料，自由進食和飲水。

2 方法

2.1 分組及給藥

將C57BL/6 小鼠隨機分成7 組，每組5 只，分別設(shè)置為空白組、石斛堿低劑量組（0.5 mg·kg-1）、石斛堿中劑量組（1.5 mg·kg-1）、石斛堿高劑量組（3 mg·kg-1）、石斛酚低劑量組（0.02 mg·kg-1）、石斛酚中劑量組（0.05 mg·kg-1）、石斛酚高劑量組（0.1 mg·kg-1），化合物以0.5%的羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液溶解。所有實驗小鼠每隔24 h 腹腔注射給藥1 次，連續(xù)給藥2 周，空白對照為注射等體積的0.5%CMC-Na 溶液，末次給藥完禁食12 h，稱重，眼靜脈取血，頸椎脫臼法處死小鼠迅速摘除肝臟。所有動物繁殖和實驗操作均按照“實驗動物關(guān)愛和使用指南”進行，并經(jīng)江蘇大學(xué)機構(gòu)動物關(guān)愛和使用委員會（UJS-CAER-AP-2018101101）批準(zhǔn)。

2.2 Western blot分析

采用差速離心法制備小鼠肝微粒體［30］，取肝組織0.15 g 用冰生理鹽水沖洗，放入玻璃管中，加入3 mL 的KCl-蔗糖緩沖液，用組織勻漿器將肝組織勻漿，4℃，1.2×104r·min-1離心20 min。棄去沉淀，將上清液轉(zhuǎn)移到高速離心管中，4℃，4×104r·min-1超高速離心1 h。棄去上清，將沉淀轉(zhuǎn)移到玻璃研磨器中，加入甘油-磷酸緩沖液，用研磨器將沉淀研磨至溶解，分裝后，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ肂CA 蛋白質(zhì)濃度分析試劑盒（上海碧云天）測定微粒體懸液中的蛋白質(zhì)濃度。Western blot 檢測肝微粒體中P450 亞型的表達。

用SDS-PAGE胺凝膠電泳分離小鼠肝微粒體的等量蛋白質(zhì)（5 μg）［31］，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上（美國Millipore 公司）。Calnexin 作為內(nèi)參蛋白。分別用CYP1A1、CYP1A2、CYP2Bs、CYP3As、CYP2C19、CYP2D6 和CYP2E1 的一抗在4℃過夜，然后與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗孵育。用ECL 試劑檢測蛋白質(zhì)條帶。使用ChemiDoc XRS成像系統(tǒng)（美國加利福尼亞州大力神Bio-Rad）對化學(xué)發(fā)光信號進行可視化和分析，然后用Image J軟件進行灰度值分析。

2.3 細(xì)胞色素P450活性的測定

取對照組、3 mg·kg-1石斛堿組和0.1 mg·kg-1石斛酚組小鼠肝微粒體。以乙氧基二苯醚［32］、非那西?。?3］、硝苯地平［34］、安非他酮［35］和苯妥英鈉［36］為探針底物，分別檢測小鼠肝微粒體中CYP1A1、CYP1A2、CYP3As、CYP2Bs 和CYP2Cs 酶活性，并優(yōu)化孵育條件。底物溶于甲醇，并用甲醇連續(xù)稀釋至所需濃度（5 mg·mL-1）。在磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）中進行200 μL 體外孵育體系，包括包含10 μL 小鼠肝微粒體、20 μL MgCl2溶液，20 μL 底物溶液、130 μL 磷酸鹽緩沖溶液，37℃孵育5 min 后加入20 μL β-NADPH 啟動反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后向體系中加入200 μL 冰甲醇終止反應(yīng)。以1×104r·min-1離心10 min，收集上清液進行分析。CYP1A1 酶活性以脫乙基酶（EROD）的活性作為指標(biāo)，并以每分鐘內(nèi)每克蛋白反應(yīng)生成試鹵靈的量顯示。CYP1A2、CYP3As、CYP2Bs 和CYP2Cs 酶活性以探針?biāo)幬锓磻?yīng)前后的轉(zhuǎn)化程度作為檢測酶活性的指標(biāo)［37］，以單位時間內(nèi)單位蛋白消耗的底物量來表示。

