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        飼料中添加凝結(jié)芽孢桿菌的評估

        2022-06-30 04:13:08柳成東吳有林肖俊峰肖麗萍梁世仁丁能水
        豬業(yè)科學(xué) 2022年6期
        關(guān)鍵詞:實(shí)驗(yàn)

        柳成東 ,吳有林 ,肖俊峰 ,肖麗萍 ,蔡 冬 ,梁世仁 ,丁能水 ,4

        (1.福建傲農(nóng)生物科技集團(tuán)股份有限公司,福建 漳州 363000;2.福建省生豬營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 漳州 363000;3.福建傲農(nóng)生物制藥有限公司,福建 漳州 363000;4.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)豬遺傳改良與養(yǎng)殖技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌330045)

        近年來,隨著禁止在飼料中添加促生長藥物飼料添加劑的研究,對飼用益生菌的研究越來越受到飼料行業(yè)的關(guān)注。凝結(jié)芽孢桿菌作為唯一1 株具有芽孢體,能夠分泌乳酸的飼用益生菌,成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。已有研究表明,凝結(jié)芽孢桿菌能夠調(diào)節(jié)畜禽腸道菌群,改善畜禽生長性能。與此同時,也有研究表明凝結(jié)芽孢桿菌與其他商業(yè)益生菌組合飼喂效果低于單一飼喂凝結(jié)芽孢桿菌的效果。因此,如何科學(xué)、合理地評估凝結(jié)芽孢桿菌在飼料添加劑中的運(yùn)用效果,需要建立一套較為合理、有效體外評估體系。

        一般而言,飼用益生菌在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用,往往面臨飼料加工過程中高溫,畜禽腸道酸性環(huán)境,及胃中膽鹽的挑戰(zhàn)。同時,抑菌性能作為益生菌發(fā)揮益生功能的重要指標(biāo),對抑制畜禽腸道有害菌,以及飼料源中的有害菌—金黃色葡萄球菌有重要的作用。此外,通過抑菌效果能夠有效評估益生菌之間的頡頏作用,進(jìn)而選擇合理的有效組合方案。飼用益生菌應(yīng)用于畜禽體內(nèi)時,應(yīng)該注意益生菌在發(fā)揮益生菌功能,更應(yīng)該關(guān)注益生菌是否會對畜禽體內(nèi)供氧和提供養(yǎng)料的紅細(xì)胞造成損傷。據(jù)此,文章以凝結(jié)芽孢桿菌為研究對象,通過體外評估的方法,說明飼用益生菌能夠作為飼料添加劑在畜禽養(yǎng)殖、飼料和飼料添加劑生產(chǎn)企業(yè)中的運(yùn)用提供體外評估思路。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        凝結(jié)芽孢桿菌(YNAU 3127)選自云南當(dāng)?shù)仄贩N“大河豬”腸道中分離、純化的菌株,經(jīng)溶血實(shí)驗(yàn)評估后,表明該株凝結(jié)芽孢桿菌具有可靠的安全性;在保證對畜禽本身無損傷的基礎(chǔ)上評估其耐受性和抑菌性能。

        指 示 菌: 大 腸 桿 菌K88(Escherichia coliCGMCC1.2385)、雞白痢沙門氏菌(Salmonella pullorumBNCC124693); 金 黃 色葡萄球菌(Staphylococcus aureusBNCC186335);枯 草 芽 孢 桿 菌(Bacillus subtilisATCC PTA-6737)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformisbio-58806)、丁酸梭菌(Clostridium b u t y r i c u mB N C C 3 3 7 2 3 9)、屎腸球菌(Enterococcus faeciumbio-67122)、糞腸球菌(Enterococcus faecalisBNCC192631)、 酵 母 菌(Candida utiliBNCC336517)。以上菌株均購買自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司和北京百歐博偉生物科技有限公司。

