柳成東 ，吳有林 ，肖俊峰 ，肖麗萍 ，蔡 冬 ，梁世仁 ，丁能水 ，4

（1.福建傲農(nóng)生物科技集團(tuán)股份有限公司，福建 漳州 363000；2.福建省生豬營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 漳州 363000；3.福建傲農(nóng)生物制藥有限公司，福建 漳州 363000；4.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)豬遺傳改良與養(yǎng)殖技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌330045）

近年來，隨著禁止在飼料中添加促生長藥物飼料添加劑的研究，對飼用益生菌的研究越來越受到飼料行業(yè)的關(guān)注。凝結(jié)芽孢桿菌作為唯一1 株具有芽孢體，能夠分泌乳酸的飼用益生菌，成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。已有研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌能夠調(diào)節(jié)畜禽腸道菌群，改善畜禽生長性能。與此同時，也有研究表明凝結(jié)芽孢桿菌與其他商業(yè)益生菌組合飼喂效果低于單一飼喂凝結(jié)芽孢桿菌的效果。因此，如何科學(xué)、合理地評估凝結(jié)芽孢桿菌在飼料添加劑中的運(yùn)用效果，需要建立一套較為合理、有效體外評估體系。

一般而言，飼用益生菌在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用，往往面臨飼料加工過程中高溫，畜禽腸道酸性環(huán)境，及胃中膽鹽的挑戰(zhàn)。同時，抑菌性能作為益生菌發(fā)揮益生功能的重要指標(biāo)，對抑制畜禽腸道有害菌，以及飼料源中的有害菌—金黃色葡萄球菌有重要的作用。此外，通過抑菌效果能夠有效評估益生菌之間的頡頏作用，進(jìn)而選擇合理的有效組合方案。飼用益生菌應(yīng)用于畜禽體內(nèi)時，應(yīng)該注意益生菌在發(fā)揮益生菌功能，更應(yīng)該關(guān)注益生菌是否會對畜禽體內(nèi)供氧和提供養(yǎng)料的紅細(xì)胞造成損傷。據(jù)此，文章以凝結(jié)芽孢桿菌為研究對象，通過體外評估的方法，說明飼用益生菌能夠作為飼料添加劑在畜禽養(yǎng)殖、飼料和飼料添加劑生產(chǎn)企業(yè)中的運(yùn)用提供體外評估思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

凝結(jié)芽孢桿菌（YNAU 3127）選自云南當(dāng)?shù)仄贩N“大河豬”腸道中分離、純化的菌株，經(jīng)溶血實(shí)驗(yàn)評估后，表明該株凝結(jié)芽孢桿菌具有可靠的安全性；在保證對畜禽本身無損傷的基礎(chǔ)上評估其耐受性和抑菌性能。

指 示 菌： 大 腸 桿 菌K88（Escherichia coliCGMCC1.2385）、雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorumBNCC124693）； 金 黃 色葡萄球菌（Staphylococcus aureusBNCC186335）；枯 草 芽 孢 桿 菌（Bacillus subtilisATCC PTA-6737）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformisbio-58806）、丁酸梭菌（Clostridium b u t y r i c u mB N C C 3 3 7 2 3 9）、屎腸球菌（Enterococcus faeciumbio-67122）、糞腸球菌（Enterococcus faecalisBNCC192631）、 酵 母 菌（Candida utiliBNCC336517）。以上菌株均購買自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司和北京百歐博偉生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

MRS 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、牛肉膏5 g、葡萄糖5 g（無需分開滅菌）、氯化鈉（NaCl）2.5 g、氯化鈣（CaCl2）0.15 g、一水硫酸錳（MnSO4·H2O）0.1 g、番茄粉0.5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL。用于凝結(jié)芽孢桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌和酵母菌的培養(yǎng)，以及凝結(jié)芽孢桿菌對大腸桿菌K88、雞白痢沙門氏菌和金黃色葡萄球菌混合抑菌的液體培養(yǎng)基；和凝結(jié)芽孢桿菌對丁酸梭菌、屎腸球菌、糞腸球菌、屎腸球菌和酵母菌的牛津杯法抑菌涂布培養(yǎng)基。

RCM 培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸膏0.3 g、牛肉膏1 g、胰蛋白胨1 g、葡萄糖0.5 g、可溶性淀粉0.1 g、NaCl 0.5 g、三水合乙酸鈉0.3 g、半胱氨酸鹽酸鹽0.05 g，用于丁酸梭菌的培養(yǎng)。

LB 培養(yǎng)基（g/L）：酵母膏5 g、胰蛋白胨10 g、Nacl 10 g、蒸餾水1 000 mL。用于大腸桿菌K88、雞白痢沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)。

血瓊脂培養(yǎng)基：在MRS 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入10%的無菌脫脂豬血。

