陳惠,孫穎,焦宏哲,司友濤

(福建師范大學(xué) a.地理科學(xué)學(xué)院, b.濕潤(rùn)亞熱帶山地生態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,福州350007)

森林生態(tài)系統(tǒng)中底物有機(jī)質(zhì)的元素計(jì)量比和生物可利用性，是影響土壤微生物生長(zhǎng)和代謝的重要因素[1]。盡管底物的元素計(jì)量比多變, 但個(gè)體微生物的元素計(jì)量比卻相對(duì)穩(wěn)定, 此即微生物的內(nèi)穩(wěn)性[2]。微生物常采用兩種策略來(lái)維持個(gè)體的內(nèi)穩(wěn)性：(1)釋放胞外酶來(lái)降解有機(jī)物，以滿足自身對(duì)元素的需求[3]。酶活性的大小在一定程度上能反映土壤養(yǎng)分有效性以及微生物對(duì)養(yǎng)分的需求程度[4]。(2)通過(guò)調(diào)節(jié)群落結(jié)構(gòu)來(lái)適應(yīng)環(huán)境，如生長(zhǎng)速率較快的(r策略)微生物由于對(duì)養(yǎng)分的需求較高，常呈現(xiàn)低于K-策略微生物的C∶N∶P[5]。因此，微生物群落結(jié)構(gòu)中不同生長(zhǎng)策略微生物的比例變化, 可能導(dǎo)致微生物整體元素計(jì)量比的變化。底物的生物可利用性則決定了微生物分解底物的優(yōu)先順序。在森林生態(tài)系統(tǒng)中, 植物殘?bào)w等新鮮有機(jī)質(zhì)因其化學(xué)組成不同，分解速率也不同。易變或可溶性碳化合物如糖、氨基酸的分解速率高于纖維素和木質(zhì)素[6]。因此, 只有充分考慮底物的元素計(jì)量比和可利用性兩個(gè)方面, 才能準(zhǔn)確判斷底物與微生物之間的相互作用過(guò)程。

亞熱帶地區(qū)由于土壤高度風(fēng)化，導(dǎo)致磷元素有效性較低[7], 但很少有研究探尋磷元素由植物凋落物向微生物的轉(zhuǎn)移過(guò)程。本團(tuán)隊(duì)在前期研究中發(fā)現(xiàn), 針葉樹(shù)種馬尾松凋落葉的C∶P高于闊葉樹(shù)種馬褂木凋落葉(2003∶1 vs. 524∶1), 但是馬尾松林下土壤的微生物生物量碳∶微生物生物量磷 (MBC∶MBP)卻低于馬褂木林下土壤(9.3∶1 vs. 16.2∶1)。有研究認(rèn)為磷礦化與碳耦合性較弱，主要是植物與微生物對(duì)磷的需求驅(qū)動(dòng)了磷酸脂酶的產(chǎn)生以及有機(jī)磷的礦化[8]，但也有一些研究表明磷酸化有機(jī)物同時(shí)含有碳，磷礦化也可能與碳需求有關(guān)，尤其是在碳限制的土壤中[9]。為揭示不同凋落葉對(duì)馬尾松林下土壤微生物吸收同化碳、磷元素的影響以及碳、磷元素吸收是否存在耦合,將馬褂木的凋落葉和馬尾松的凋落葉分別加入到馬尾松林下土壤中, 進(jìn)行為期60天的培養(yǎng)試驗(yàn), 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)土壤的養(yǎng)分含量、微生物生物量、酶活性及其計(jì)量比, 并用高通量測(cè)序技術(shù)分析了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化，以期為深入了解底物和微生物的關(guān)系提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

