許申平，袁秀云，吉長獻(xiàn)，王默霏，張燕，蔣素華，牛蘇燕，崔波*

1(鄭州師范學(xué)院,生物工程研究中心，河南 鄭州，450044)2(鞏義市天澤農(nóng)林有限公司，河南 鞏義，451200)

海棠(Malusspp.)為薔薇科蘋果屬(MalusMill.)的落葉喬木或者小喬木，大部分品種具有極強(qiáng)的適應(yīng)性和抗逆性[1]，是干旱貧瘠地區(qū)的重要建群種和生態(tài)樹。雖然海棠的主要用途是觀賞，但因其花、葉和果實中含有豐富的生物活性和營養(yǎng)成分[2-4]，海棠已成為食物加工、營養(yǎng)產(chǎn)品和藥物開發(fā)的重要資源之一。海棠具有顯著的抗氧化能力，果實富含豐富的黃酮類化合物，已成為研究黃酮類化合物生物合成分子機(jī)制的有價值模型[5]。以海棠果實為原料開發(fā)的相關(guān)產(chǎn)品如蘋果酒、醋、果汁等深受消費者歡迎[6]。海棠葉片營養(yǎng)豐富，除了豐富的酚類化合物和黃酮，還含有多種人體所需的蛋白質(zhì)、糖類、維生素、鈣、磷、鐵、鎂等礦質(zhì)元素。海棠葉片常被制成茶飲和飲料[7]，其中以海棠葉作為茶飲在三峽地區(qū)已有幾百年歷史[8]。同時，海棠的多種藥理活性在藥用保健方面也有很大開發(fā)前景[9]。從海棠葉片和果實中分離得到的二氫查耳酮類化合物對多種人類癌細(xì)胞具有顯著的抗癌活性[10-11]。隨著對海棠功能性成分的深入研究，海棠副產(chǎn)品加工的開發(fā)利用已逐漸引起人們的重視，副產(chǎn)品不但可應(yīng)用于了食品、醫(yī)藥和天然化妝品行業(yè)，同時也可以變廢為寶，減少資源的浪費，具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會價值。

我國海棠栽培歷史悠久，資源豐富[12]。近幾年對海棠的研究取得了一定的成果，主要集中在海棠種質(zhì)資源、新品種選育和抗氧化活性等方面，而在產(chǎn)品開發(fā)利用方面的研究仍局限在傳統(tǒng)的“海棠四品”(湖北海棠、西府海棠、垂絲海棠和貼梗海棠)中[13]，致使大部分優(yōu)良海棠品種的葉、花朵和果實的價值沒有充分利用而被廢棄在田間。海棠品種間的葉片營養(yǎng)成分與抗氧化活性之間存在一定差異[2,14]，為探究葉片營養(yǎng)成分和抗氧化活性較高的海棠品種，本試驗選取河南省鞏義市廣泛栽植的8種海棠為試驗材料，對其葉片主要營養(yǎng)成分、礦物元素和抗氧化活性進(jìn)行分析，旨在為海棠葉片的合理開發(fā)和充分利用提供理論依據(jù)。同時，研究結(jié)果也可為研究海棠品種的理化特性提供重要信息，為提高海棠的價值和選擇優(yōu)良的海棠基因型進(jìn)行商業(yè)栽培提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本試驗研究區(qū)位于河南省鞏義市，材料選自于大峪溝鎮(zhèn)的千畝海棠基地。選取的具體品種為垂絲海棠(M.halliana)、西府海棠(Malus.micromalus)、“沂蒙甜茶”(‘Sweet tea’)、“凱爾斯”(‘Kelsy’)、“冬紅”(‘Winter red’)、“絢麗”(‘Radiant’)、“紅麗”(‘Red splendor’)和“世標(biāo)1號”(‘Shibiao 1’)，共8個海棠品種。供試材料均為7年生海棠成樹，樹體無病蟲害，生長良好。每個品種隨機(jī)選擇3株，于2019年9月下旬采集1年生枝新梢頂部往下第4片葉，在實驗室流水沖洗干凈，105 ℃、30 min殺青，80 ℃、48 h 烘干，密封包裝，常溫放置備用。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600 紫外可見分光光度計，日本島津公司；OGS100 烘箱、MIRCOCL 17R 離心機(jī)、iCAP 7200 HS Duo 電感耦合等離子發(fā)射光譜儀、Multiskan GO 1510 全波長酶標(biāo)儀，美國Thermo公司；DHG-9035A 鼓風(fēng)干燥機(jī)，上?；厶﹥x器制造有限公司；FP6431 火焰光度計，上海儀電分析儀器有限公司；AX205DR 天平，METTLER TOLEDO；DK-S24 水浴鍋，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；JXFSTPRP-CL 冷凍研磨儀，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 營養(yǎng)成分含量的測定

