田付港,郭春敏,于 昕

(煙臺大學藥學院,分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學),新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心,山東 煙臺,264005)

帕金森病(Parkinson′s Disease, PD)是以中腦黑質(zhì)致密部(substantia nigra pars compacta, SNpc)中DA神經(jīng)元的選擇性丟失、α-syn錯誤堆積為主要病理特征的神經(jīng)退行性疾病[1]。PD發(fā)病機制不明,主要的研究觀點認為PD與基因缺陷、環(huán)境毒素、機械性創(chuàng)傷等因素相關(guān),其中A53T突變作為SNCA基因常染色體顯性遺傳突變,導致α-syn的異常堆積,被認為是30%以上家族性PD的主要病因[2]。正常α-syn為細胞中基礎(chǔ)蛋白,在大腦中含量豐富,可以通過調(diào)節(jié) SNARE 復合物調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[3]。發(fā)生A53T突變的SNCA基因可導致α-syn異常折疊,產(chǎn)生α-syn寡聚體。α-syn寡聚體與細胞器脂質(zhì)膜相互作用,使溶酶體和蛋白酶體功能障礙,并干擾細胞正常的自噬清除功能,導致細胞中毒死亡[4]。此外研究表明,線粒體功能障礙、α-syn 聚集以及自噬降解途徑在 PD 的神經(jīng)退行性過程中存在三邊關(guān)系。

在藥物改善細胞自噬功能的研究中發(fā)現(xiàn),多巴胺受體激動劑普拉克索可增加PD小鼠腦中自噬小泡的數(shù)量,減少細胞的死亡率[5],說明多巴胺受體激動劑可能改善細胞的自噬功能。Rotigotine作為非麥角類多巴胺受體(D3/D2/D1)激動劑[6],對多巴胺受體的親和力遠大于內(nèi)源性多巴胺,臨床用藥顯示Rotigotine對PD具有良好的治療作用[7],但未見Rotigotine對自噬作用的調(diào)節(jié)以及α-syn的清除影響的相關(guān)報道。

本試驗以Rotigotine為受試用藥,構(gòu)建A53T-SY5Y細胞,利用MPP+刺激A53T-SY5Y細胞[8]以探究Rotigotine是否在細胞自噬方向上參與α-syn的清除發(fā)揮細胞保護作用,并為Rotigotine治療PD的機制研究提供理論指導。

1 試驗材料

1.1 細胞來源和病毒來源

人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y細胞株由中國科學院干細胞庫提供。慢病毒購買自吉凱基因,該突變型α-syn基因的Genbank ID為6622。在A53T突變體α-syn基因中,第209位的核苷酸表現(xiàn)出G→A錯義突變,將第53位的丙氨酸(Ala)突變?yōu)樘K氨酸(Thr)。所需的培養(yǎng)基為含10% 胎牛血清DMEM完全培養(yǎng)基,置于5 % CO2、飽和濕度、37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。1～2 d 更換培養(yǎng)液,培養(yǎng)至單層細胞匯合,傳代培養(yǎng)。

1.2 藥品與試劑

N-甲基-4-苯基吡啶鎓碘化物(MPP+iodide,MPP+)(N137206,阿拉丁);Rotigotine(浙江瑞博制藥);β-actin抗體(小鼠單抗)、BCA濃度測定試劑盒(增強型)、TUNEL檢測試劑盒、Alexa Fluor 647標記山羊抗小鼠IgG(H+L)、酶標山羊抗兔IgG、酶標山羊抗小鼠IgG、增強型特超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司);α-syn抗體、LC3B抗體、P62抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體(Cell Sigal Technology, CST)。

1.3 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司);離心機(美國Beckman公司);全自動化學發(fā)光成像凝膠成像系統(tǒng)(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司);酶標儀(美國伯騰儀器有限公司);OLYMPUSIX73倒置熒光顯微鏡(北京奧林巴斯有限公司)。