研究區(qū)域位于福建省三明市莘口鎮(zhèn)格氏栲自然保護(hù)區(qū)(26°11′N, 117°28′E)，地貌以低丘陵為主, 平均海拔300 m。本區(qū)域?qū)儆趤啛釒Ъ撅L(fēng)氣候, 年平均氣溫為19.1℃, 年平均降水量 1 749 mm, 年平均蒸發(fā)量 1 585 mm, 相對(duì)濕度 81%。地帶性植被為中亞熱帶常綠闊葉林, 同時(shí)分布有針葉林和針闊混交林, 林下土壤以砂巖發(fā)育的酸性紅壤為主。2012年2月, 在格氏栲自然保護(hù)區(qū)內(nèi)選擇立地條件、經(jīng)營(yíng)歷史相同的一片區(qū)域, 在皆伐和煉山之后種植13種中亞熱帶常見(jiàn)樹(shù)種的2年生實(shí)生苗, 設(shè)立“同質(zhì)園”。同質(zhì)園采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì), 共4個(gè)區(qū)組(每個(gè)區(qū)組均含13種樹(shù)種), 每個(gè)區(qū)組面積0.1 hm2。

1.2 樣品的采集和處理

2019年3月, 分別在同質(zhì)園內(nèi)的馬尾松(Pinusmassoniana)林和馬褂木(LiriodendronChinese)林內(nèi)按照“S”型布設(shè)5個(gè)采樣點(diǎn), 采集林內(nèi)新鮮完整的凋落葉并混勻,每種林分3個(gè)重復(fù)(來(lái)自3個(gè)區(qū)組)。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)于65 ℃將凋落葉烘干、粉碎, 過(guò)0.149 mm篩后分為兩部分。一部分保持每個(gè)重復(fù)(區(qū)組)的獨(dú)立性, 用于養(yǎng)分含量的測(cè)定；另一部分則充分混勻, 用于后面的培養(yǎng)試驗(yàn)。同一時(shí)間, 在馬尾松林內(nèi)的上述5個(gè)取樣點(diǎn)去除地表的枯枝落葉, 用土鉆采集0～10 cm土壤, 混勻后裝入自封袋并立即帶回實(shí)驗(yàn)室；土壤樣品共3個(gè)重復(fù)(來(lái)自3個(gè)區(qū)組)。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)去除土壤樣品中的石礫、動(dòng)植物殘?bào)w等雜質(zhì), 過(guò)2 mm篩后分成兩部分, 一部分作為培養(yǎng)前土壤，用于土壤理化性質(zhì)、微生物生物量、酶活性測(cè)試及細(xì)菌16S rRNA高通量測(cè)序, 另一部分則用于培養(yǎng)試驗(yàn)。

1.3 培養(yǎng)試驗(yàn)

稱取相當(dāng)于100 g干重的馬尾松林下土壤于500 mL培養(yǎng)瓶中, 調(diào)節(jié)土壤含水率為飽和含水率的60%, 用保鮮膜將瓶口密封, 于25℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)培養(yǎng)15天, 以使瓶?jī)?nèi)土壤條件更加平衡；期間每隔2天補(bǔ)充一次水分, 每次加水前稱量培養(yǎng)瓶的質(zhì)量，從質(zhì)量損失得知土壤失水率不超過(guò)2%。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后, 參考Rosinger等[10]的方法, 按照每克土添加8 mg植物碳的比例(此添加量目的是突顯凋落物的影響), 將烘干粉碎的馬尾松凋落葉和馬褂木凋落葉分別添加到上述培養(yǎng)瓶中, 使葉片和土壤充分混勻, 保持土壤含水率為60%, 于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)正式培養(yǎng)60天。試驗(yàn)共設(shè)2種處理(處理1: 添加馬尾松凋落葉的土壤; 處理2: 添加馬褂木凋落葉的土壤，由于本實(shí)驗(yàn)的主要目的是研究元素從凋落葉向土壤微生物的轉(zhuǎn)移過(guò)程，比較添加不同凋落葉對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與代謝的影響，因此未設(shè)置裸土對(duì)照，添加馬尾松凋落葉的馬尾松土壤存在于自然條件下，可以視為是另一處理的對(duì)照), 每種處理包含3個(gè)重復(fù)(土壤來(lái)自3個(gè)不同的區(qū)組), 每個(gè)重復(fù)又包含4個(gè)培養(yǎng)瓶(分別用于在第7、15、30、60天進(jìn)行破壞性取樣，測(cè)試土壤理化性質(zhì)、微生物生物量和酶活性，并對(duì)第60天培養(yǎng)樣品進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA高通量測(cè)序)。