海棠葉片可溶性糖含量采用蒽酮硫酸的方法進(jìn)行測定[15]。海棠葉片可溶性蛋白含量測定采用牛血清蛋白法[16]；氨基酸含量參考CHEN等[17]的方法；粗纖維含量的測定按照標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.10—2003的具體方法進(jìn)行；礦質(zhì)元素的含量參照GB 5009.268—2016的方法進(jìn)行測定。

1.3.2 抗氧化活性物質(zhì)的測定

海棠葉片總酚含量、類黃酮和自由基清除能力選取試劑盒進(jìn)行測定，試劑盒來自于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用Excel 2010和SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和相關(guān)性分析，所有樣品均進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式進(jìn)行表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 海棠葉片形態(tài)

如圖1所示,8個栽培海棠品種葉片形態(tài)有較大差異，顏色以綠色為主色，“絢麗”和垂絲海棠的綠色較淺，“凱爾斯”、“冬紅”和“紅麗”的顏色較深，而西府海棠葉片的顏色最深。海棠葉片大小因品種不同差異顯著，葉片最大的是“沂蒙甜茶”，葉面積達(dá)到32.42 cm2，比最小葉片垂絲海棠的葉面積大180%；“冬紅”葉面積稍小于“沂蒙甜茶”，面積為26.15 cm2。

表1 八個海棠品種葉面積數(shù)據(jù) 單位：cm2

圖1 不同海棠品種葉片形態(tài)Fig.1 The morphology in leaves of different crabapple cultivars

2.2 海棠葉片營養(yǎng)物質(zhì)含量

2.2.1 葉片可溶性糖含量

可溶性糖是植物內(nèi)部重要的有機(jī)物，在茶品中也是主要的水浸出物之一。不同海棠品種葉片可溶性糖的含量呈現(xiàn)顯著差異(表2)，其中含量最高的是“世標(biāo)1號”，其次是“冬紅”和西府海棠，三者平均含量達(dá)到87.93 mg/g；“沂蒙甜茶”和“凱爾斯”可溶性糖的含量有所降低；“絢麗”的含量達(dá)到最低，其次是垂絲海棠和“紅麗”，最低的含量平均是37.37 mg/g，比最高組含量低57.50%。

2.2.2 葉片可溶性蛋白含量

本研究中海棠葉片的平均可溶性蛋白含量為262.83 mg/g，品種間存在顯著差異?！笆罉?biāo)1號”的含量最高，達(dá)到338.86 mg/g；其次是“冬紅”和西府海棠；葉片可溶性蛋白的含量最低的是絢麗海棠，僅有182.83 mg/g。8種海棠葉片的可溶性蛋白含量排序為：“絢麗”<“紅麗”<“凱爾斯”<“沂蒙甜茶”<垂絲海棠<西府海棠<“冬紅”<“世標(biāo)1號”，含量最低的“絢麗”比含量最高的“世標(biāo)1號”低84.34%。

