王 茗，李紅霞

(華北理工大學(xué)化學(xué)與工程學(xué)院，河北 唐山 063200)

蛋白質(zhì)是構(gòu)成人體組織和器官的重要物質(zhì)，人們對于蛋白質(zhì)的研究從未停止。近年來，關(guān)于蛋白質(zhì)-配體間的研究層出不窮，研究方法也不斷進步，對于蛋白質(zhì)的相關(guān)研究做出了重大貢獻。在討論蛋白質(zhì)-配體間作用機制中，光譜法比較常見，且應(yīng)用廣泛，例如：熒光光譜、紫外-可見吸收光譜、圓二色光譜等。同時，等溫滴定量熱技術(shù)也逐漸被應(yīng)用于這一領(lǐng)域，該技術(shù)可以在單個試驗中獲取蛋白質(zhì)與配體間結(jié)合的結(jié)合常數(shù)(Ka)、結(jié)合位點數(shù)(n)以及熱力學(xué)常數(shù)，進一步分析得到作用力類型。分子對接是一種預(yù)測蛋白質(zhì)與配體結(jié)合的各種可能的結(jié)合構(gòu)象的技術(shù)，根據(jù)各個構(gòu)象和和能量的匹配排名打分，選取最穩(wěn)定的結(jié)合構(gòu)象。分子對接的出現(xiàn)，對于許多配體-靶標(biāo)的預(yù)測十分重要，對于藥物小分子的開發(fā)起到了推動作用。

目前，對于蛋白質(zhì)與小分子作用的光學(xué)變化的研究已十分詳細，分子對接在藥物研發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用十分廣發(fā)，但對于以溶液狀態(tài)存在的蛋白質(zhì)與小分子間的作用機制卻沒有詳盡的綜述，所以，本文綜述了用于檢測溶液中蛋白質(zhì)與配體相互作用的方法，以方便他人進行研究。

1 光譜法原理及其應(yīng)用

1.1 熒光光譜法原理

熒光光譜是討論蛋白質(zhì)-配體間相互作用的常用方法，通過分析蛋白質(zhì)-配體體系的發(fā)射光譜的數(shù)據(jù)，可以對反應(yīng)體系進行熱力學(xué)分析。小分子配體會對蛋白質(zhì)的本源熒光產(chǎn)生猝滅作用，這種猝滅作用分為兩種，一種是碰撞所致的熒光猝滅，這種猝滅被叫做動態(tài)熒光猝滅，另一種是生成基態(tài)絡(luò)合物引發(fā)的熒光猝滅，這被稱為靜態(tài)猝滅，另外，還有一種產(chǎn)生碰撞的同時生成絡(luò)合物的過程，被叫做混合猝滅機制[1]。

1.1.1 猝滅機制

猝滅機制的判斷需利用Stern-Volmer方程[2]對數(shù)據(jù)進行分析，若計算所得KSV值與溫度的變化趨勢相反，則說明配體與蛋白質(zhì)間是靜態(tài)猝滅，并生成了復(fù)合物，這是因為升溫不利于復(fù)合物的穩(wěn)定性；反之，Ksv值與溫度的變化趨勢相同，則表明配體與蛋白質(zhì)之間僅產(chǎn)生了碰撞，這是升溫導(dǎo)致碰撞增加所致[3]。此外，若Kq值大于生物大分子與猝滅劑碰撞可達的最大速率常數(shù)2×1010L·mol-1·s-1，則說明結(jié)合過程中僅存在靜態(tài)猝滅[4]。

(1)

1.1.2 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)

若蛋白質(zhì)與配體間形成了新的復(fù)合物，即配體對蛋白質(zhì)是靜態(tài)猝滅，則需要利用雙對數(shù)方程[5]繪制雙對數(shù)曲線，得到反應(yīng)過程中配體和蛋白質(zhì)之間的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點數(shù)n的值：

(2)

1.1.3 作用力類型

通過Van’t Hoff方程[6]和熱力學(xué)方程(4)進一步對數(shù)據(jù)進行分析，可以得到蛋白質(zhì)與配體間作用的熱力學(xué)常數(shù)：焓變(ΔH0)、熵變(ΔS0)和吉布斯自由能變(ΔG0)。