1.4 土壤理化性質(zhì)的測(cè)定

土壤pH采用CHN868型pH計(jì)測(cè)定, 水土比為2.5∶1(V∶W)。土壤含水率采用烘干法測(cè)定。土壤有機(jī)碳(SOC)和土壤總氮(STN)采用碳氮元素分析儀(Elementar Vario EL III, Elementar,German)測(cè)定。土壤總磷(STP)用HClO4-H2SO4高溫消煮后提取, 并用連續(xù)流動(dòng)分析儀(Skalar San++, Skalar, Netherlands)測(cè)定。土壤銨態(tài)氮(NH4+-N)和硝態(tài)氮(NO3--N)由KCl溶液浸提, 土壤速效磷(Available P)用M3浸提法提取[11], 然后在連續(xù)流動(dòng)分析儀上測(cè)定。

1.5 土壤微生物生物量碳(MBC)、磷(MBP)和酶活性的測(cè)定

取兩份等重量土壤樣品, 一份用CHCl3熏蒸,另一份不熏蒸, 隨后用0.5 mol·L-1的K2SO4溶液浸提樣品中的有機(jī)碳[12]。MBC=(CF-CNF)/KEC,式中CF代表K2SO4溶液浸提熏蒸樣品后的有機(jī)碳濃度, CNF代表K2SO4溶液浸提未熏蒸樣品后的有機(jī)碳濃度, KEC是浸提系數(shù), 取值0.45。MBP則采用CHCl3熏蒸-NaHCO3浸提法測(cè)定[13]。MBP=(PF-PNF)/KP,式中PF代表NaHCO3溶液浸提熏蒸樣品的磷濃度, PNF代表NaHCO3溶液浸提未熏蒸樣品的磷濃度, KP是浸提系數(shù), 取值0.4。

本研究主要關(guān)注碳循環(huán)相關(guān)的兩種土壤酶βG (β-1,4-glucosidase)和CBH (Cellobiohydrolase), 以及磷循環(huán)相關(guān)的酶ACP (Acid Phosphomonoesterase)。其中測(cè)定βG時(shí)所用底物是4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷, CBH的底物是4-甲基傘形酮-β-D-纖維素二糖苷, ACP的底物是4-甲基傘形酮-磷酸酯。用多功能酶標(biāo)儀(SpetraMax M5, Molecular Devices, Sunnyvale, USA)測(cè)定熒光度來(lái)確定酶活性[14]。

1.6 細(xì)菌 16S rRNA 基因測(cè)序及生物信息學(xué)分析

使用OMEGA M5635-02 Soil DNA Kit試劑盒提取土壤DNA，NanoDrop NC-2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific, Wilmington, DE, 美國(guó))測(cè)定DNA的質(zhì)量，利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量，使用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì)細(xì)菌V3-V4高變域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性15 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，共25個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，反應(yīng)結(jié)束，產(chǎn)物混勻后通過(guò)2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。擴(kuò)增完畢后采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測(cè)序文庫(kù)，采用Illumina NovaSeq平臺(tái)對(duì)DNA片段進(jìn)行雙端(Paired-end)測(cè)序。對(duì)比 Silva (Release119, http://www.arb-silva.de) 16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，采用 RDP Classifier( http://rdp.Cme.msu.edu/) 貝葉斯算法對(duì) 97%相似水平的 OTU 代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并在各個(gè)分類水平上統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成。土壤微生物總DNA提取和測(cè)序服務(wù)委托上海派森諾生物科技有限公司完成。