2.2.3 葉片氨基酸含量

根據(jù)表2可知，8個品種海棠葉片均含有氨基酸，平均含量為70.26 mg/g，氨基酸的總量最低為57.13 mg/g，最高為88.78 mg/g，其中“冬紅”的總氨基酸含量最高，“絢麗”的最低?！岸t”的氨基酸含量比8個海棠葉片的平均值高26.40%，比最低的“絢麗”高55.40%。不同海棠品種葉片中氨基酸組成達(dá)到顯著差異(P<0.05)。

表2 海棠葉片營養(yǎng)成分比較分析 單位：mg/g

2.2.4 礦質(zhì)元素含量

海棠葉片含有十分豐富的礦質(zhì)元素(圖2)。在測定的3種常量元素中，Mg和K的含量稍低，Ca的含量相對較高。Mg的含量為4.00～7.57 g/kg，其中“紅麗”的Mg含量最高，其次是“冬紅”，“絢麗”葉片的Mg含量最低。K的含量變化為5.98～9.37 g/kg，含量最高的是“沂蒙甜茶”，其次是“凱爾斯”，含量最低的是垂絲海棠。Ca含量位于13.23～22.11 g/kg，“凱爾斯”和“冬紅”含量最高，約為22 g/kg，“絢麗”含量最低。微量元素的測定表明，海棠葉片含有豐富的Fe元素，供試的8種海棠葉片平均含F(xiàn)e量為247.35 mg/kg，含量最高的為“沂蒙甜茶”，其次為“世標(biāo)1號”和“冬紅”，含量最低的為西府海棠。Mn的含量比Fe含量低，其含量為29.28～72.54 mg/kg，含量最高的為“世標(biāo)1號”，含量最低的為“沂蒙甜茶”。與Fe和Mn相比，Zn和Cu的含量相對較低。Zn的含量在8.22～14.87 mg/kg，“冬紅”的Zn含量最高，“絢麗”的Zn含量最低。Cu含量為7.6～9.44 mg/kg，“世標(biāo)1號”的Cu含量最高，最低的是“絢麗”。

圖2 海棠葉片礦質(zhì)元素的含量分析Fig.2 Analysis of mineral element contents in the leaves of crabapples注：數(shù)據(jù)柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2.5 葉片的礦質(zhì)元素與營養(yǎng)成分相關(guān)性分析

對海棠葉片的礦質(zhì)元素與營養(yǎng)成分(可溶性糖、可溶性蛋白和氨基酸)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，大部分的礦物元素與可溶性糖及可溶性蛋白的相關(guān)性都沒有達(dá)到顯著水平(表3)。海棠葉片礦質(zhì)元素Cu的含量與可溶性糖含量成負(fù)相關(guān)，并達(dá)到顯著水平，相關(guān)系數(shù)0.580。礦物元素和可溶性蛋白之間的相關(guān)性并沒有達(dá)到顯著水平；大部分礦物質(zhì)元素則和氨基酸的含量相關(guān)性均達(dá)到顯著水平，其中氨基酸與大部分礦質(zhì)元素都有顯著的正相關(guān)，但Fe與氨基酸的含量則有顯著的負(fù)相關(guān)。

表3 海棠葉片礦物元素與主要營養(yǎng)成分的相關(guān)性分析Table 3 The correlation of mineral elements and main nutritional components of crabapple

2.3 葉片抗氧化活性物質(zhì)

2.3.1 葉片類黃酮與總酚的含量

8種海棠葉片類黃酮的平均含量為48.34 mg/g，總體含量為37.46～58.27 mg/g(圖3)。類黃酮含量最高的品種為“冬紅”，比8種供試海棠的平均值高20.53%，比最低含量的“絢麗”高55.54%；垂絲海棠葉片類黃酮的含量也較高，僅比“冬紅”低3.17 mg/g，比8種供試海棠的平均值高13.97%，比最低含量的“絢麗”高47.07%。

