黃醫(yī)明,王樹東,郭海清,張勝楠

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847)

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis，KOA)是常見的一種以膝周疼痛、關(guān)節(jié)功能下降為臨床特征的退行性關(guān)節(jié)疾病，是影響中老年人運(yùn)動(dòng)、導(dǎo)致疼痛及慢性殘疾的首要原因，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，具有高發(fā)病率、高致殘率的特點(diǎn)[1-2]。目前KOA的中西醫(yī)治療方法很多，但都不能從根本上解決疼痛和功能障礙問題。KOA病變時(shí)最先和最主要侵犯的部位是關(guān)節(jié)軟骨，而軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)合成軟骨基質(zhì)的唯一細(xì)胞。最近的研究發(fā)現(xiàn)[3]，在膝關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程中多伴隨軟骨細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常，前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[4-5]，Notch信號(hào)通路的激活與抑制在參加并調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖、凋亡過程中對關(guān)節(jié)軟骨的發(fā)育及改善膝關(guān)節(jié)炎的發(fā)展扮演著重要角色。此外，針灸作為中醫(yī)特色療法之一，治療膝骨關(guān)節(jié)炎也被廣泛用于臨床中[6]。因此，本研究試從Notch信號(hào)通路入手，觀察電針聯(lián)合關(guān)節(jié)松動(dòng)術(shù)對軟骨細(xì)胞內(nèi)Notch信號(hào)通路的相關(guān)受體配體的蛋白表達(dá)情況及對軟骨細(xì)胞凋亡的影響，來探究KOA的多元化治療方式及治療機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

32只日本大耳白兔,體質(zhì)量(2.5±0.5)kg，雌雄各半，倫理批號(hào)：21000042020050,動(dòng)物來源沈陽茂華生物科技有限公司,許可證號(hào)：SCXK(遼)2017-0001，實(shí)驗(yàn)過程中均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)范操作。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與主要儀器

Notch3-抗兔多克隆抗體、Dll1-抗兔多克隆抗體和HRP-兔抗山羊IgG(武漢博士德生物工程有限公司);10 %中性甲醛溶液及二甲苯、蘇木素溶液和1 %醇溶性伊紅溶液(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)樓);鹽酸氨基葡萄糖(奧泰零國藥準(zhǔn)字 HC20140008);生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(泰盟科技，BL-420S)；組織脫水機(jī)、組織包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)和染色機(jī)(英國Shandon公司)；顯微鏡LW600LT(北京測維光電儀器)；10 %水合氯醛溶液(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)樓)；手術(shù)刀、縫合線(魚躍集團(tuán))；電針儀(YUWELL);針灸針(華佗牌，0.25 mm×25 mm)；EPS300 電泳儀(天能科技)；凝膠成像分析系統(tǒng)(Alpha)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型建立 所有大耳白兔常規(guī)喂養(yǎng)1周，室溫恒定于(24±1)℃、濕度50 %～70 %，定期紫外線消毒，隨機(jī)抽取10只兔做空白對照，其余兔未發(fā)現(xiàn)異常后進(jìn)入造模階段。具體造模如下:經(jīng)兔耳緣靜脈注射10 %水合氯醛溶液，麻醉后采用Hulth方法[7],將家兔仰臥位固定，剔除左膝關(guān)節(jié)兔毛，碘伏消毒，沿左膝關(guān)節(jié)髕骨內(nèi)側(cè)切開，切斷前后交叉韌帶及外側(cè)副韌帶，檢測抽屜實(shí)驗(yàn)陽性[8]，術(shù)中避免損傷關(guān)節(jié)軟骨以及術(shù)后感染。術(shù)后不固定，分籠飼養(yǎng)自由活動(dòng)，可每日驅(qū)趕1次。

1.3.2 模型評(píng)價(jià) 采用改良的Lequesne MG評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[9]對模型組大耳白兔的膝關(guān)節(jié)進(jìn)行測量評(píng)估，包括局部疼痛、刺激反應(yīng)、關(guān)節(jié)活動(dòng)幅度、關(guān)節(jié)腫脹程度及步態(tài)改變幾個(gè)方面，評(píng)分8分以上即提示模型成功。隨機(jī)抽取空白兔和造模兔各3只，處死后取關(guān)節(jié)軟骨組織進(jìn)行形態(tài)及病理學(xué)比較，造模組可見軟骨表面粗糙且軟骨細(xì)胞排列錯(cuò)亂，未造模家兔軟骨表面光滑且軟骨細(xì)胞排列有序，提示造模成功。