2 試驗方法

2.1A53T α-syn過表達細胞構(gòu)建以2×l07個/L的密度接種對數(shù)生長狀態(tài)良好的SH-SY5Y細胞于6孔板中,使96 h后細胞生長良好便于傳代。將細胞分為正常對照組、陰性對照組、SNCA過表達組,24 h后,分別以僅可感染表達熒光蛋白的病毒感染陰性對照組細胞、以可同時感染表達目的蛋白與熒光蛋白的病毒感染SNCA過表達組細胞,濃度均為20 MOI。96 h后,熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達,統(tǒng)計轉(zhuǎn)染效率。選擇轉(zhuǎn)染穩(wěn)定的過表達SNCA(A53T)細胞株,嘌呤霉素篩選,建立單克隆A53T-SY5Y細胞系(Tg)。

2.2TUNEL染色多聚賴氨酸包被24孔板15 min,培養(yǎng)基洗3次,以2×l07個/L的密度接種于板上。24 h后更換含有Rotigotine(0.1、1、10 nmol/L)的DMEM培養(yǎng)基,對照組更換新鮮DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。1 h后加入1 mmol/L MPP+,24 h后,PBS浸洗,4%多聚甲醛固定,Triton X-100通透,滴加TUNEL檢測液37 ℃避光孵育60 min,抗熒光淬滅封片液封片,然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像,并使用Image J軟件進行定量。

2.3Western Bolt檢測細胞蛋白表達藥物處理后,裂解細胞約20 min,15 000 r/min離心處理15 min,收集上清,BCA法測定蛋白濃度并配平,蛋白樣品在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中分離,轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。封閉后將膜與一抗在4 °C下反應(yīng)過夜,隨后將膜與二抗在室溫下共孵育1 h。通過增強型特超敏ECL化學發(fā)光試劑顯影,使用Image J軟件進行定量。

2.4細胞免疫熒光多聚賴氨酸包被后,以2×l07個/L的密度接種于板上,藥物處理后,PBS浸洗,4%多聚甲醛固定后Triton X-100通透,1% BSA室溫封閉后一抗4 ℃ 孵育過夜,滴加熒光二抗孵育1 h,滴加 DAPI避光孵育5 min,抗熒光淬滅封片液封片,熒光顯微鏡下觀察采集圖像,并使用Image J軟件進行定量。

3 試驗結(jié)果

3.1 熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)熒光蛋白的表達

除正常對照組外,陰性對照組和過表達組細胞均可見熒光蛋白表達,顯示病毒轉(zhuǎn)染成功(圖1)。

對明場及暗場熒光細胞計數(shù),計算轉(zhuǎn)染效率:轉(zhuǎn)染效率=暗場熒光細胞個數(shù)/明場細胞個數(shù)。正常對照組、陰性對照組和SNCA過表達組的慢病毒轉(zhuǎn)染效率分別為0、29.37%和55.83%。

圖1 細胞內(nèi)熒光蛋白的表達

3.2 Rotigotine降低了MPP+作用下Tg細胞的細胞毒性

TUNEL熒光結(jié)果表明,與正常組相比,模型組熒光強度顯著上升(P<0.01);與模型組相比,Rotigotine治療組TUNEL熒光強度顯著下降(P<0.01),且具有濃度依賴性,說明在一定濃度范圍內(nèi),Rotigotine發(fā)揮細胞保護作用(圖2)。

與對照組相比,##P < 0.01;與模型組相比,**P<0.01。

Western Blot結(jié)果表明,與正常組相比,模型組Bcl-2/Bax比值顯著下降(P<0.01),與模型組相比,Rotigotine 治療組Bcl-2/Bax比值增加,且呈劑量依賴性,說明在一定濃度范圍內(nèi),Rotigotine保護受損傷細胞,具有濃度依賴性(圖3)。