圖3 八個海棠品種類黃酮和總酚含量的比較Fig.3 Comparative contents of flavonoids and total phenols in eight crabapple cultivars

8種海棠葉片的總酚含量平均為94.95 mg/g，其含量范圍為70.66～133.49 mg/g，且不同海棠品種之間葉片的總酚含量存在顯著差異(P<0.05)?！岸t”葉片的總酚含量顯著高于其他種類，其含量是8種海棠葉片的總酚均值的1.41倍，是最低含量“絢麗”的1.89倍；垂絲海棠的總酚含量雖然低于“冬紅”16.72%，但仍明顯高于其他品種，其含量是8種海棠葉片總酚平均值的1.17倍，是最低品種“絢麗”含量的1.57倍。

2.3.2 自由基清除能力

抗氧化能力常用清除DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的能力來評價。本研究中，供試的海棠品種清除DPPH自由基與ABTS陽離子自由基的能力均較強(qiáng)(圖4)。海棠葉片DPPH自由基的清除率為86.20%～92.79%，品種之間存在顯著差異(P<0.05)：葉片中DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)的是“冬紅”和垂絲海棠，都達(dá)到90%以上；“沂蒙甜茶”和“絢麗”葉片中DPPH自由基的清除能力較弱，分別是86.20%和87.25%。8種海棠葉片ABTS陽離子自由基的清除率為79.47%～92.71%，在不同海棠品種之間差異顯著(P<0.01)：其中垂絲海棠和“冬紅”葉片的ABTS陽離子自由基清除能力較強(qiáng)，清除率均大于90%；“絢麗”和“世標(biāo)1號”葉片中ABTS陽離子自由基的清除能力最弱，清除率僅為79%。

2.3.3 海棠葉片類黃酮含量、總酚含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析

海棠葉片的類黃酮含量、總酚含量、DPPH自由基清除力和ABTS陽離子自由基清除力呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(表4)。類黃酮與總酚含量、ABTS陽離子自由基和DPPH自由基清除能力顯著正相關(guān)，其中與總酚含量和ABTS陽離子自由基清除能力相關(guān)系數(shù)達(dá)到極顯著水平(P<0.01)?？偡雍颗cDPPH自由基清除力和ABTS陽離子自由基清除力都呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.600和0.580。ABTS陽離子自由基與DPPH自由基清除力之間呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)是0.619。

圖4 海棠葉片清除DPPH和ABTS陽離子自由基清除的能力Fig.4 Activity of DPPH and ABTS cationic radical-scavenging in crabapple leaves

表4 類黃酮含量、總酚含量和抗氧化活性相關(guān)性分析Table 4 The correlation of flavonoids, total phenols and antioxidant activity

2.4 海棠葉片品質(zhì)性狀與抗氧化活性的主成分分析

對海棠葉片的12個指標(biāo)的主成分分析發(fā)現(xiàn)(表5)，主成分特征值大于1的共有4個，累計方差的貢獻(xiàn)率為94.15%，可代表海棠葉片大部分指標(biāo)的信息。第1主成分特征值是5.653，貢獻(xiàn)率是47.11%，其中氨基酸和常量元素(Mg、K、Ca)在第1主成分中有較高載荷，且載荷均為正值。第2主成分的特征值為3.407，貢獻(xiàn)率是28.39%，其中可溶性蛋白、總酚和類黃酮在第2主成分中具有較高的載荷，載荷均為正值。第3主成分的特征值為1.139，貢獻(xiàn)率為9.49%，其中Fe、Zn和Cu在第3主成分有較高的正載荷。第4主成分的特征值為1.098，貢獻(xiàn)率為9.154%，其中可溶性糖和Mn在第3主成分具有較高載荷，且載荷均為正值。根據(jù)主成分綜合模型得出8種海棠葉片品質(zhì)成分的綜合評價，其葉片營養(yǎng)成分和抗氧化活性的綜合得分排序為：垂絲海棠<西府海棠<“沂蒙甜茶”<“絢麗”<“世標(biāo)1號”<“紅麗”<“凱爾斯”<“冬紅”。