        1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

        MRS 培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10 g、酵母粉5 g、牛肉膏5 g、葡萄糖5 g(無需分開滅菌)、氯化鈉(NaCl)2.5 g、氯化鈣(CaCl2)0.15 g、一水硫酸錳(MnSO4·H2O)0.1 g、番茄粉0.5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL。用于凝結(jié)芽孢桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌和酵母菌的培養(yǎng),以及凝結(jié)芽孢桿菌對大腸桿菌K88、雞白痢沙門氏菌和金黃色葡萄球菌混合抑菌的液體培養(yǎng)基;和凝結(jié)芽孢桿菌對丁酸梭菌、屎腸球菌、糞腸球菌、屎腸球菌和酵母菌的牛津杯法抑菌涂布培養(yǎng)基。

        RCM 培養(yǎng)基(g/L):酵母浸膏0.3 g、牛肉膏1 g、胰蛋白胨1 g、葡萄糖0.5 g、可溶性淀粉0.1 g、NaCl 0.5 g、三水合乙酸鈉0.3 g、半胱氨酸鹽酸鹽0.05 g,用于丁酸梭菌的培養(yǎng)。

        LB 培養(yǎng)基(g/L):酵母膏5 g、胰蛋白胨10 g、Nacl 10 g、蒸餾水1 000 mL。用于大腸桿菌K88、雞白痢沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)。

        血瓊脂培養(yǎng)基:在MRS 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入10%的無菌脫脂豬血。

        分析試劑:豬膽鹽、鹽酸(HCl)、氫氧化鈉(NaOH)。

        1.3 溶血實(shí)驗(yàn)的評估實(shí)驗(yàn)步驟

        β- 溶血實(shí)驗(yàn)設(shè)計如下:將大腸桿菌K88 具有溶血現(xiàn)象作為對照組,對比評估凝結(jié)芽孢桿菌(YNAU 3127)是否具有溶血現(xiàn)象。操作如下:將血瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌二分塑料培養(yǎng)皿(購買于海門博大實(shí)驗(yàn)器材廠),冷卻、凝固后在培養(yǎng)皿左右兩邊各放置一個牛津杯,并同時各加入100 μL 的ETEC K88菌液和凝結(jié)芽孢桿菌菌液,并置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h 后,通過觀察是否出現(xiàn)溶血圈,驗(yàn)證該株凝結(jié)芽孢桿菌的安全性。

        1.4 凝結(jié)芽孢桿菌耐受性實(shí)驗(yàn)步驟

        1.4.1 凝結(jié)芽孢桿菌耐高溫實(shí)驗(yàn)步驟

        將凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)液按2%的接種量接種到MRS 培養(yǎng)基中;分別取5 mL 到規(guī)格為10 mL 的無菌EP 管 中,置 于70 ℃、80 ℃和90℃的水浴鍋中處理10 min 后,采用平板計數(shù)法檢測菌落個數(shù)。

        1.4.2 凝結(jié)芽孢桿菌耐酸實(shí)驗(yàn)步驟

        將配制MRS 液體培養(yǎng)基,分裝到250 mL 的三角錐瓶中,每瓶分裝100 mL;分裝后用70% HCl和30% NaOH 對其培養(yǎng)基進(jìn)行酸堿調(diào)定,分別將pH 調(diào)到1、2、3、4、5、6、7,調(diào)完后121℃滅菌30 min。將凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)液按2%的接種量接種到MRS 培養(yǎng)基中,置于氣浴恒溫振蕩器(37℃、180 r/min)培養(yǎng)后,培養(yǎng)24 h,計數(shù)。

        1.4.3 凝結(jié)芽孢桿菌耐膽鹽實(shí)驗(yàn)步驟

        分別稱取一定量的膽鹽加入到裝 有100 mL 的MRS 培 養(yǎng) 液,配制 成 含0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%、0.1%、0.2%、0.3%濃度的MRS 培養(yǎng)液后,121℃滅菌30 min;待冷卻后,將凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)液按2%的接種量接種到MRS 培養(yǎng)液中,置于搖床(37℃、180 r/min)24 h 培養(yǎng)后,計數(shù)。