分析試劑：豬膽鹽、鹽酸（HCl）、氫氧化鈉（NaOH）。

1.3 溶血實(shí)驗(yàn)的評估實(shí)驗(yàn)步驟

β- 溶血實(shí)驗(yàn)設(shè)計如下：將大腸桿菌K88 具有溶血現(xiàn)象作為對照組，對比評估凝結(jié)芽孢桿菌（YNAU 3127）是否具有溶血現(xiàn)象。操作如下：將血瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌二分塑料培養(yǎng)皿（購買于海門博大實(shí)驗(yàn)器材廠），冷卻、凝固后在培養(yǎng)皿左右兩邊各放置一個牛津杯，并同時各加入100 μL 的ETEC K88菌液和凝結(jié)芽孢桿菌菌液，并置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h 后，通過觀察是否出現(xiàn)溶血圈，驗(yàn)證該株凝結(jié)芽孢桿菌的安全性。

1.4 凝結(jié)芽孢桿菌耐受性實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1 凝結(jié)芽孢桿菌耐高溫實(shí)驗(yàn)步驟

將凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)液按2%的接種量接種到MRS 培養(yǎng)基中；分別取5 mL 到規(guī)格為10 mL 的無菌EP 管 中，置 于70 ℃、80 ℃和90℃的水浴鍋中處理10 min 后，采用平板計數(shù)法檢測菌落個數(shù)。

1.4.2 凝結(jié)芽孢桿菌耐酸實(shí)驗(yàn)步驟

將配制MRS 液體培養(yǎng)基，分裝到250 mL 的三角錐瓶中，每瓶分裝100 mL；分裝后用70% HCl和30% NaOH 對其培養(yǎng)基進(jìn)行酸堿調(diào)定，分別將pH 調(diào)到1、2、3、4、5、6、7，調(diào)完后121℃滅菌30 min。將凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)液按2%的接種量接種到MRS 培養(yǎng)基中，置于氣浴恒溫振蕩器（37℃、180 r/min）培養(yǎng)后，培養(yǎng)24 h，計數(shù)。

1.4.3 凝結(jié)芽孢桿菌耐膽鹽實(shí)驗(yàn)步驟

分別稱取一定量的膽鹽加入到裝 有100 mL 的MRS 培 養(yǎng) 液，配制 成 含0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%、0.1%、0.2%、0.3%濃度的MRS 培養(yǎng)液后，121℃滅菌30 min；待冷卻后，將凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)液按2%的接種量接種到MRS 培養(yǎng)液中，置于搖床（37℃、180 r/min）24 h 培養(yǎng)后，計數(shù)。

1.5 抑菌實(shí)驗(yàn)步驟

1.5.1 共培養(yǎng)抑菌法

分別接種200 μL 的凝結(jié)芽孢桿菌和200 μL 的大腸桿菌K88、雞白痢沙門氏菌和金黃色葡萄球菌到200 mL 的MRS 培養(yǎng)基中，置于搖床（37℃、180 r/min）24 h 培養(yǎng)后，分別采用平板計數(shù)大腸桿菌K88、雞白痢沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的菌落數(shù)。

1.5.2 牛津杯法抑菌法

采用經(jīng)典的牛津杯法評估凝結(jié)芽孢桿菌對商業(yè)益生菌的抑菌效果。具體操作如下：將凝結(jié)芽孢桿菌和商業(yè)益生菌分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于搖床（37 ℃、180 r/min）24 h 培養(yǎng)后；取200 μL 稀釋到10-2的商業(yè)益生菌的菌液均勻涂布到MRS 培養(yǎng)基上，涂干后，在培養(yǎng)基上放置一個牛津杯，加入100 μL的凝結(jié)芽孢桿菌菌液。然后，將培養(yǎng)皿放置37.5℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h， 之后測定抑菌圈直徑（diameter of inhibition zone，DIZ）。每次操作，每個指示菌涂3 個培養(yǎng)皿（3 次平行測定），統(tǒng)計測定結(jié)果的平均值。

2 結(jié)果

2.1 凝結(jié)芽孢桿菌安全性評估實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖1 可見，在牛津杯中加入大腸桿菌K88 菌液的血瓊脂培養(yǎng)基平板上，出現(xiàn)了明顯的溶血圈（R）。在牛津杯中加入凝結(jié)芽孢桿菌的血瓊脂培養(yǎng)基平板上，無溶血圈（L），判定該株凝結(jié)芽孢桿菌對細(xì)胞的無破壞作用。

圖1 凝結(jié)芽孢桿菌溶血性實(shí)驗(yàn)評估（β-溶血實(shí)驗(yàn)）

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌耐高溫性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表1 結(jié)果可知，該株凝結(jié)芽孢桿菌在70℃的高溫下存活率高達(dá)90.5%，在高溫90 ℃下，菌株存活率仍然高達(dá)51.2%，說明該株凝結(jié)芽孢桿菌在高溫下存活良好。

表1 凝結(jié)芽孢桿菌耐高溫的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 %

2.3 凝結(jié)芽孢桿菌耐酸性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2 結(jié)果顯示，該株凝結(jié)芽孢桿菌在pH=3 的酸性環(huán)境下，存活率能夠達(dá)到14.25%。相反，當(dāng)pH=6 的微酸性環(huán)境下，該株凝結(jié)芽孢桿菌存活率為155%。

