郭文海,顏敬彧,邢 菁,陳 奧,徐 佳,馬伯艷,史珊怡△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是以進(jìn)行性的記憶和認(rèn)知功能障礙為特征，是最常見的老年期癡呆[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，AD占所有癡呆類型的60 %～70 %，是癡呆的主要類型[2]。在我國，AD以發(fā)病隱襲、病情進(jìn)展性加重以及有效治療手段缺乏等特點(diǎn)居于社會疾病之首[3]。目前主流學(xué)說認(rèn)為AD相關(guān)的病理生理學(xué)改變?yōu)橥挥|損傷或突觸功能減弱。而谷氨酸作為大腦中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)之一，其神經(jīng)傳遞對于神經(jīng)細(xì)胞可塑性以及學(xué)習(xí)、記憶具有根本作用。N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)是谷氨酸受體的主要亞型，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達(dá)，過度活化會導(dǎo)致神經(jīng)元不可逆的損傷。NMDAR作為導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病如AD的主要因素之一，已被研究多年。而與其相關(guān)的膜定位和區(qū)域化信號可能是AD相關(guān)病理生理學(xué)的關(guān)鍵[4]?，F(xiàn)代研究提示NMDAR通道功能的異常變化與在AD患者中觀察到的神經(jīng)毒性和變性相關(guān)，最終結(jié)果為導(dǎo)致與AD相關(guān)的神經(jīng)退行性變[5-7]。本研究擬觀察“原絡(luò)通經(jīng)”針法對SAMP8小鼠海馬CA-1區(qū)病理形態(tài)學(xué)及NMDAR表達(dá)水平變化的影響，初步探討“原絡(luò)通經(jīng)”針法治療AD的潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級SAMP8雄性8月齡小鼠30只，SAMR1 小鼠10只，上述40只小鼠體質(zhì)量約30～35 g，購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部)，許可證號：SCXK(京)2016-0010。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于清潔級環(huán)境下，予自由攝食飲水的喂養(yǎng)方式，保持環(huán)境溫度20～26 ℃，濕度40 %～70 %。將30只SAMP8雄性8月齡小鼠隨機(jī)分為SAMP8空白對照組、SAMP8+“原絡(luò)通經(jīng)”針法治療組以及SAMP8+百會穴針刺組，將10只SAMR1小鼠作為SAMR1正常對照組。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 華佗牌針灸針(0.30 mm×25 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；水迷宮(JLBehv-MWMG,上海玉研科學(xué)儀器有限公司)；藥品冷藏柜(BYC-310,山東博科生物)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(HGZF-101-1,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；顯微鏡(BX43,OLYMPUS)；切片機(jī)(2235,Leica)；超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)[Chemi DocTM XRS+,伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司]。

1.2.2 試劑 蘇木素染液(19120302,中衫金橋)；伊紅染色液(E607321,Sangon Biotech)；超凈高級封片膠(YZB,BASO)；Scott藍(lán)化液(G1865,Solarbio)；RIPA細(xì)胞裂解液(C1053, 北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(CW0014S, 康為世紀(jì))；Marker(#26617,Thermo)；PVDF膜(IPVH00010, Millipore)；封閉專用脫脂奶粉(P1622,北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；內(nèi)參一抗：Mouse Monoclonal Anti-GAPDH (TA-08,中杉金橋, 1/2000);二抗：辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L)(ZB-2305,中杉金橋,1/2000)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 針刺干預(yù)方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選穴定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》進(jìn)行取穴[8]，其中太白穴參照《針灸學(xué)》中人體定位并結(jié)合小鼠解剖學(xué)特征進(jìn)行取穴，定位于足內(nèi)側(cè)緣，第1跖趾關(guān)節(jié)后下方赤白肉際凹陷處。SAMR1正常對照組(SAMR1)：正常飼養(yǎng)，不進(jìn)行針灸，但要與SAMP8+“原絡(luò)通經(jīng)”針法治療組(SAMP8 Yuanluo Tongjing)和SAMP8+百會穴針刺組(SAMP8 Baihui)進(jìn)行相同程度的捉抓。SAMP8空白對照組(SAMP8 NC)同上。SAMP8+“原絡(luò)通經(jīng)”針法治療組:針刺豐隆穴、太白穴、關(guān)元穴與百會穴,其中豐隆直刺1 mm，太白直刺1 mm，關(guān)元向恥骨聯(lián)合方向呈45 °斜刺1.5 mm，百會向前斜刺2 mm,穴位分別施幅度：90 °～180 °，頻率：60～120 r/min，捻轉(zhuǎn)法30 s。SAMP8+百會穴針刺組:針刺百會穴，針刺手法、角度同SAMP8+“原絡(luò)通經(jīng)”針法治療組。SAMP8+“原絡(luò)通經(jīng)”針法治療組和SAMP8+百會穴針刺組兩組1次/d，持續(xù)30 d，每7 d休息1次。