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ΔG0=ΔH0-TΔS0

(4)

按照ROSS等[7]的分析方法對熱力學(xué)數(shù)據(jù)進行分析，即可得到每個絡(luò)合作用的作用力類型以及驅(qū)動力類型。按照ROSS等的研究可知：對于所有相互作用，ΔH0和ΔS0均大于零表明，在反應(yīng)中起主要作用的是疏水相互作用；ΔH0>0且ΔS0>0表明，氫鍵或范德華力在相互作用中的作用最明顯；ΔH0<0且ΔS0>0表明，靜電作用在結(jié)合過程中的作用最明顯；ΔS0為正值時表明，疏水作用和靜電作用在結(jié)合過程中的作用最明顯；ΔS0<0表明，氫鍵和范德華力在結(jié)合過程中的作用最顯著；當(dāng)ΔH0接近零或很小的時候，主要起作用的是氫鍵。

1.2 同步熒光和三維熒光法原理

同步熒光和三維熒光光譜常被用來分析蛋白質(zhì)在反應(yīng)前后構(gòu)型是否發(fā)生變化的常用手段。其中，將發(fā)射波長與激發(fā)波長的波長差分別為15 nm和60 nm時，其反映的是蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸周圍的結(jié)構(gòu)信息[8]，若是峰位置向長波方向移動，這說明氨基酸殘基的極性變強，肽鏈更加伸展；若是向短波方向移動，這說明氨基酸殘基的疏水性增強，肽鏈更加緊湊[9]。三維熒光可以同時反映激發(fā)波長、發(fā)射波長和熒光強度的變化，故而其反映的信息更加全面，通過蛋白質(zhì)三維熒光光譜的變化，可以同時了解到蛋白質(zhì)肽鏈和酪氨酸、色氨酸殘基的變化[10]。

1.3 紫外-可見吸收光譜法原理

紫外-可見吸收光譜是分析蛋白質(zhì)-配體相互作用的重要手段之一。蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜中含有兩個吸收峰，從220 nm附近的強吸收峰的變化中可以得到蛋白質(zhì)肽骨架是否發(fā)生變化的信息，分析280 nm附近弱吸收峰的改變能夠得到芳香族氨基酸是否受到配體絡(luò)合的影響[10]。如果反應(yīng)前后蛋白質(zhì)的譜圖發(fā)生了變化，則說明蛋白質(zhì)與配體間形成了新的復(fù)合物[11]，若峰位置出現(xiàn)了變化，則表明蛋白質(zhì)構(gòu)象也發(fā)生了變化[12]。

1.4 圓二色光譜法原理

圓二色技術(shù)常被用來討論蛋白質(zhì)二級構(gòu)象的變化。若圓二色光譜中在208～220 nm之間存在兩個負峰，且這兩個峰呈現(xiàn)出“W”形，則表明是α螺旋結(jié)構(gòu)；若217～220 nm間僅存在一個負峰，且這個峰呈現(xiàn)出“V”形則表明是β折疊結(jié)構(gòu)[13-14]。