1.7 數(shù)據(jù)處理

在SPSS 20.0軟件中, 采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較同一時(shí)間點(diǎn)的土壤微生物量、有效磷含量、酶活性等指標(biāo)在不同處理之間的差異顯著性(a=0.05)。酶活性與MBC的比值被當(dāng)作酶效率[15]。以處理為組間因素(含兩個(gè)水平), 以培養(yǎng)時(shí)間為組內(nèi)因素(含第7、15、30、60天4個(gè)水平), 進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析, 以檢驗(yàn)凋落葉類型、時(shí)間及其交互作用對(duì)微生物量、酶活性、酶效率、酶計(jì)量比等指標(biāo)的影響。主成分分析(PCA)及冗余分析(RDA)由Canoco 5.12來(lái)實(shí)現(xiàn), 分析結(jié)果采用二型標(biāo)尺繪圖以展示變量之間的相關(guān)性[16]。其余圖用OriginPro 9.0繪制。

2 結(jié)果

2.1 土壤基本理化性質(zhì)，微生物生物量碳、磷含量, 酶活性以及凋落葉元素含量

用于培養(yǎng)試驗(yàn)的馬尾松林下土壤為酸性紅壤(pH=4.4±0.1, 平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,n=3), 野外原位含水率為33.1±2.0%。土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、有效磷含量分別為33.16±1.89、4.34±1.13、2.43±0.36 (mg·kg-1, 平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,n=3)，土壤碳、氮、磷含量較低(表1)。本研究所添加的兩種凋落葉的元素含量明顯不同, 馬尾松凋落葉的碳含量顯著高于馬褂木凋落葉, 而氮、磷含量則顯著低于馬褂木凋落葉,因此馬尾松凋落葉的C∶N和C∶P均顯著高于馬褂木凋落葉(表1)。

表1 培養(yǎng)試驗(yàn)所添加的兩種凋落葉的元素含量及其計(jì)量比Table 1 Element contents and stoichiometry of leaf litters and soils used in the incubation experiments

2.2 培養(yǎng)過(guò)程中土壤微生物生物量碳、磷及其計(jì)量比的變化

由圖1可見(jiàn), 在60天培養(yǎng)期內(nèi), T1土壤MBC在第15天出現(xiàn)大幅上升，之后在第30天、60天逐漸回落，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì), T2土壤MBC在第7天即迅速上升，第15天回落，第30天再次上升，第60天又回落，呈先上升后下降、然后再次上升下降的模式。在第15天, T1的MBC顯著高于T2, 其余3個(gè)時(shí)間點(diǎn)T1的MBC顯著低于T2。在每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)兩種處理的土壤MBP并無(wú)顯著差異(圖1)。重復(fù)測(cè)量方差分析顯示，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)MBC和MBP均有顯著影響，但是處理僅對(duì)MBC有顯著影響, 對(duì)MBP沒(méi)有顯著影響(表3)。兩種處理的MBC∶MBP隨時(shí)間的變化模式與MBC的變化模式相似(圖1)。培養(yǎng)時(shí)間對(duì)MBC∶MBP有顯著影響, 第7天和15天的MBC∶MBP顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)，但處理對(duì)MBC∶MBP無(wú)顯著影響(表3)。

表3 土壤微生物量、有效磷和酶活性隨時(shí)間變化的重復(fù)測(cè)量方差分析Table 3 Repeated measures ANOVA of changes in soil microbial biomass,available P and enzyme activities with time

