趙路潔，段續(xù),2*，曹偉偉，任廣躍,2，劉盼盼，任星

1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽，471023)2(糧食儲藏安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州，450001)

熊果酸是一種存在于天然植物中的代表性的五環(huán)三萜類小分子化合物[1]。熊果酸具有廣泛的生物學(xué)活性，如保肝、抗炎、抗氧化、美白、抗菌和抗糖尿病等作用[2-3]。此外，熊果酸還具有毒性低，易從自然界獲取的特點[4]。盡管熊果酸具有各種生物活性和安全性，但由于其水溶性差且生物利用度低，因此尚未廣泛應(yīng)用于保健產(chǎn)品和化妝品等產(chǎn)品中[5-6]。因此，有必要探索克服上述問題的合適方法，擴(kuò)大熊果酸的應(yīng)用范圍，進(jìn)一步發(fā)揮熊果酸的生物活性。

為了提高熊果酸的溶解度和生物利用度，目前已經(jīng)開發(fā)了多種類型的熊果酸遞送系統(tǒng)，如固體包合物，脂質(zhì)體，納米乳劑和水凝膠。與其他遞送系統(tǒng)相比，天然聚合物納米粒子由于具有無毒、尺寸小、靶向性強、有效的滲透能力及提高生物利用度等多重優(yōu)勢而成為研究熱點[7-8]。殼聚糖是線性且由天然陽離子幾丁質(zhì)部分脫乙酰而獲得的聚合物，具有生物相容性、無毒性和可生物降解性[9]?；跉ぞ厶堑募{米顆粒作為納米載體用于遞送活性成分，可以增強活性成分的穩(wěn)定性、促進(jìn)其吸收和生物利用度的增加[10]。HERNANDEZ-PATLAN等[11]制備的姜黃素殼聚糖納米?？梢杂行岣呓S素的穩(wěn)定性和滲透性。WU等[12]制備的負(fù)載白藜蘆醇的殼聚糖納米顆?？梢燥@著提高白藜蘆醇的溶解度和穩(wěn)定性。THANDADANI等[13]研究表明殼聚糖納米顆粒具有很好的生物降解性、生物相容性、抗氧化活性且無毒。因此，殼聚糖納米顆粒是用于改善活性成分的穩(wěn)定性和溶解性的有效載體。與其他合成殼聚糖納米顆粒的方法相比，離子凝膠法具有反應(yīng)條件簡單溫和、方便、無毒的優(yōu)點[14]。然而，目前國內(nèi)外關(guān)于采用離子凝膠法以三聚磷酸鈉為交聯(lián)劑制備負(fù)載熊果酸的殼聚糖納米顆粒的研究鮮有報道。

本研究以殼聚糖和三聚磷酸鈉為載體，采用離子凝膠法制備負(fù)載熊果酸的殼聚糖納米顆粒，運用單因素試驗和正交試驗方法以熊果酸包埋率為指標(biāo)篩選最佳制備條件，以期提高熊果酸的溶解度，擴(kuò)大其在保健產(chǎn)品和化妝品行業(yè)中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熊果酸(純度98.0%)，上海源葉生物科技有限公司；殼聚糖(脫乙?；?0.0%)，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；三聚磷酸鈉(分析純)，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；吐溫-80(分析純)，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；乙酸(分析純)，江蘇強盛功能化學(xué)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600紫外可見分光光度計，龍尼柯(上海)儀器有限公司；HJ-6A數(shù)顯磁力加熱攪拌器，常州普天儀器制造有限公司；TG16-WS臺式高速離心機(jī)，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；TM3030Plus掃描電子顯微鏡，日本日立高新技術(shù)公司；Nano ZS90馬爾文激光粒度儀，上海普迪生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 熊果酸殼聚糖納米顆粒的制備工藝

參考文獻(xiàn)[15-16]的方法制備負(fù)載熊果酸的殼聚糖納米顆粒。在室溫下，將殼聚糖加入體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸溶液中，磁力攪拌8 h，得到澄清溶液，將其用0.45 μm 微孔膜過濾，得到殼聚糖溶液。用質(zhì)量濃度0.1 g/mL的氫氧化鈉溶液將殼聚糖溶液的pH調(diào)節(jié)至5.0，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的吐溫-80，并在室溫下磁力攪拌20 min。然后，按照熊果酸與殼聚糖的質(zhì)量比3∶1將溶解于乙醇的熊果酸溶液滴加至上述溶液中，并在磁力攪拌下30 min。按照殼聚糖與三聚磷酸鈉的質(zhì)量比5∶1將質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的三聚磷酸鈉溶液緩慢滴加到混合溶液中，并磁力攪拌45 min以獲得熊果酸殼聚糖納米顆粒懸浮液。將納米顆粒懸浮液以12 000 r/min離心20 min，并用蒸餾水洗滌沉淀物以除去未結(jié)合的熊果酸，然后噴霧干燥，將獲得的負(fù)載熊果酸的殼聚糖納米顆粒粉末存儲在干燥器中直至分析。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