表5 八種海棠葉片營養(yǎng)物質(zhì)和抗氧化性能主成分分析Table 5 Principal component analysis of nutraceutical compounds and antioxidant properties of eight crabapple cultivars

3 結(jié)論

栽培海棠因品種不同其葉片的營養(yǎng)成分都有顯著差異。糖類物質(zhì)是茶湯重要呈味物質(zhì)之一，在一定程度上能削減苦澀味[18]。本研究中，西府海棠、“冬紅”和“世標(biāo)1號”葉片的可溶性糖的含量都大于 80 mg/g，這對于海棠茶葉總體口感將有一定的改善作用。本研究中“世標(biāo)1號”海棠葉片可溶性蛋白的含量為338.86 mg/g，“冬紅”總氨基酸含量為88.78 mg/g，這與王海英等[4]研究認(rèn)為海棠葉片氨基酸和蛋白質(zhì)的含量豐富的研究結(jié)果一致。海棠葉片蛋白質(zhì)含量豐富，可促使其作為新型植物蛋白源，提供較高的營養(yǎng)成分[19]。本次試驗所選的8種海棠葉片皆具有非常豐富的常量元素及微量元素。Ca和Fe都是人體內(nèi)最重要的礦物元素；但兩者元素又是人類膳食中最易缺乏的重要營養(yǎng)素之一。“凱爾斯”和“冬紅”的Ca元素含量達(dá)到22 g/kg，“沂蒙甜茶”的Fe元素含量高達(dá)291 mg/kg，高于湖北海棠葉片的Ca和Fe元素的含量[8]?！皠P爾斯”和“冬紅”葉片可以作為補(bǔ)充Ca元素的良好來源，“沂蒙甜茶”葉片可以作為補(bǔ)充Fe元素的良好來源。海棠葉片如此豐富的礦質(zhì)元素和營養(yǎng)成分，為功能與保健型天然綠色產(chǎn)品重新開辟了新的途徑。

類黃酮和總酚不僅是植物代謝中具有抗性作用的重要次生物質(zhì)[20-21]，而且在抗衰老、抗氧化和降血脂等方面皆具有一定作用[22-23]，該指標(biāo)的含量是評價植物營養(yǎng)和保健功能的重要指標(biāo)[24]。海棠葉片的類黃酮及總酚含量因品種不同有顯著差異，早期研究在湖北海棠、王族海棠和雪球海棠等栽培品種中都發(fā)現(xiàn)葉片含有豐富的酚類物質(zhì)[2,14]。本研究中8種海棠葉片類黃酮的含量為37.46～58.27 mg/g，平均為48.34 mg/g；總酚含量為70.66～133.49 mg/g，平均為94.95 mg/g，其中“冬紅”的含量最高。這一結(jié)果進(jìn)一步證實海棠葉片有望開發(fā)成功能性食品或者可作為提取天然黃酮和總酚的原料。多酚的含量往往與自由基清除能力呈現(xiàn)正相關(guān)，同時在藥理方面也具有較強(qiáng)活性[25]。本研究發(fā)現(xiàn)8種海棠葉片去除DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的效果均較強(qiáng)，其中“冬紅”和垂絲海棠葉片清除DPPH自由基與ABTS陽離子自由基能力皆達(dá)到90%以上，可進(jìn)行抗氧化與抗衰老相關(guān)的海棠葉片新產(chǎn)品開發(fā)。

總之，本文中的8種供試海棠葉片中的營養(yǎng)物質(zhì)和抗氧化活性物質(zhì)都含量較高，在食用和藥用方面皆具有重要價值，是非常值得開發(fā)利用的珍貴山區(qū)植物資源。同時，本研究結(jié)果對海棠葉片藥用價值和生理保健功能具有積極意義。