2.3 培養(yǎng)過(guò)程中土壤酶活性的變化

培養(yǎng)過(guò)程中T1的土壤酶活性整體上要低于T2(圖2)。在培養(yǎng)的前30天, T2的土壤βG活性始終顯著高于T1。在培養(yǎng)的第7、30和60天, T2的土壤CBH活性顯著高于T1。兩種處理的ACP活性在凋落葉添加后的第7天最高, 接下來(lái)在第30天呈現(xiàn)明顯的下降后在第60天重新回升。重復(fù)測(cè)量方差分析顯示, 處理對(duì)βG、CBH、ACP均有顯著影響, 但是對(duì)βG∶MBC和ACP∶MBC這兩種酶效率沒(méi)有顯著影響(表3)。

2.4 微生物元素計(jì)量比、酶效率、酶計(jì)量比之間的冗余分析

以酶效率、單位質(zhì)量的MBC所擁有的有效磷(AvaiP∶MBC)和單位質(zhì)量的MBP所擁有的有效磷(AvaiP∶MBP)為解釋變量, 以MBC∶MBP、βG∶ACP和CBH∶ACP為響應(yīng)變量，進(jìn)行冗余分析, 發(fā)現(xiàn)5個(gè)解釋變量的貢獻(xiàn)都達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。如圖3所示, 酶計(jì)量比對(duì)第一軸的貢獻(xiàn)率較大, 而微生物的元素計(jì)量比對(duì)第二軸的貢獻(xiàn)率較大。前兩個(gè)主軸共解釋了MBC∶MBP、βG∶ACP和CBH∶ACP變異的81.08%、71.13%和82.00%。βG∶MBC與CBH∶MBC (r=0.50,P=0.04)、ACP∶MBC(r=0.63,P<0.001)之間是顯著正相關(guān)關(guān)系。ACP的酶效率和AvaiP∶MBC之間是極顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.80,P<0.001)。MBC∶MBP與βG∶ACP (r=-0.39,P=0.03)、βG∶MBC (r=-0.39,P=0.03)之間呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系, MBC∶MBP與AvaiP∶MBP呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.66,P<0.001)。

2.5 細(xì)菌群落豐度和結(jié)構(gòu)差異

圖4為屬水平上的細(xì)菌分類。將平均豐度低于1.5%的部分合并為其他，部分細(xì)菌屬于分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分類學(xué)譜系的中間等級(jí)，沒(méi)有科學(xué)名稱，以norank表示，部分屬于未培養(yǎng)細(xì)菌，以u(píng)ncultured 表示。在第0天土壤中，酸桿菌科中一種未培養(yǎng)屬細(xì)菌相對(duì)豐度最高(11.3%)，培養(yǎng)第60天的T1土壤中該屬細(xì)菌相對(duì)豐度也最高(7.2%)，但其比例有所下降。而培養(yǎng)第60天的T2土壤中相對(duì)豐度最高的是Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia屬細(xì)菌(變形菌門(mén))，相對(duì)豐度為11.3%。以細(xì)菌群落屬水平數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，第0天和培養(yǎng)60天后的T1和T2土壤明顯分開(kāi)，表明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。第一主成分(PC1)解釋了細(xì)菌群落變化的52.95%，第二主成分(PC2)解釋了細(xì)菌群落變化的24.43%，兩個(gè)主成分共解釋了77.38%的變異。與T2相關(guān)性較強(qiáng)的是變形菌門(mén)伯克氏菌科Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia屬細(xì)菌以及放線菌門(mén)的熱酸菌屬。與第0天土壤相關(guān)性較強(qiáng)的是放線菌門(mén)的鏈霉菌屬。

3 討論

已有的研究大多從溫室氣體排放的角度去研究凋落物添加對(duì)土壤微生物生物量、CO2排放的影響[17], 很少有研究關(guān)注凋落物添加后土壤微生物元素計(jì)量比和酶計(jì)量比(尤其是C∶P)的變化。本研究將馬尾松凋落葉和馬褂木凋落葉添加到馬尾松林下土壤中, 以檢驗(yàn)底物的碳、磷含量對(duì)土壤MBC、MBP和相關(guān)酶活性的影響。