        1.5 抑菌實(shí)驗(yàn)步驟

        1.5.1 共培養(yǎng)抑菌法

        分別接種200 μL 的凝結(jié)芽孢桿菌和200 μL 的大腸桿菌K88、雞白痢沙門氏菌和金黃色葡萄球菌到200 mL 的MRS 培養(yǎng)基中,置于搖床(37℃、180 r/min)24 h 培養(yǎng)后,分別采用平板計數(shù)大腸桿菌K88、雞白痢沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的菌落數(shù)。

        1.5.2 牛津杯法抑菌法

        采用經(jīng)典的牛津杯法評估凝結(jié)芽孢桿菌對商業(yè)益生菌的抑菌效果。具體操作如下:將凝結(jié)芽孢桿菌和商業(yè)益生菌分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,置于搖床(37 ℃、180 r/min)24 h 培養(yǎng)后;取200 μL 稀釋到10-2的商業(yè)益生菌的菌液均勻涂布到MRS 培養(yǎng)基上,涂干后,在培養(yǎng)基上放置一個牛津杯,加入100 μL的凝結(jié)芽孢桿菌菌液。然后,將培養(yǎng)皿放置37.5℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 之后測定抑菌圈直徑(diameter of inhibition zone,DIZ)。每次操作,每個指示菌涂3 個培養(yǎng)皿(3 次平行測定),統(tǒng)計測定結(jié)果的平均值。

        2 結(jié)果

        2.1 凝結(jié)芽孢桿菌安全性評估實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        由圖1 可見,在牛津杯中加入大腸桿菌K88 菌液的血瓊脂培養(yǎng)基平板上,出現(xiàn)了明顯的溶血圈(R)。在牛津杯中加入凝結(jié)芽孢桿菌的血瓊脂培養(yǎng)基平板上,無溶血圈(L),判定該株凝結(jié)芽孢桿菌對細(xì)胞的無破壞作用。

        圖1 凝結(jié)芽孢桿菌溶血性實(shí)驗(yàn)評估(β-溶血實(shí)驗(yàn))

        2.2 凝結(jié)芽孢桿菌耐高溫性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        由表1 結(jié)果可知,該株凝結(jié)芽孢桿菌在70℃的高溫下存活率高達(dá)90.5%,在高溫90 ℃下,菌株存活率仍然高達(dá)51.2%,說明該株凝結(jié)芽孢桿菌在高溫下存活良好。

        表1 凝結(jié)芽孢桿菌耐高溫的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 %

        2.3 凝結(jié)芽孢桿菌耐酸性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        由表2 結(jié)果顯示,該株凝結(jié)芽孢桿菌在pH=3 的酸性環(huán)境下,存活率能夠達(dá)到14.25%。相反,當(dāng)pH=6 的微酸性環(huán)境下,該株凝結(jié)芽孢桿菌存活率為155%。

        表2 凝結(jié)芽孢桿菌耐酸性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 %

        2.4 凝結(jié)芽孢桿菌耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果

        根據(jù)表3 結(jié)果可知,隨著膽鹽濃度的升高,該芽孢桿菌的存活率略有下降。當(dāng)膽鹽濃度達(dá)到0.3%,凝結(jié)芽孢桿菌的存活率仍然在70.0%,表明該菌株對膽鹽有很強(qiáng)的耐受性。

        2.5 凝結(jié)芽孢桿菌對有害菌的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        由表4 結(jié)果可知,凝結(jié)芽孢桿菌對雞白痢沙門氏菌的抑制作用最強(qiáng);同時,對大腸桿菌K88 和金黃色葡萄球菌也有較好的抑制作用。

        表4 凝結(jié)芽孢桿菌對有害菌的抑菌性能的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        2.6 凝結(jié)芽孢桿菌對商業(yè)益生菌的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        由表5 結(jié)果可知,凝結(jié)芽孢桿菌對不同商業(yè)益生菌之間抑菌效果差異顯著(P<0.05);其次,凝結(jié)芽孢桿菌對丁酸梭菌的抑制效果最佳。但對糞腸球菌和酵母菌無抑制效果。