與對照組相比,##P<0.01;與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01。

3.3 Rotigotine激活自噬保護受損細胞

由圖 4可見,與正常組相比,模型組LC3B含量顯著下降,P62含量顯著增加;與模型組相比,Rotigotine治療組LC3B含量增加,P62含量降低,且具有濃度依賴性,說明在一定濃度范圍內(nèi),Rotigotine可以激活自噬,保護受損細胞。

與對照組相比,#P<0.05,##P<0.01;與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01。

3.4 Rotigotine增加對α-syn的清除

由圖5可見,與正常組相比,模型組α-syn含量顯著增加;與模型組相比,Rotigotine治療組α-syn含量降低,說明Rotigotine可以通過激活自噬,增加對α-syn的清除。

與對照組相比,##P<0.01;與模型組相比,**P<0.01。

4 討 論

α-syn與帕金森病的發(fā)病機制密切相關(guān),α-syn可破壞細胞內(nèi)的自噬平衡最終導致細胞凋亡[9]。自噬是一種進化上保守的穩(wěn)態(tài)機制,用于最大限度地減少異常蛋白質(zhì)聚集并促進細胞器更新[10]。α-syn的累積會危害自噬,這反過來又可能進一步抑制其自身的降解,導致神經(jīng)元死亡的惡性循環(huán)[11]。在藥物改善細胞自噬功能的研究中發(fā)現(xiàn),多巴胺受體激動劑普拉克索可增加PD小鼠腦中自噬小泡的數(shù)量,減少細胞的死亡率[5],該結(jié)果表明多巴胺受體激動劑可能通過增強受損細胞的自噬功能而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。基于以上理論,本研究利用A53T-SY5Y細胞模型探討多巴胺受體激動劑Rotigotine通過改善細胞自噬功能進而介導細胞保護的作用機制。

人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y具有成熟神經(jīng)元形態(tài)和生化特征,常用于神經(jīng)科學領(lǐng)域的研究。PD造模藥MPP+可通過影響線粒體復合物Ⅰ致ATP消耗,進而觸發(fā)多巴胺滲漏到細胞質(zhì)中并刺激ROS的產(chǎn)生和誘導神經(jīng)元凋亡,還可通過ERK/MAPK通路介導α-syn的增加[12]。

本研究采用MPP+處理過表達A53T突變體α-syn的SH-SY5Y細胞制作PD細胞模型,在細胞水平上觀察Rotigotine的細胞保護作用,并研究其影響自噬調(diào)節(jié)的機制。TUNEL染色結(jié)果顯示,與正常組相比,過表達基因組細胞中可觀測到較多的綠色熒光蛋白表達,表明成功構(gòu)建了A53T SNCA基因過表達細胞模型;Western Blot結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組α-syn蛋白含量顯著上升,與模型組相比,Rotigotine給藥組α-syn蛋白含量明顯下降;凋亡蛋白結(jié)果表明,與對照組相比,模型組Bcl-2/Bax蛋白含量顯著降低,與模型組相比,Rotigotine給藥組Bcl-2/Bax蛋白含量升高,同時在TUNEL熒光結(jié)果上也具有相同表現(xiàn),說明Rotigotine可抵抗MPP+和α-syn誘導的細胞凋亡;自噬蛋白結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組自噬標志蛋白LC3B含量顯著下降,自噬底物蛋白P62含量顯著升高,表明PD模型細胞內(nèi)的自噬功能被MPP+和α-syn破壞;與模型組相比,Rotigotine給藥組LC3B蛋白含量上升,P62蛋白含量下降,均具有統(tǒng)計學意義和劑量依賴性。上述結(jié)果說明Rotigotine可劑量依賴性地上調(diào)PD模型細胞的自噬,增加對α-syn的清除,進而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

5 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明,Rotigotine可通過上調(diào)自噬蛋白,拮抗MPP+損傷的α-syn過表達細胞PD模型中的自噬抑制,從而進一步增強PD細胞模型的自噬功能,增強對α-syn的清除,同時減少細胞凋亡,保護神經(jīng)元,發(fā)揮抗PD的作用。