1.3.2 Morris水迷宮行為學(xué)測定 分別于實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)結(jié)束后(第30天)對40只小鼠進(jìn)行為期7 d的Morris水迷宮行為學(xué)測定:①適應(yīng)階段。水迷宮主要由1個(gè)直徑0.9 m、高0.5 m的不銹鋼圓柱形水池和1個(gè)位置可移動(dòng)的直徑9 cm、高28 cm的平臺組成。預(yù)先在水池里注入清水達(dá)30 cm深，使水面髙出平臺1 cm，將水溫控制在(24±1)℃，并在水中加入黑色墨水。將平臺置于圓柱形水池第二象限的中間，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程平臺位置保持不變。攝像頭置于水池中央的上方約2 m處，自動(dòng)采集和圖像分析系統(tǒng)自動(dòng)記錄動(dòng)物的游泳路徑和搜索策略，以及逃避潛伏期、游泳距離、平均速度、初始角度與不同象限的停留時(shí)間等參數(shù)。②定位航行階段。依次將小鼠從4個(gè)象限的入水點(diǎn)處使其頭朝向池壁入水，記錄其找到平臺的時(shí)間(定向航行潛伏期)。若小鼠在90 s內(nèi)尚未找到平臺，則將其引至平臺，并讓小鼠在平臺上停留30 s，然后進(jìn)行下一象限訓(xùn)練。實(shí)驗(yàn)一共進(jìn)行5 d(次)，比較第1～5天小鼠的逃避潛伏期。③空間探索階段。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后，撤去平臺，在圓柱形水池第二象限將小鼠面向池壁放入水中，比較4組小鼠穿越平臺次數(shù)及其在目標(biāo)象限停留時(shí)間。小鼠2象限時(shí)間、路程占比以及站臺范圍1時(shí)間越長表示小鼠空間記憶能力越好。

1.3.3 新物體識別實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前7 d，實(shí)驗(yàn)人員每天定時(shí)撫摸小鼠5 min以緩解其緊張狀態(tài):①自由探索階段(T1)：于實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將小鼠單獨(dú)放入敞開的、底邊長33 cm×33 cm 的方形行為箱中，自由探索5 min。階段結(jié)束后將小鼠取出放回飼養(yǎng)籠，清理箱中殘留的糞尿并用75 %酒精擦拭。②相同物體階段(T2)：于T1階段結(jié)束后24 h開始，在行為箱中放入兩個(gè)完全相同的物體(物體1和1’) ，再次將小鼠放入行為箱中探索5 min。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，清理箱中殘留的糞尿并用75 %酒精擦拭。③替換物體階段(T3)：于T2階段結(jié)束后1 h開始，物體1保持不變，替換物體1’為大小相近的物體2，再次將小鼠放入行為箱中探索5 min。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，清理箱中殘留的糞尿并用75 %酒精擦拭。分別記錄T2階段以及T3階段中小鼠對兩個(gè)物體的探索時(shí)間，其中探索物體1的時(shí)間記為F，探索物體1’或2的時(shí)間記為N，計(jì)算小鼠對物體1’和2的分辨比(Discrimination ratio，DR)，計(jì)算公式為DR=N/(N+F)×100 %。將小鼠面向物體，其頭部與該物體的間距≤2 cm定義為探索。

1.3.4 海馬區(qū)病理損傷程度檢測 ①取出組織，經(jīng)流水沖洗數(shù)小時(shí)后，分別置入70 %、80 %和90 %的各級乙醇溶液中脫水，隨后依次放入純酒精及二甲苯等量混合液15 min、二甲苯Ⅰ15 min以及二甲苯Ⅱ15 min，直至透明為止;②放入二甲苯和石蠟各半的混合液中15 min，再放入石蠟Ⅰ及石蠟Ⅱ透蠟中各50～60 min;③石蠟包埋、切片，將石蠟切片進(jìn)行烤片，然后脫蠟、水化;④將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色3 min，隨后放入鹽酸乙醇分化液中分化15 s，后經(jīng)水洗返藍(lán)15 s。流水沖洗后，應(yīng)用伊紅染色液染色3 min;⑤流水沖洗后，進(jìn)行脫水、透明和封片，最后鏡檢。