1.3.3 模型分組 造模成功后家兔模型隨機(jī)分成模型組、西藥組、電針?biāo)蓜?dòng)術(shù)組與空白對照組，共4組，每組6只。

1.3.4 干預(yù)方法 ①空白組及模型組：正常飼養(yǎng)；②西藥組：根據(jù)等計(jì)量比值表參照臨床70 kg體重患者日服量進(jìn)行折算[9],以每只大耳白兔按20 mg/kg灌服鹽酸氨基葡萄糖，每日1次，連續(xù)5周；③電針?biāo)蓜?dòng)術(shù)組：采用針刺陽陵泉、犢鼻及足三里穴，實(shí)驗(yàn)過程中家兔的穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[10]，各穴位直刺1 cm并在針刺過程中針柄連接電針儀，通電調(diào)節(jié)疏密波(頻率5～20 Hz,疏波密波交替進(jìn)行，持續(xù)時(shí)間各1.5 s)，以兔腿微微顫動(dòng)為宜，15 min/次。電針達(dá)療程后，再進(jìn)行關(guān)節(jié)松動(dòng)術(shù)(對脛腓關(guān)節(jié)向后和向前向滑動(dòng)，對髕骨關(guān)節(jié)水平擺動(dòng)，對脛股關(guān)節(jié)屈伸旋轉(zhuǎn)及膝關(guān)節(jié)分離牽引)，1次/d，連續(xù)5周。

1.3.5 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集 各組干預(yù)5周后，禁食處理1 d，采用空氣栓塞法處死家兔，切取不同組家兔股骨遠(yuǎn)端及內(nèi)外髁負(fù)重面的關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本組織，并放入4 %多聚甲醛溶液中固定保存。

1.3.6 軟骨組織HE染色 ①脫水:取出固定好的膝關(guān)節(jié)軟骨組織，修整成約0.5 cm3大小的組織塊，全自動(dòng)脫水機(jī)進(jìn)行脫水;②包埋:脫水后將組織包埋凝固，將石蠟塊固定于切片機(jī)上進(jìn)行切片，切片厚度5 μm,烘干后進(jìn)行二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化;③染色:伊紅染色液浸染10 min，充分沖洗后，蘇木素浸染2 min，1 %鹽酸乙醇分化30 s，沖洗后晾干再以中性樹膠封片，顯微鏡下觀測染色后每組切片的病理變化并做比較。

1.3.7 Western Blot法檢測家兔Notch3及Dll1蛋白表達(dá)量 用生理鹽水沖洗干凈關(guān)節(jié)軟骨組織，將其盡量剪碎后與裂解液按1∶1 000比例混合，使其充分裂解后，以12 000 r/min、4 ℃離心 10 min。使用Invent試劑盒法提取蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，然后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白, 濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將 PVDF 膜放入平皿中，加入含5 %脫脂奶粉的封閉液，搖床振蕩，封閉1～2 h。將膜放入含Notch3和Dll1一抗的平皿中，4 ℃搖床振蕩孵育過夜，次日吸棄一抗，TBST洗3 次，5 min/次。再用5%脫脂奶粉封閉液以1∶8 000稀釋二抗(HRP-兔抗山羊IgG)，室溫?fù)u床振蕩反應(yīng)1～2 h，然后用TBST洗膜3 次，5～10 min/次。顯色，使用凝膠成像儀成像。通過成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，以目標(biāo)條帶和內(nèi)參條帶灰度值的比值反映各蛋白表達(dá)。

1.3.8 免疫組化染色檢測軟骨細(xì)胞中Bax的陽性表達(dá)率 4組軟骨細(xì)胞中的Bax表達(dá)均以細(xì)胞核為主，染色后可見其免疫陽性細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色，在染色均勻的區(qū)域隨機(jī)選取5個(gè)以上計(jì)數(shù)細(xì)胞不少于500個(gè)的高倍視野，再根據(jù)染色細(xì)胞所占的百分比來進(jìn)行評(píng)估(染色陽性的軟骨細(xì)胞/視野內(nèi)軟骨細(xì)胞總數(shù)×100 %)，取平均數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組行為學(xué)測試即改良的Lequesne MG評(píng)分比較