1.5 光譜法的應(yīng)用

由于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)異常復(fù)雜，所以一種研究方法往往并不能很好地闡述蛋白質(zhì)-配體間的作用機制，故而在實際操作中，常常結(jié)合上述幾種方法進行討論。張彥青等[15]利用光譜法和分子對接技術(shù)對赤蘚紅與溶菌酶之間的作用進行了研究。光譜法的結(jié)果表明：赤蘚紅對溶菌酶時靜態(tài)猝滅，并且以摩爾比1:1的比例形成了新的復(fù)合物。對熒光光譜的數(shù)據(jù)進行熱力學(xué)分析后，得出了在結(jié)合過程中疏水作用力和氫鍵使反應(yīng)得以發(fā)生的結(jié)論。分子對接的結(jié)果與上述研究一致。王軍等[16]采用熒光光譜法、同步熒光光譜法、三維熒光光譜法、紫外光譜法以及分子對接法研究了檸檬黃與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。熒光光譜的結(jié)果顯示，檸檬黃對BSA是靜態(tài)猝滅，且1個檸檬黃結(jié)合到1個BSA上，且結(jié)合能力很強。熱力學(xué)分析表明，結(jié)合過程可自發(fā)進行，氫鍵或范德華力其主要作用。同步熒光和三維熒光的結(jié)果指出檸檬黃的加入，改變了BSA的構(gòu)象，紫外-可見吸收光譜證實了BSA的變化。分子對接結(jié)果佐證了光譜法的結(jié)果。鄢雨中等[17]利用上述多光譜法結(jié)合分子對接技術(shù)對芹菜素與大豆分離蛋白之間的相互作用進行了研究。熒光的分析結(jié)果表明API對SPI是靜態(tài)猝滅，氫鍵或范德華力是相互作用過程中的主要作用力，反應(yīng)過程自發(fā)且放熱。同步熒光表明，API的絡(luò)合，影響了SPI中的Tyr殘基和Trp殘基周圍的極性，其中Tyr殘基親水性變?nèi)?，極性減小，相反，Trp殘基的親水性變強，極性增大。三維熒光光譜和圓二色光譜實驗表明，API的加入，同時影響了SPI的多肽鏈結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)較之反應(yīng)前更加松散，不再緊湊，這也導(dǎo)致SPI表面的親水性變得更強了。分子對接的結(jié)果驗證了光譜法的結(jié)果。王曉霞等[18]模擬了生理環(huán)境，使用上述光譜法和分子對接法對黃腐殖酸(FA)和牛血清白蛋白(BSA)間的相互作用。熒光光譜的結(jié)果顯示FA對BSA是靜態(tài)猝滅，且一個FA剛好與1個BSA結(jié)合，二者之間的反應(yīng)可以自發(fā)進行，主要存在氫鍵或范德華力，F(xiàn)A與BSA間存在非輻射能量轉(zhuǎn)移。紫外-可見吸收光譜中出現(xiàn)了最大吸收峰的峰位值向長波長方向移動的現(xiàn)象，說明FA的絡(luò)合影響了BAS的結(jié)構(gòu)；同步熒光的結(jié)果又指出FA的加入對BSA中Trp殘基產(chǎn)生了影響，導(dǎo)致其變得比之前更加親水；三維熒光中兩個峰的最大發(fā)射波長都出現(xiàn)了不同程度的紅移，這表明FA的絡(luò)合改變了BSA表面的極性，其比之前變得更加親水了。從這幾種光譜的變化得出了FA的絡(luò)合影響了BSA的構(gòu)象的結(jié)論。圓二色研究和分子對接結(jié)果更證明了FA的加入，使BSA中的結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，其中減少的結(jié)構(gòu)有：α-螺旋結(jié)構(gòu)和無規(guī)則結(jié)構(gòu)，分別減少了2.3%和1.2%；增加的結(jié)構(gòu)有β-折疊和β-轉(zhuǎn)角，分別增加了7.7%和0.6%，β-折疊結(jié)構(gòu)含量增加的變化最顯著，這一結(jié)果強有力地證明了FA使BSA結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

2 等溫滴定量熱技術(shù)原理及其應(yīng)用

2.1 等溫滴定量熱技術(shù)原理

圖1 等溫滴定量熱原理示意圖[19]Fig.1 Schematic diagram of isothermal titration calorimetry[19]

等溫量熱技術(shù)(Isothermal Titration Calorimetry，ITC)是目前唯一可以完整、準(zhǔn)確地記錄整個反應(yīng)過程中的熱量變化的手段。比起上述光譜法的研究，其結(jié)論可信度更高。等溫滴定量熱技術(shù)是將每一滴配體滴定進樣品池時產(chǎn)生的熱量波動轉(zhuǎn)化為一種維持樣品池和參比池溫度一樣所需的功率量(μcal/s)的形式呈現(xiàn)，這一過程中會將實驗過程中出現(xiàn)的熱量變化完整地記錄下來，再對熱量曲線進行積分，即可得到反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)和相應(yīng)的熱力學(xué)數(shù)據(jù)。同樣利用Ross等[7]的方法對熱力學(xué)常數(shù)進行分析，即可得到蛋白質(zhì)-配體間的作用力類型。