表2 凝結(jié)芽孢桿菌耐酸性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 %

2.4 凝結(jié)芽孢桿菌耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表3 結(jié)果可知，隨著膽鹽濃度的升高，該芽孢桿菌的存活率略有下降。當(dāng)膽鹽濃度達(dá)到0.3%，凝結(jié)芽孢桿菌的存活率仍然在70.0%，表明該菌株對膽鹽有很強(qiáng)的耐受性。

2.5 凝結(jié)芽孢桿菌對有害菌的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表4 結(jié)果可知，凝結(jié)芽孢桿菌對雞白痢沙門氏菌的抑制作用最強(qiáng)；同時，對大腸桿菌K88 和金黃色葡萄球菌也有較好的抑制作用。

表4 凝結(jié)芽孢桿菌對有害菌的抑菌性能的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 凝結(jié)芽孢桿菌對商業(yè)益生菌的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表5 結(jié)果可知，凝結(jié)芽孢桿菌對不同商業(yè)益生菌之間抑菌效果差異顯著（P＜0.05）；其次，凝結(jié)芽孢桿菌對丁酸梭菌的抑制效果最佳。但對糞腸球菌和酵母菌無抑制效果。

表5 凝結(jié)芽孢桿菌對商業(yè)益生菌的抑菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 mm

3 討論

3.1 凝結(jié)芽孢桿菌溶血實(shí)驗(yàn)安全評估

β-溶血實(shí)驗(yàn)常用于體外評估菌株毒性及所產(chǎn)毒素對細(xì)胞及膜結(jié)構(gòu)的破壞作用。因此，本研究運(yùn)用β-溶血實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證凝結(jié)芽孢桿菌是否對細(xì)胞的有破壞效果。圖1 顯示凝結(jié)芽孢桿菌對紅細(xì)胞無破壞作用，表明凝結(jié)芽孢桿菌無毒性和不產(chǎn)細(xì)菌毒素，可安全應(yīng)用于飼料添加劑和畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中。

3.2 凝結(jié)芽孢桿菌耐受性的評估影響

益生菌的耐受性能是依據(jù)實(shí)際生產(chǎn)過程中高溫制粒，畜禽腸道酸性環(huán)境和膽鹽破壞而進(jìn)行的評估的指標(biāo)。由耐受結(jié)果可知，該株凝結(jié)芽孢桿菌具有良好的耐高溫、耐酸和耐膽鹽的性能（表1、表2 和表3），這一結(jié)果與前人報道一致。這也驗(yàn)證了飼用凝結(jié)芽孢桿菌在飼料生產(chǎn)環(huán)節(jié)中和畜禽腸道環(huán)境中能夠降低損耗。

表3 凝結(jié)芽孢桿菌豬膽鹽的耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果 %

3.3 凝結(jié)芽孢桿菌對有害菌的抑制作用

大腸桿菌K88、雞白痢沙門氏菌是引起豬只和雞腹瀉的主要致病菌，導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降。同時，金黃色葡萄球菌是飼料及飼料原料中主要污染菌，常常會導(dǎo)致動物腸道和肝臟受到毒素的破壞，導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降和死亡率增加。本研究顯示，凝結(jié)芽孢桿菌對大腸桿菌K88、雞白痢沙門氏菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌效果，這個結(jié)果與以往的報道基本一致。這說明，該株凝結(jié)芽孢桿菌能夠在飼料和畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中運(yùn)用，提高畜禽生長性能和對飼料有一定的保護(hù)作用。

3.4 凝結(jié)芽孢桿菌對商業(yè)益生菌的抑制作用

飼用益生菌添加符合我國實(shí)際34 種飼料添加劑的使用規(guī)范（《飼料添加劑品種目錄》，2020）。生產(chǎn)中常常以添加單一菌和組合菌的方式改善畜禽生長性能，滿足我國在研發(fā)禁用促生長藥物飼料添加劑的需求。本研究表明，該株凝結(jié)芽孢桿菌對枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、丁酸梭菌和屎腸球菌具有抑菌效果；但對糞腸球菌和酵母菌無抑制作用，這一結(jié)果與前人報道一致。本實(shí)驗(yàn)研究首次發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌對益生菌丁酸梭菌也有一定的抑制作用。以上結(jié)果顯示，凝結(jié)芽孢桿菌在與枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、丁酸梭菌、屎腸球菌組合使用過程需謹(jǐn)慎考慮。

4 結(jié)論

本研究考慮飼用益生菌凝結(jié)芽孢桿菌在運(yùn)用過程中，首先要滿足菌株的安全性，進(jìn)而對飼用凝結(jié)芽孢桿菌進(jìn)行耐受性能測定，得出其符合飼用益生菌凝結(jié)芽孢桿菌在飼料工藝中和畜禽腸道中的運(yùn)用依據(jù)；同時，驗(yàn)證凝結(jié)芽孢桿菌的抑菌性能。這樣能夠更好地提供凝結(jié)芽孢桿菌在飼料和畜禽養(yǎng)殖中，以及飼料添加劑中益生菌之間的組合運(yùn)用研究依據(jù)。