與空白組比較，模型組家兔膝關(guān)節(jié)活動(dòng)受限明顯，甚者無法屈伸行走，關(guān)節(jié)腫脹明顯,給予關(guān)節(jié)周圍指壓刺激后疼痛反應(yīng)明顯;與模型組比較，電針?biāo)蓜?dòng)術(shù)組與西藥組的家兔關(guān)節(jié)活動(dòng)輕度受限，可行走但伴有跛行,腫脹不明顯,且電針?biāo)蓜?dòng)術(shù)組的壓痛反應(yīng)明顯低于西藥組。治療前后的改良Lequesne MG評(píng)分：與空白組比較，模型組評(píng)分估值顯著增高(P<0.05);與模型組比較，電針?biāo)蓜?dòng)術(shù)組與西藥組均有所下降，且對比治療之前評(píng)分下降趨勢明顯(P<0.05)。見表1。

表1 各組家兔治療前后改良Lequesne MG評(píng)分比較

2.2 各組軟骨表面觀察

空白組家兔軟骨表面光滑，未見裂紋及潰瘍面；模型組家兔軟骨表面粗糙，破壞嚴(yán)重，肉眼可見裂紋及明顯潰瘍面，部分區(qū)域伴有軟骨面剝落；電針?biāo)蓜?dòng)術(shù)組軟骨表面欠光滑，軟骨面破壞較輕;西藥組與電針?biāo)蓜?dòng)術(shù)組大致相同，但見少量骨贅形成。見圖1。

2.3 各組HE染色切片比較

空白組表層軟骨細(xì)胞的排列比較均勻整齊，潮線完整。模型組表層破裂，凹凸不平，軟骨細(xì)胞排列紊亂且出現(xiàn)簇聚現(xiàn)象伴有彌漫性增生，有潮線中斷或較模糊現(xiàn)象。與模型組比較，電針?biāo)蓜?dòng)術(shù)組與西藥組軟骨細(xì)胞排列較為整齊，潮線輕度紊亂，標(biāo)本組織軟骨細(xì)胞數(shù)量增加。見圖2。

2.4 各組家兔Notch3、Dll1蛋白比較

治療結(jié)束后，與空白組比較，其余3組的Notch3及Dll1的蛋白表達(dá)量均升高(P<0.01)，但西藥組和電針?biāo)蓜?dòng)術(shù)組的蛋白表達(dá)量均低于模型組(P<0.01)，且電針?biāo)蓜?dòng)術(shù)組蛋白表達(dá)量略低于西藥組(P<0.01)。見表2、圖3。

表2 各組軟骨細(xì)胞中Notch3和Dll1蛋白含量

2.5 各組免疫組化Bax表達(dá)比較

與空白組比較，模型組軟骨細(xì)胞中Bax陽性表達(dá)率明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，西藥組與電針?biāo)蓜?dòng)術(shù)組的Bax陽性表達(dá)率均有降低(P<0.01)，且電針?biāo)蓜?dòng)術(shù)組比西藥組略低(P<0.01)。見表3、圖4。