1.3.5 海馬區(qū)NMDAR表達(dá)水平檢測 ①取小鼠海馬經(jīng)液氮研磨成粉末，加入裂解液后再次研磨，將組織勻漿吸入EP管中,經(jīng)冰上裂解30 min、12 000 rpm離心10 min后，吸取上清以獲得總蛋白并測定蛋白濃度;②將蛋白變性，上樣,經(jīng)十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳(SDS-PAGE)2 h;③應(yīng)用300 mA恒流轉(zhuǎn)膜80 min;④將蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液中漂洗1～2 min，隨后用微型臺式真空泵吸盡洗滌液，加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉60 min;⑤一抗溶液孵育，4 ℃下過夜;⑥二抗溶液孵育，室溫下2 h;⑦在膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“ImageJ”軟件分析各抗體條帶灰度值。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力變化情況

SAMR1和SAMR8小鼠在Morris水迷宮行為學(xué)測定后判斷各編號小鼠學(xué)習(xí)能力，包括定位航行潛伏期、分組后定位穿越平臺平均速度,見圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與SAMR1正常對照組比較，各SAMP8組小鼠定位航行潛伏期明顯延長，定位穿越平臺平均速度、2象限時(shí)間占比及路程占比、站臺范圍1時(shí)間明顯降低(P<0.05)。與SAMP8空白對照組比較，SAMP8+“原絡(luò)通經(jīng)”針法治療組小鼠2象限時(shí)間占比及路程占比、站臺范圍1時(shí)間明顯增加(P<0.05);SAMP8+百會穴針刺組小鼠2象限時(shí)間占比及路程占比明顯增加(P<0.05)。且與單獨(dú)針刺百會穴比較，“原絡(luò)通經(jīng)”針法在增加其2象限時(shí)間占比及路程占比、站臺范圍1時(shí)間方面效果更顯著(P<0.05)。見圖1、表1。

表1 各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力變化情況

2.2 小鼠新物體識別實(shí)驗(yàn)的變化情況

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干預(yù)后的SAMP8+“原絡(luò)通經(jīng)”針法治療組和SAMP8+百會穴針刺組在新物體探索時(shí)間以及分辨比兩個(gè)方面均優(yōu)于SAMP8空白對照組(P<0.05)。與SAMP8+百會穴針刺組比較，SAMP8+“原絡(luò)通經(jīng)”針法治療組在提升新物體探索時(shí)間以及提高分辨比兩個(gè)方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠新物體探索時(shí)間以及分辨比

2.3 小鼠腦海馬組織中 NMDAR 的表達(dá)情況

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與SAMP8空白對照組比較,SAMP8+“原絡(luò)通經(jīng)”針法治療組和SAMP8+百會穴針刺組中NMDAR表達(dá)水平顯著降低。見圖2、表3。

表3 各組小鼠腦海馬組織中NMDAR的表達(dá)情況

2.4 小鼠腦海馬組織HE染色

取各組小鼠海馬組織進(jìn)行HE病理染色，SAMP8對照組出現(xiàn)核皺縮，出現(xiàn)空泡。SAMP8+“原絡(luò)通經(jīng)”針法治療組和SAMP8+百會穴針刺組于干預(yù)后沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的病理問題。見圖3。

3 討論

AD是最常見的老年期認(rèn)知障礙疾病之一，其主要臨床表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙，病程多呈進(jìn)行性加重?，F(xiàn)有研究提示，NMDAR電生理功能異常導(dǎo)致谷氨酸攝取及再循環(huán)系統(tǒng)的嚴(yán)重削弱，被認(rèn)為與AD中觀察到的神經(jīng)毒性和變性密切相關(guān)[4]。作為谷氨酸能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)重要的組成部分，NMDAR在突觸功能和可塑性方面發(fā)揮了重要作用[9-10]，對AD患者LTP的建立也有重大影響[11]。在AD的病理學(xué)機(jī)制中，NMDAR受Aβ影響進(jìn)而導(dǎo)致谷氨酸能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)調(diào)節(jié)機(jī)制解除，其最終結(jié)果是AD患者在認(rèn)知、學(xué)習(xí)和記憶等方面出現(xiàn)功能障礙。有多項(xiàng)研究指出，谷氨酸攝取/再循環(huán)機(jī)制的損害會導(dǎo)致NMDAR供應(yīng)增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致AD相關(guān)的興奮性毒性和神經(jīng)退行性變[12-14]。因此涉及NMDAR的治療途徑可能在AD的防治中發(fā)揮重要作用[15]。