3.1 凋落物添加對(duì)土壤MBC、MBP的影響

在凋落葉添加后的15天之內(nèi), 兩種處理的土壤MBC均達(dá)到了峰值，這是因?yàn)橥寥牢⑸飼?huì)優(yōu)先利用凋落葉中的新鮮有機(jī)質(zhì), 并迅速增加土壤的微生物量[18]。Shahbaz等[17]將小麥的葉、莖、根的殘?bào)w輸入到土壤中, 發(fā)現(xiàn)在前15天內(nèi)MBC迅速增加, 增加比例最高可達(dá)85%, 且增加的MBC主要來(lái)自新鮮有機(jī)質(zhì)。碳元素既是提供能量的元素, 也是微生物體內(nèi)含量最多的元素, 因此是微生物需求量最大的元素。G?ransson等[19]發(fā)現(xiàn), 冰川覆蓋消退后最能限制土壤細(xì)菌生長(zhǎng)的元素是碳元素。Rosinger等[10]的研究也指出, 在草地和森林的底層土壤中, 碳元素是限制微生物生長(zhǎng)和呼吸的主要元素。本研究所用的土壤采自造林僅7年的馬尾松林下土壤, 與成熟的馬尾松林相比[20], 其SOC (15.81 vs.25.16 g C·kg-1soil)和MBC (257.30 vs.385.74 mg MBC·kg-1soil)含量較低, 因此土壤微生物更加處于碳限制的狀態(tài), 對(duì)凋落葉添加的響應(yīng)更敏感。兩種處理的MBC在到達(dá)峰值后隨即下降(圖1), 這一現(xiàn)象與已有的研究相似, 這標(biāo)志著15天之后凋落葉中的易利用碳已被消耗完畢, 同時(shí)微生物分解SOM的比重開(kāi)始加大[21]。

然而, 盡管兩種處理所添加的碳的數(shù)量是一樣的(均為8 mg C·g-1soil), 但T2的土壤MBC顯著高于T1(圖1, 表3), 這說(shuō)明底物有機(jī)質(zhì)所含碳的數(shù)量, 并不是決定土壤MBC的唯一因素。馬褂木凋落葉添加后土壤的βG和CBH酶活性總體上要高于添加馬尾松凋落葉的土壤(圖2, 表3), 由于這兩種酶都是用于分解易利用碳的水解酶[4], 所以這表明馬褂木凋落葉比馬尾松凋落葉含有更多的易被微生物利用的碳元素。相對(duì)于總碳, 底物中的易利用碳的數(shù)量是決定MBC的更準(zhǔn)確的指標(biāo)。這與Fontaine等[22]的研究結(jié)論一致, 他們發(fā)現(xiàn)向土壤中添加葡萄糖等易利用碳后, 土壤微生物量會(huì)迅速增加。另外, 添加馬尾松凋落葉的土壤MBC含量直到第15天與對(duì)照土壤相比才有明顯的升高, 而添加馬褂木凋落葉的土壤MBC在第7天即有明顯的升高, 也證明了馬褂木凋落葉所含的易利用碳較多, 更有利于微生物的繁殖生長(zhǎng)[23]。Zhang等[24]發(fā)現(xiàn), 由于針葉樹(shù)種落葉松(Larixgmelinii)的凋落葉的木質(zhì)素∶N高于闊葉樹(shù)種蒙古櫟(Quercusmongolica)的凋落葉, 故前者的分解速率小于后者, 不利于微生物吸收。

MBP對(duì)底物變化的響應(yīng)似乎沒(méi)有MBC敏感, 這表現(xiàn)在: (1)在培養(yǎng)試驗(yàn)的前15天, 兩種處理的MBC即達(dá)到了峰值, 然而直到第30天兩種處理的土壤MBP相比對(duì)照土壤才有明顯的變化(圖1)。(2)盡管兩種凋落葉中的磷含量不同, 但是兩種處理的MBP沒(méi)有顯著差異(表2)。