配制成1 mg/mL的熊果酸儲備液，分別稱取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL儲備液，用乙醇定容至10 mL 容量瓶中，得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以乙醇作空白對照，在210 nm波長下測定溶液吸光度。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=8.097 1X-0.015 1,R2=0.999 3。其中Y為吸光度，X為熊果酸質(zhì)量濃度。

1.3.3 熊果酸殼聚糖納米顆粒包埋率的測定

參考文獻(xiàn)[17]的方法，取熊果酸殼聚糖納米粒懸液于10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，分離上清液，將沉淀物用蒸餾水洗滌3次。向沉淀物中加入乙醇，超聲處理15 min，然后用高速離心機(jī)以10 000 r/min離心15 min，適當(dāng)稀釋，用紫外可見分光光度計測定離心后的上清液在210 nm波長處的吸光度，并通過熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算熊果酸含量。包埋率根據(jù)公式(1)計算：

(1)

式中：M總為添加的熊果酸總量，mg；M為殼聚糖納米顆粒負(fù)載的熊果酸質(zhì)量，mg。

1.3.4 熊果酸殼聚糖納米顆粒的工藝優(yōu)化

1.3.4.1 單因素試驗

(1)殼聚糖質(zhì)量濃度對熊果酸殼聚糖納米顆粒包埋率的影響

分別選取1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mg/mL的殼聚糖質(zhì)量濃度，按照殼聚糖與熊果酸3∶1的質(zhì)量比添加熊果酸，按照殼聚糖與三聚磷酸鈉5∶1的質(zhì)量比，添加2.0 mg/mL的三聚磷酸鈉溶液，制備熊果酸殼聚糖納米顆粒，研究不同質(zhì)量濃度的殼聚糖對熊果酸殼聚糖納米顆粒包埋率的影響。

(2)殼聚糖與熊果酸質(zhì)量比對熊果酸殼聚糖納米顆粒包埋率的影響

采用3.0 mg/mL的殼聚糖質(zhì)量濃度，按照殼聚糖與熊果酸的質(zhì)量比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1和5∶1添加熊果酸，按照殼聚糖與三聚磷酸鈉的質(zhì)量比5∶1添加2.0 mg/mL的三聚磷酸鈉溶液，制備熊果酸殼聚糖納米顆粒，研究殼聚糖與熊果酸的不同質(zhì)量比對熊果酸殼聚糖納米顆粒包埋率的影響。

(3)殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比對熊果酸殼聚糖納米顆粒包埋率的影響

采用3.0 mg/mL的殼聚糖質(zhì)量濃度，按照殼聚糖與熊果酸質(zhì)量比為3∶1添加熊果酸，分別按照殼聚糖與三聚磷酸鈉的質(zhì)量比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1和5∶1，添加2.0 mg/mL的三聚磷酸鈉溶液，制備熊果酸殼聚糖納米顆粒，研究殼聚糖與三聚磷酸鈉的不同質(zhì)量比對熊果酸殼聚糖納米顆粒包埋率的影響。

1.3.4.2 正交試驗

在上述單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇殼聚糖溶液質(zhì)量濃度、殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比和殼聚糖與熊果酸質(zhì)量比3個因素為試驗因素進(jìn)行L9(34)正交試驗設(shè)計，考察因素與水平如表1所示，以熊果酸包埋率為指標(biāo)確定最佳制備條件。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels in the orthogonal design

1.3.5 熊果酸殼聚糖納米顆粒表征及溶出度測定

1.3.5.1 掃描電子顯微鏡分析

將通過噴霧干燥得到的熊果酸殼聚糖納米顆粒粉末粘在導(dǎo)電膠上，用掃描電子顯微鏡觀察負(fù)載熊果酸殼聚糖納米顆粒的微觀結(jié)構(gòu)和表面形態(tài)[18]。

1.3.5.2 粒徑測定

通過馬爾文激光粒度儀測量負(fù)載熊果酸殼聚糖納米顆粒的粒徑。稱取適量的殼聚糖納米顆粒粉末，用超純水適當(dāng)稀釋后放于樣品池，于室溫下測定[19]。

1.3.5.3 體外溶出度測定

將負(fù)載熊果酸殼聚糖納米顆粒添加到裝有模擬胃液(pH=2.0, 0.01 mol/L HCI和0.09 mol/L NaCl)和模擬腸液(pH=6.9, 0.07 mol/L KH2PO4和0.2 mol/L NaOH)的燒杯中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中以120 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌，在適當(dāng)?shù)臅r間間隔對懸浮液進(jìn)行采樣，并用等體積的新鮮溶出介質(zhì)代替，取出的樣品用紫外可見分光光度計分析[20-21]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