AD屬于中醫(yī)學(xué) “呆病” “善忘”等范疇。中醫(yī)理論認(rèn)為本病病因病機(jī)為腎虛髓虧、痰瘀閉阻腦絡(luò)以致神志靈機(jī)失用，即所謂“腦為元神之府，精髓之?！先私⊥撸X漸空也”。臨床中治法多圍繞補(bǔ)腎益髓、活血化痰以及醒腦益智?！霸j(luò)通經(jīng)”針法是腦血管病專家孫遠(yuǎn)征教授在臨床實(shí)踐中總結(jié)出的治療認(rèn)知功能障礙的有效方法，具有祛瘀通絡(luò)、補(bǔ)腎填精之功效[16]。原穴是臟腑原氣輸注、經(jīng)過和留止于十二經(jīng)脈四肢部的腧穴；絡(luò)穴是表里經(jīng)聯(lián)系的穴位，通經(jīng)是指激發(fā)疏通十二經(jīng)經(jīng)氣?！岸矫}為陽脈之海，總督諸陽經(jīng)，通于腦”“任脈為陰脈之?！保^為諸陽之會，故以任督二脈及陽經(jīng)穴為主交通陰陽，協(xié)調(diào)十四經(jīng)。關(guān)元為三陰經(jīng)與任脈之會，配以百會則更添行氣通經(jīng)之效。同時(shí)選擇太白-豐隆(脾經(jīng)原穴-胃經(jīng)絡(luò)穴)，配合一定的針刺補(bǔ)瀉手法，達(dá)到補(bǔ)虛瀉實(shí)的治療目的，正應(yīng)“脾主運(yùn)化，為后天之本”的中醫(yī)理論。前期多個(gè)研究顯示原絡(luò)通經(jīng)針法單獨(dú)使用或聯(lián)合西藥、中藥對血管性癡呆、輕度認(rèn)知功能障礙等多種認(rèn)識功能障礙均有較好療效[17-19]。

Morris水迷宮比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與SAMR1正常對照組比較，各SAMP8組小鼠定位航行潛伏期明顯延長，定位穿越平臺平均速度、2象限時(shí)間占比及路程占比、站臺范圍1時(shí)間明顯降低，提示模型組小鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力減退的老化性病態(tài)特征。而與SAMP8空白對照組比較,SAMP8+“原絡(luò)通經(jīng)”針法治療組2象限時(shí)間占比及路程占比、站臺范圍1時(shí)間明顯增加，提示在“原絡(luò)通經(jīng)”針法干預(yù)下，SAMP8小鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知功能得到明顯改善。且與單獨(dú)針刺百會穴比較，“原絡(luò)通經(jīng)”針法在增加其2象限時(shí)間占比及路程占比、站臺范圍1時(shí)間方面效果更顯著，提示在改善學(xué)習(xí)記憶能力方面“原絡(luò)通經(jīng)”針法優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用百會穴。

新物體識別實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干預(yù)后的SAMP8+“原絡(luò)通經(jīng)”針法治療組和SAMP8+百會穴針刺組在新物體探索時(shí)間以及分辨比兩個(gè)方面均優(yōu)于SAMP8空白對照組。與SAMP8+百會穴針刺組比較，SAMP8+“原絡(luò)通經(jīng)”針法治療組在提升新物體探索時(shí)間以及提高分辨比兩個(gè)方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。新物體識別實(shí)驗(yàn)主要用于檢查動(dòng)物對物體的識別記憶能力，其原理是動(dòng)物依照物體的相關(guān)特征以學(xué)習(xí)、記憶其相關(guān)信息，并建立在動(dòng)物對新物體自行探索的基礎(chǔ)上，具體指在對新奇物體接近、探索的時(shí)間更多。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明在“原絡(luò)通經(jīng)”針法和百會穴針刺干預(yù)下，SAMP8小鼠對物體的辨識能力有顯著提升。

而HE病理染色結(jié)果顯示，SAMP8空白對照組出現(xiàn)核皺縮及空泡，而SAMP8+“原絡(luò)通經(jīng)”針法治療組和SAMP8+百會穴針刺組在治療后未出現(xiàn)嚴(yán)重的病理問題，提示“原絡(luò)通經(jīng)”針法和百會穴針刺能有效改善SAMP8小鼠海馬組織病理形態(tài)學(xué)損傷。同時(shí)，WB檢測結(jié)果顯示 “原絡(luò)通經(jīng)”針法和百會穴針刺均能顯著降低NMDAR表達(dá)水平，提示“原絡(luò)通經(jīng)”針法可顯著提高突觸可塑性從而改善學(xué)習(xí)認(rèn)知功能，但兩種針刺組在降低NMDAR表達(dá)水平方面無顯著差異。

綜上所述，“原絡(luò)通經(jīng)”針法能有效改善SAMP8小鼠的海馬組織病理形態(tài)學(xué)改變及海馬組織神經(jīng)元損傷，改善其學(xué)習(xí)記憶能力，以起到防治AD的作用，機(jī)制可能是降低NMDAR蛋白的表達(dá)水平、抑制其過度活化，并改善其通道功能的異常變化。