        表5 凝結(jié)芽孢桿菌對商業(yè)益生菌的抑菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 mm

        3 討論

        3.1 凝結(jié)芽孢桿菌溶血實(shí)驗(yàn)安全評估

        β-溶血實(shí)驗(yàn)常用于體外評估菌株毒性及所產(chǎn)毒素對細(xì)胞及膜結(jié)構(gòu)的破壞作用。因此,本研究運(yùn)用β-溶血實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證凝結(jié)芽孢桿菌是否對細(xì)胞的有破壞效果。圖1 顯示凝結(jié)芽孢桿菌對紅細(xì)胞無破壞作用,表明凝結(jié)芽孢桿菌無毒性和不產(chǎn)細(xì)菌毒素,可安全應(yīng)用于飼料添加劑和畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中。

        3.2 凝結(jié)芽孢桿菌耐受性的評估影響

        益生菌的耐受性能是依據(jù)實(shí)際生產(chǎn)過程中高溫制粒,畜禽腸道酸性環(huán)境和膽鹽破壞而進(jìn)行的評估的指標(biāo)。由耐受結(jié)果可知,該株凝結(jié)芽孢桿菌具有良好的耐高溫、耐酸和耐膽鹽的性能(表1、表2 和表3),這一結(jié)果與前人報道一致。這也驗(yàn)證了飼用凝結(jié)芽孢桿菌在飼料生產(chǎn)環(huán)節(jié)中和畜禽腸道環(huán)境中能夠降低損耗。

        表3 凝結(jié)芽孢桿菌豬膽鹽的耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果 %

        3.3 凝結(jié)芽孢桿菌對有害菌的抑制作用

        大腸桿菌K88、雞白痢沙門氏菌是引起豬只和雞腹瀉的主要致病菌,導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降。同時,金黃色葡萄球菌是飼料及飼料原料中主要污染菌,常常會導(dǎo)致動物腸道和肝臟受到毒素的破壞,導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降和死亡率增加。本研究顯示,凝結(jié)芽孢桿菌對大腸桿菌K88、雞白痢沙門氏菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌效果,這個結(jié)果與以往的報道基本一致。這說明,該株凝結(jié)芽孢桿菌能夠在飼料和畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中運(yùn)用,提高畜禽生長性能和對飼料有一定的保護(hù)作用。

        3.4 凝結(jié)芽孢桿菌對商業(yè)益生菌的抑制作用

        飼用益生菌添加符合我國實(shí)際34 種飼料添加劑的使用規(guī)范(《飼料添加劑品種目錄》,2020)。生產(chǎn)中常常以添加單一菌和組合菌的方式改善畜禽生長性能,滿足我國在研發(fā)禁用促生長藥物飼料添加劑的需求。本研究表明,該株凝結(jié)芽孢桿菌對枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、丁酸梭菌和屎腸球菌具有抑菌效果;但對糞腸球菌和酵母菌無抑制作用,這一結(jié)果與前人報道一致。本實(shí)驗(yàn)研究首次發(fā)現(xiàn),凝結(jié)芽孢桿菌對益生菌丁酸梭菌也有一定的抑制作用。以上結(jié)果顯示,凝結(jié)芽孢桿菌在與枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、丁酸梭菌、屎腸球菌組合使用過程需謹(jǐn)慎考慮。

        4 結(jié)論

        本研究考慮飼用益生菌凝結(jié)芽孢桿菌在運(yùn)用過程中,首先要滿足菌株的安全性,進(jìn)而對飼用凝結(jié)芽孢桿菌進(jìn)行耐受性能測定,得出其符合飼用益生菌凝結(jié)芽孢桿菌在飼料工藝中和畜禽腸道中的運(yùn)用依據(jù);同時,驗(yàn)證凝結(jié)芽孢桿菌的抑菌性能。這樣能夠更好地提供凝結(jié)芽孢桿菌在飼料和畜禽養(yǎng)殖中,以及飼料添加劑中益生菌之間的組合運(yùn)用研究依據(jù)。

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