表2 馬尾松林下土壤微生物生物量碳、磷含量及酶活性Table 2 Soil MBC, MBP and enzyme activities before litters addition

MBC∶MBP隨時(shí)間的變化模式與MBC的變化模式相似(圖1)，這主要源自于MBC對(duì)底物添加更加敏感。時(shí)間對(duì)MBC∶MBP 有顯著影響(表3), 這可能是由土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化引起的。培養(yǎng)結(jié)束后，T2的MBC∶MBP要顯著高于T1(圖1),說(shuō)明盡管馬尾松凋落葉的C∶P顯著高于馬褂木凋落葉, 但試驗(yàn)結(jié)束時(shí)添加馬尾松凋落葉的土壤MBC∶MBP反而低于添加馬褂木凋落葉的土壤，這主要還是因?yàn)轳R褂木凋落葉中易利用碳較多, T2的MBC含量較高,這與本研究在野外原位條件下測(cè)得的馬褂木林下土壤的MBC∶MBP高于馬尾松林下土壤的趨勢(shì)相一致。

3.2 凋落物添加對(duì)土壤ACP酶活性的影響

兩種處理間的酸性磷酸單酯酶(ACP)的活性有顯著差異(表3)。微生物分泌胞外酶是為了獲取相應(yīng)的養(yǎng)分, 因此酶活性與有效性養(yǎng)分濃度之間常呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[4], 這可能是終產(chǎn)物的反饋抑制，也可能是因?yàn)槊负铣珊哪芗毙鐽，微生物只在可利用養(yǎng)分缺乏時(shí)才以犧牲生長(zhǎng)及代謝為代價(jià)來(lái)合成酶。當(dāng)土壤中養(yǎng)分可利用性較高, 微生物獲取這種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)難度較小, 相關(guān)催化酶的活性也會(huì)降低。然而, 本研究卻發(fā)現(xiàn)酸性磷酸單酯酶的酶效率(ACP∶MBC)和AvaiP∶MBC之間是顯著正相關(guān)關(guān)系(圖3), 這說(shuō)明微生物分泌ACP不完全是為了獲取有效磷。二者之間的正相關(guān)關(guān)系可能與碳獲取有關(guān)。Spohn和Kuzyakov[9]通過(guò)室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 對(duì)于磷含量較高的有機(jī)質(zhì), 土壤微生物常把其中的有機(jī)磷分子當(dāng)做碳源, 而微生物為了獲取其中的碳元素, 必須要分泌一些磷酸酶來(lái)斷開(kāi)磷酯鍵以將底物中“多余的”磷脫離下來(lái)。如此一來(lái), ACP活性較高的土壤，其有效磷含量可能也較高。這些“多余的”磷元素將為植物生長(zhǎng)提供養(yǎng)分, 因此植物和微生物之間才形成了互惠互利的關(guān)系。Wang等[25]對(duì)青藏高原海螺溝的土壤進(jìn)行研究也發(fā)現(xiàn), 微生物在礦化有機(jī)碳的同時(shí)會(huì)將多余的磷酸根釋放出來(lái), 導(dǎo)致有效磷的積累。本研究中, ACP活性的最大值出現(xiàn)在凋落葉添加后的第7天, 此時(shí)正是MBC的升高期，而MBP變化不明顯，直到第30天才有明顯升高, 這也表明此時(shí)較高的ACP活性并非為了獲取磷，很可能就是為了輔助獲取新進(jìn)凋落葉中的碳。