CYP1A1酶活性：肝微粒體蛋白濃度2 mg·mL-1，孵育時間30 min；熒光分光光度計測定熒光值，檢測條件為：激發(fā)波長569 nm，發(fā)射波長585 nm。

CYP1A2 酶活性測定：肝微粒體蛋白濃度0.5 mg·mL-1，孵 育時 間30 min；Supersil AQ-C18（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱，進樣量20 μL，柱溫30℃，流速1.0 mL·min-1，流動相為甲醇：水＝48 ：52，檢測波長為247 nm。

CYP3As 酶活性測定：肝微粒體蛋白濃度0.5 mg·mL-1，孵 育 時 間30min；Supersil AQ-C18（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱，進樣量20 μL，柱溫30℃，流速1.0 mL·min-1，流動相為甲醇：水= 62 ：38，檢測波長為214 nm。

CYP2Bs 酶活性測定：肝微粒體蛋白濃度0.5 mg·mL-1，孵育時間30 min；色譜柱為Supersil AQC18（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱，進樣量20 μL，柱溫30℃，流速1.0 mL·min-1，流動相為甲醇：0.01 mol·L-1乙酸銨=55：45（pH=4.0），檢測波長為250 nm。

CYP2Cs 酶活性測定：肝微粒體蛋白濃度0.25 mg·mL-1，孵育時間30 min；色譜柱為Supersil AQC18（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱，進樣量20 μL，柱溫30℃，流速1.0 mL·min-1，流動相為甲醇：水=50 ：50，檢測波長為240 nm。

2.4 一般肝臟毒理學(xué)分析

室溫下凝血30 min，3500 r·min-1離心10 min 制備血清，測定血清ALT、AST 濃度。肝組織用冰磷酸鹽緩沖液（1：9，w/w）勻漿，3500 r·min-1離心10 min制備肝勻漿液，測定肝組織中GSH 和MDA 含量。其余肝組織用10%中性福爾馬林緩沖液固定，進行組織學(xué)檢查。組織切片（5 μm），H&E 染色，光學(xué)顯微鏡拍照并分析。

2.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均以x±s 表示。使用SPSS 13.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，用單因素方差分析（ANOVA）評價數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)意義。P＜0.05 表示具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01表示差異有重要統(tǒng)計學(xué)意義。

3 試驗結(jié)果

3.1 石斛堿和石斛酚對主要P450蛋白表達的影響

3.1.1 石斛堿對細(xì)胞色素P450酶蛋白表達的影響

石斛堿對主要P450 酶蛋白表達的影響結(jié)果見圖1 和表1。石斛堿可以顯著誘導(dǎo)CYP1A1、CYP2Bs 蛋白表達（P＜0.01）；石斛堿低、中、高劑量組誘導(dǎo)CYP2C19 蛋白的表達且呈劑量依賴性增加（P＜0.01）。 暫 未 觀 察 到 對 其 他P450 酶 的影響。

表1 石斛堿Western blot灰度值分析Tab.1 Western blot results of dendrobine

圖1 石斛堿對細(xì)胞色素P450酶蛋白表達的影響Fig.1 Effect of dendrobine on cytochrome P450 protein expression

3.1.2 石斛酚對細(xì)胞色素P450酶蛋白表達的影響

石斛酚對主要P450 酶蛋白表達的影響結(jié)果見圖2和表2。結(jié)果顯示，石斛酚低、中、高劑量組可以顯著提升CYP1A1、CYP1A2、CYP2B 和CYP2C19 蛋白表達（P＜0.01）；石斛酚高劑量組可以顯著提升CYP3A 蛋白的表達（P＜0.01）；石斛酚低劑量組對CYP2E1蛋白表達存在上調(diào)作用（P＜0.05）。