表3 各組軟骨細(xì)胞中Bax陽性表達(dá)率

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，膝關(guān)節(jié)炎歸屬于“痹證”“骨痹”“勞損”等范疇，其病因病機(jī)多為年老體衰、筋骨勞傷或外感風(fēng)寒濕邪而致寒邪痹阻經(jīng)絡(luò)，氣血不暢，以筋肉、關(guān)節(jié)麻木疼痛或活動(dòng)不利為表現(xiàn)[11-12]，所以治療以益氣活血、祛風(fēng)除濕和溫通經(jīng)脈為原則。陽陵泉作為筋之會(huì)穴，是治療下肢筋骨病之要穴，又有溫經(jīng)通絡(luò)活血之功[13]?！恶R丹陽天星十二穴歌》記載:“膝腫并麻木，冷痹及偏風(fēng)，舉足不能起，針入六分止”，指出了陽陵泉作為筋之會(huì)穴治療“筋痹”的特殊作用。犢鼻穴又名外膝眼穴，具有疏風(fēng)散寒、消腫止痛功效，主治膝痛、麻痹及屈膝不利[14]，是針灸治療膝關(guān)節(jié)炎遵循局部近端選穴原則的典型代表?！鹅`樞·木輸》中的“刺犢鼻者，屈不能伸”也是犢鼻治療膝關(guān)節(jié)疾病的最早記載。足三里作為胃經(jīng)合穴，具有扶正祛邪、調(diào)和氣血之功。本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)針刺的基礎(chǔ)上，通電調(diào)節(jié)為疏密波以加強(qiáng)穴位刺激，同時(shí)疏密波本有抗炎鎮(zhèn)痛、緩解肌肉筋膜疲勞作用，能夠更好地驗(yàn)證KOA家兔模型的癥狀改善程度。此外，關(guān)節(jié)松動(dòng)術(shù)作為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)康復(fù)手段，主要用于治療力學(xué)因素引起的關(guān)節(jié)功能障礙，通過幫助關(guān)節(jié)被動(dòng)活動(dòng)牽拉刺激關(guān)節(jié)囊和肌腱筋膜來增大關(guān)節(jié)間隙，減輕膝關(guān)節(jié)軟骨表面摩擦的同時(shí)也增強(qiáng)軟骨組織活性，進(jìn)而起到緩解關(guān)節(jié)粘連和減輕疼痛作用[15]。本實(shí)驗(yàn)將兩種治療方式相結(jié)合，為KOA的改善和治療提供多元化選擇。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)關(guān)于KOA的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，其病因多與年齡、性別、職業(yè)、遺傳因素、體重及骨骼密度等有關(guān)[16]。近年來對KOA的發(fā)病機(jī)制研究主要包括軟骨退變、軟骨下骨退化、神經(jīng)傳導(dǎo)異常和關(guān)節(jié)力學(xué)改變等幾個(gè)方面[17-18]。在1989年相關(guān)研究結(jié)果表明，關(guān)節(jié)軟骨的病理改變是KOA發(fā)生的最初誘因，是關(guān)節(jié)軟骨及膝關(guān)節(jié)周圍結(jié)締組織代謝發(fā)生退變及損害的結(jié)果[19]。而軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)合成軟骨基質(zhì)的唯一細(xì)胞，膝骨關(guān)節(jié)炎時(shí)各種病理因素均直接或間接地作用于軟骨細(xì)胞，使其調(diào)控的軟骨基質(zhì)合成與降解的動(dòng)態(tài)平衡體系朝降解方向傾斜，并最終導(dǎo)致軟骨基質(zhì)的破壞。研究發(fā)現(xiàn)[20]電針可通過降低促炎癥性細(xì)胞因子，抑制滑膜炎癥反應(yīng)。進(jìn)而通過抑制細(xì)胞外基質(zhì)的分解代謝，減輕軟骨損害程度且能夠提高KOA模型大鼠的疼痛閾值，從而起到軟骨保護(hù)及抗炎鎮(zhèn)痛作用。

Notch信號(hào)通路是細(xì)胞在進(jìn)化過程中決定細(xì)胞新生衰敗的一種高度保守機(jī)制，其維持著成熟組織的內(nèi)部穩(wěn)態(tài)[21]。研究表明，Notch信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)軟骨合成代謝、分解代謝和纖維化基因調(diào)節(jié)的復(fù)雜性，參與并調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖、分化、凋亡的過程進(jìn)而誘導(dǎo)KOA的發(fā)生發(fā)展[22-23]。Notch3、Dll1作為Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要受體配體蛋白，是驗(yàn)證信號(hào)通路激活與抑制的靈敏載體。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)Notch信號(hào)通路激活時(shí)，Notch3與Dll1蛋白大量表達(dá)，且軟骨細(xì)胞凋亡程度加重進(jìn)而使關(guān)節(jié)軟骨損害程度加深，從而促進(jìn)KOA的發(fā)展[24]。此外，Bax作為bcl-2凋亡基因家族中最具代表性的凋亡基因，能夠降解DNA損傷修復(fù)酶，同時(shí)激活核酸內(nèi)切酶，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡[25]，為本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果間接提供了Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與軟骨細(xì)胞凋亡的關(guān)聯(lián)性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在電針聯(lián)合關(guān)節(jié)松動(dòng)術(shù)治療干預(yù)5周后，對比模型組與西藥組，其Notch3、Dll1及Bax蛋白的表達(dá)量均下降(P<0.05)，尤其與模型組對比效果明顯。提示在電針聯(lián)合松動(dòng)術(shù)的干預(yù)方式下，可能對軟骨細(xì)胞內(nèi)的Notch信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)起到了抑制作用，進(jìn)而降低軟骨細(xì)胞凋亡程度，從而改善了兔KOA癥狀表現(xiàn)。但本實(shí)驗(yàn)的不足之處是Notch信號(hào)通路的受體配體種類數(shù)量較少，可能存在其他Notch受體配體的差異性，需要后期的深入研究。

綜上，電針聯(lián)合關(guān)節(jié)松動(dòng)術(shù)的中醫(yī)特色治療手段可以抑制Notch信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程及其相關(guān)蛋白Notch3和Dll1的表達(dá)，同時(shí)可能降低軟骨細(xì)胞凋亡程度，改善家兔KOA病情程度及活動(dòng)幅度，對今后的治療提供多元化選擇。