3.3 凋落物添加對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)細(xì)菌16S rRNA高通量測(cè)序得到的屬水平分類的主成分分析中第0天和培養(yǎng)60天后的T1和T2土壤明顯分開(kāi)，表明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，培養(yǎng)第60天的T2土壤與第0天土壤及培養(yǎng)第60天的T1土壤沿PC1軸分開(kāi)，而培養(yǎng)第60天的T1土壤與第0天的土壤沿PC2軸分開(kāi)，說(shuō)明T2土壤較T1土壤的細(xì)菌群落發(fā)生了更大的改變。培養(yǎng)第60天的T2土壤變形菌豐度為優(yōu)勢(shì)類群。研究表明大多數(shù)變形菌是嗜營(yíng)養(yǎng)菌，添加易利用碳能促使其快速生長(zhǎng)繁殖，并分泌βG酶來(lái)分解易利用碳[26],這與T2的MBC含量以及βG高于T1一致,而酸桿菌通常被認(rèn)為是寡營(yíng)養(yǎng)菌，可分解難分解的碳源[41]。在本研究中，第0天土壤和培養(yǎng)第60天的T1土壤酸桿菌是豐度最高的優(yōu)勢(shì)類群，表明這兩種土壤的易利用碳含量較少。

3.4 微生物元素計(jì)量比和酶計(jì)量比的關(guān)系

探尋微生物元素計(jì)量比和酶計(jì)量比的關(guān)系, 可以更深入地揭示酶活性與微生物的養(yǎng)分需求之間的關(guān)系。本研究中, MBC∶MBP與βG∶MBC呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系, 即MBC∶MBP較低時(shí)單位質(zhì)量的微生物所分泌的βG會(huì)更多一些, 以獲取更多的碳。MBC∶MBP與βG∶ACP也呈顯著負(fù)相關(guān)，即MBC∶MBP較低時(shí), βG的相對(duì)活性就會(huì)升高。所以酶計(jì)量比能夠準(zhǔn)確地反映微生物對(duì)不同元素的需求狀況。冗余分析中, AvaiP∶MBP是對(duì)MBC∶MBP解釋率最高的因子, 且二者是正相關(guān)關(guān)系(圖3), 這說(shuō)明微生物在獲取碳的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生較多的有效磷, 這些有效磷并非全部被微生物所吸收而轉(zhuǎn)化為MBP, 才使得AvaiP∶MBP也升高，這與前述的微生物分泌ACP是為了輔助碳獲取的結(jié)論相吻合。AvaiP∶MBP與MBC∶MBP之間的正相關(guān)關(guān)系, 以及βG的酶效率與CBH、ACP的酶效率之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系(圖3), 都說(shuō)明了獲取碳和磷的兩類酶之間的協(xié)同性以及碳磷循環(huán)的耦合性。

4 結(jié)論

凋落葉添加后的前15天顯著提高了土壤MBC的含量，隨著凋落葉中易利用碳的耗竭, MBC的含量隨即下降。由于馬褂木凋落葉含有的易利用碳多于馬尾松凋落葉, 添加馬褂木凋落葉的土壤MBC、βG和CBH活性均顯著高于添加馬尾松凋落葉的土壤。兩種處理的MBP沒(méi)有顯著差異, 但是兩種處理的酸性磷酸單酯酶的活性有顯著差異, 加之ACP的酶效率與AvaiP∶MBC正相關(guān), 這些現(xiàn)象都表明微生物分泌ACP不單單是為了獲取有效磷, 很可能也是為了輔助獲取碳元素。時(shí)間對(duì)MBC∶MBP有顯著影響, 培養(yǎng)初期的比值大于后期, 這種變化可能來(lái)自于微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。高通量測(cè)序表明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變，添加馬褂木凋落葉的土壤嗜營(yíng)養(yǎng)變形菌含量增加，成為優(yōu)勢(shì)類群。MBC∶MBP與βG∶ACP、βG∶MBC之間的負(fù)相關(guān)關(guān)系, 以及MBC∶MBP與AvaiP∶MBP之間的正相關(guān)關(guān)系, 則說(shuō)明酶計(jì)量比能夠準(zhǔn)確地反應(yīng)微生物對(duì)不同元素的需求狀況以及碳磷循環(huán)具有高度的耦合性。