表2 石斛酚Western blot灰度值分析Tab.2 Western blot results of dendrobol

圖2 石斛酚對細(xì)胞色素P450酶蛋白表達的影響Fig.2 Effect of dendrobol on the expression of cytochrome P450 enzyme protein

3.2 石斛堿和石斛酚對P450酶活性的影響

在細(xì)胞色素P450蛋白表達結(jié)果的基礎(chǔ)上，進一步研究了石斛堿和石斛酚對小鼠肝臟CYP1A1、CYP1A2、CYP3As、CYP2Bs 和CYP2Cs 酶活性的影響。結(jié)果見表3，石斛堿能顯著提高CYP1A1的酶活性（表3.1，P＜0.01），而對CYP1A2、CYP2Bs、CYP2Cs和CYP3As 的活性無顯著影響。石斛酚對CYP1A1、CYP1A2、CYP3As、CYP2Bs 和CYP2Cs 活性無顯著影響。

表3 小鼠肝微粒體細(xì)胞色素P450酶活性Tab.3 Activity of P450 enzymes in mouse liver microsomes

3.3 肝臟組織學(xué)

小鼠肝組織病理切片圖如圖3所示，圖3中A為空白對照組。由圖可見，小鼠肝組織形態(tài)正常，肝細(xì)胞排列整齊，界限分明，并未出現(xiàn)異?，F(xiàn)象。與空白組相比，不同劑量石斛堿和石斛酚組與空白組相似，肝組織形態(tài)正常，肝細(xì)胞排列整齊，邊界清晰，并未見明顯細(xì)胞壞死。

圖3 小鼠肝組織病理變化（H&E，染色200×）Fig.3 Pathological changes of liver tissue in mice（H&E staining，200×）

3.4 血清和肝組織生化分析

從表4中可以看出，與空白組相比，石斛酚高劑量組的AST 有所升高（P＜0.01），其余組別ALT 和AST值均低于空白組。石斛堿和石斛酚對小鼠肝臟GSH 和MDA 的影響結(jié)果見表5，石斛酚高劑量組MDA 較空白組升高（P＜0.05），其余各組均降低，而石斛堿和石斛酚均升高小鼠肝臟中的GSH值。

表4 石斛堿和石斛酚對小鼠肝臟指數(shù)的影響Tab.4 Effects of dendrobine and gigantol on liver index in mice

表5 石斛堿和石斛酚對小鼠肝臟MDA和GSH的影響Tab.5 Effects of dendrobine and gigantol on MDA and GSH in mice liver

4 討論

細(xì)胞色素P450 酶的活性通常與它的表達是一致的，例如炎癥抑制了某些細(xì)胞色素P450的蛋白表達，從而進一步抑制酶的活性［38］。另一項研究表明，長期吸煙對CYP2C11 和CYP3A1 酶活性有明顯的抑制作用，而對CYP1A2酶活性是誘導(dǎo)作用，并且蛋白表達水平與活性作用一致［39］。中藥活性成分對CYP 酶的表達和活性也有類似的影響。Wang 等人［40］發(fā)現(xiàn)牡荊素在體內(nèi)抑制大鼠肝臟CYP3A1 活性，對酶表達水平作用與活性作用一致。丹參酮ⅡA 是丹參中活性成分之一，可以提高CYP1A2 及CYP2E1的蛋白表達以及活性［41］。

有趣的是，本研究結(jié)果表明石斛堿能誘導(dǎo)CYP1A1、CYP2Bs 和CYP2Cs 的表達，石斛酚能誘導(dǎo)CYP1A1、CYP2Bs、CYP2Cs 和CYP2E1 的表達，但只有石斛堿對CYP1A1 酶活性存在誘導(dǎo)作用。石斛堿和石斛酚可以誘導(dǎo)這幾種P450酶的蛋白表達，但對這些酶的活性并沒有顯著影響，這可能與多方面的原因有關(guān)。石斛堿與石斛酚可能對這些P450 酶的蛋白表達誘導(dǎo)作用較小，不足以改變它們的活性。酶活性受到很多因素的影響，如底物、溫度、時間等。本實驗采用的檢測方法是體外底物探針法，與體內(nèi)環(huán)境有一定的差異；且實驗方法僅選取一種特異性底物測定酶活性，大部分酶活性還會受到其他底物的影響。