2.2 等溫滴定量熱技術(shù)的應(yīng)用

肖語涵等[20]利用ITC技術(shù)和熒光光譜法對碲化鎘量子點(CdTe QDs)與轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，Tf)的相互作用進行了研究。熒光光譜的結(jié)果表明，CdTe QDs與Tf間存在靜態(tài)猝滅，二者間的結(jié)合位點數(shù)為0.3，與Tf結(jié)合后CdTe QDs的熒光強度增加了。熱力學(xué)分析的結(jié)果顯示，二者間可以自發(fā)地進行弱結(jié)合，同時放出熱量，氫鍵、靜電相互作用是這一焓-熵補償驅(qū)動過程的主要推動力，與Tf絡(luò)合后，CdTe QDs的化學(xué)穩(wěn)定性增強了。智東明等[21]利用ITC對合成的一系列C3H12截短及全長蛋白質(zhì)與一些潛在的RNA底物ARE9、ARE19及對照Random21結(jié)合過程的互作核心區(qū)域和熱力學(xué)性質(zhì)進行了研究，并以熒光光譜和型熱泳動(microscale thermophoresis，MST)技術(shù)對ITC的結(jié)果驗證證。結(jié)果顯示，C3H12與ARE底物間以1:1的結(jié)合比進行結(jié)合，過程是自發(fā)的，是焓驅(qū)動為主的特異性結(jié)合。C3H12與ARE19間結(jié)和力約為ARE9的兩倍。C3H12中ZnF1-3是與ARE類底物結(jié)合的活性結(jié)構(gòu)，并且主導(dǎo)了作用的發(fā)生。C3H12中的氨基酸殘基并未直接與ARE底物直接相互作用。

3 分子對接原理及其應(yīng)用

3.1 分子對接原理

在蛋白質(zhì)-配體間的作用研究中，分子對接可以直接將反應(yīng)過程中的結(jié)合位點、結(jié)合位點處配體的構(gòu)象、整個反應(yīng)中起作用的作用力、氫鍵是否產(chǎn)生及氫鍵鍵長等信息。分子對接技術(shù)在藥物研發(fā)過程中常被用來篩選可以與靶點結(jié)合的先導(dǎo)藥物[22]，同時在蛋白質(zhì)-配體的研究中也作為輔助工具，對結(jié)合反應(yīng)的結(jié)論進行理論上的驗證和補充。

3.2 分子對接的應(yīng)用

馬崢玲等[23]利用分子對接技術(shù)探討了加減薯蕷丸治療阿爾茨海默病(AD)的藥理作用與分子機制。模擬結(jié)果表明加減薯蕷丸可能通過減輕炎性反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)突觸可塑性、調(diào)控細胞凋亡等多種途徑發(fā)揮預(yù)防及延緩AD進展的效果。唐琳等[24]在模擬生理環(huán)境下利用分子對接技術(shù)、動力學(xué)模擬和光譜法對己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)與CYP3A4酶的作用機制進行了討論。熒光光譜表明DES與CYP3A4間存在靜態(tài)猝滅，紅外光譜和紫外-可見吸收光譜顯示，DES與CYP3A4的結(jié)合，對CYP3A4的內(nèi)部環(huán)境和構(gòu)象均產(chǎn)生了影響。分子對接和動力學(xué)模擬方法從理論上模擬了CYP3A4與DES相互作用后的構(gòu)象變化情況，理論模擬與實際實驗結(jié)果互為印證。

4 結(jié) 語

與蛋白質(zhì)相關(guān)的研究一直以來備受關(guān)注，其中蛋白質(zhì)與配體間的結(jié)合機制更是各領(lǐng)域的熱點問題，尤其是在醫(yī)藥領(lǐng)域和食品領(lǐng)域。相關(guān)研究方法也一致在進步，而單一的研究方法往往具有局限性，可能會導(dǎo)致結(jié)論的可信度不高，而采取幾種研究方法相互驗證的方式來進行討論，往往更為大眾所接受。在研究以溶液狀態(tài)存在的蛋白質(zhì)與配體結(jié)合的過程中光譜法、等溫滴定量熱法和分子對接技術(shù)的聯(lián)合使用，不失為一種好的選擇。