石斛堿和石斛酚對CYP1A1 和CYP1A2 蛋白表達作用與課題組前期霍山石斛鮮榨汁的研究結(jié)果相一致［28-29］。 CYP1A1 和CYP1A2 可以代謝多種化合物和藥物，然而，這兩種酶具有明顯重疊的底物的特異性，許多化合物可以顯著影響CYP1A1 和CYP1A2 對新陳代謝的相對貢獻。例如，在3-甲基膽蒽處理的大鼠微粒體中，一些化合物主要被CYP1A1氧化，而CYP1A2起次要作用［42］。

本實驗結(jié)果顯示，石斛堿對CYP1A1 酶的活性具有上調(diào)作用。CYP1A1酶是細(xì)胞色素P450酶家族的主要酶之一，參與臨床中約2.5%的藥物代謝，如氯丙咪嗪、丙咪嗪、米塞林和度洛西丁等［43］。已有不少中藥及其活性成分調(diào)節(jié)CYP1A1 酶活性的研究，如半枝連中的黃酮類成分可以抑制CYP1A1 酶的活性［44］；花楸獼猴桃根可以降低CYP1A1 酶的活性［45］；大青葉可以提高CYP1A1 酶的活性［46］；黃芩中黃酮類成分可以抑制CYP1A1 酶的活性［47］；白藜蘆醇可以抑制CYP1A1 酶的活性［48］。這些研究表明CYP1A1 酶在藥物代謝過程中發(fā)揮重要作用。石斛堿誘導(dǎo)CYP1A1 的活性，可能加快由該酶介導(dǎo)的藥物代謝速度，導(dǎo)致不良反應(yīng)。CYP1A1 被廣泛認(rèn)為是與二惡英、二惡英類化合物和多環(huán)芳烴的毒性和致癌性有關(guān)［49］。盡管大多數(shù)研究都集中在CYP1A1的致癌作用上［50］，但最近的研究發(fā)現(xiàn)，這種酶在解毒和化學(xué)預(yù)防中發(fā)揮著重要作用［51］。CYP1A1 可能作為一種致癌物解毒酶發(fā)揮作用，天然化合物具有的化學(xué)預(yù)防活性提供了對該酶抗癌保護作用的進一步的研究方向［52］。本研究結(jié)果表明，石斛堿和石斛酚均能顯著誘導(dǎo)CYP1A1 的表達，這可能與石斛潛在的抗癌機制有關(guān)。

生化結(jié)果顯示，石斛酚高劑量組的血清AST 以及肝臟MDA 升高，而肝臟組織形態(tài)正常，表明石斛酚在該劑量下對小鼠肝臟存在輕微損傷，提示在臨床應(yīng)用上需注意石斛酚的劑量風(fēng)險。此外，在本研究中使用的石斛堿低中高劑量和石斛酚低中劑量對小鼠是安全無毒的，對評估石斛酚和石斛堿的安全性具有重要意義。

綜上所述，本研究證實了石斛堿能提高小鼠CYP1A1 酶活性，提示在聯(lián)合使用含石斛堿藥物時需注意CYP1A1 酶代謝的藥物的劑量安全，確保這些藥物達到合理療效。本研究有助于更好地了解含石斛堿和石斛酚的中藥之間的藥物相互作用。然而本研究結(jié)果僅限于動物實驗，盡管我們的數(shù)據(jù)對石斛藥物的長期應(yīng)用具有很強的指導(dǎo)意義，但還需做進一步的臨床試驗來驗證。