每組試驗平行進(jìn)行3次，使用Origin 2017軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用DPS 7.05軟件進(jìn)行方差分析，為了確定組樣本之間的顯著差異，置信區(qū)間選擇為95%(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 殼聚糖質(zhì)量濃度對包埋率的影響

由圖1可知，隨著殼聚糖質(zhì)量濃度的增大，負(fù)載熊果酸的殼聚糖納米顆粒的包埋率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)殼聚糖溶液質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時，帶正電荷的殼聚糖氨基基團(tuán)通過離子凝膠法與帶負(fù)電荷的三聚磷酸鈉的磷酸基團(tuán)相互作用最強，因此負(fù)載熊果酸的殼聚糖納米顆粒的包埋率較高。殼聚糖分子在酸性溶液中會電離出帶正電荷的氨基基團(tuán)，隨著殼聚糖溶液濃度質(zhì)量增加，殼聚糖分子表面會帶更多的正電荷，熊果酸分子被包埋的機(jī)會增大。但殼聚糖溶液濃度過高，溶液體系黏度增大，會阻礙熊果酸分子在殼聚糖分子周圍運動，導(dǎo)致高殼聚糖質(zhì)量濃度時熊果酸的包埋率下降。

圖1 殼聚糖濃度對熊果酸包埋率的影響Fig.1 Effect of chitosan solution concentration on encapsulation efficiency of ursolic acid

2.1.2 殼聚糖與熊果酸的質(zhì)量比對包埋率的影響

芯材與壁材的質(zhì)量比例對殼聚糖納米顆粒的包埋率有直接影響[22]。芯壁比對負(fù)載熊果酸的殼聚糖納米顆粒包埋率的影響見圖2。如圖2所示，包埋率隨著殼聚糖與熊果酸質(zhì)量比的增大而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在殼聚糖與熊果酸質(zhì)量比為3∶1時包埋率達(dá)到最佳。這是由于隨著芯壁比的增大，包裹在熊果酸周圍的壁材的量逐漸減少，導(dǎo)致殼聚糖納米顆粒的機(jī)械性能降低，囊壁的厚度逐漸變薄，熊果酸泄露，因此包埋率降低[23]。

圖2 殼聚糖與熊果酸的質(zhì)量比對熊果酸包埋率的影響Fig.2 Effect of mass ratio of chitosan to ursolic acid on encapsulation efficiency of ursolic acid

2.1.3 殼聚糖與三聚磷酸鈉的質(zhì)量比對包埋率的影響

如圖3所示，隨著殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比的增加，負(fù)載熊果酸的殼聚糖納米顆粒的包埋率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比為5∶1時，溶液中殼聚糖分子帶的正電荷氨基基團(tuán)與三聚磷酸鈉帶的負(fù)電荷磷酸基團(tuán)之間充分交聯(lián)反應(yīng)，負(fù)載熊果酸的殼聚糖納米顆粒包埋率較高。殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比過高，即溶液中三聚磷酸鈉加入量過低，三聚磷酸鈉分子帶的負(fù)電荷磷酸基團(tuán)不足以與殼聚糖帶的正電荷氨基基團(tuán)交聯(lián)形成納米顆粒，因此當(dāng)殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比高于5∶1，熊果酸的包埋率呈現(xiàn)下降的趨勢。

圖3 殼聚糖與三聚磷酸鈉的質(zhì)量比對熊果酸包埋率的影響Fig.3 Effect of mass ratio of chitosan to sodium tripolyphosphate on encapsulation efficiency of ursolic acid

2.2 正交試驗結(jié)果分析

為篩選出制備負(fù)載熊果酸的殼聚糖納米顆粒的最佳條件，在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗，正交試驗結(jié)果及方差分析分別如表2和表3所示。根據(jù)極差分析可知,各因素對殼聚糖納米顆粒包埋率的影響順序為：殼聚糖與熊果酸質(zhì)量比>殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比>殼聚糖溶液質(zhì)量濃度，比較各因子的k值可知，獲得最大負(fù)載熊果酸的殼聚糖納米顆粒包埋率的最優(yōu)組合為：A2B3C1。根據(jù)方差分析可知，殼聚糖與熊果酸質(zhì)量比對包埋率影響極顯著(P<0.01)，殼聚糖質(zhì)量濃度和殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比對包埋率影響顯著(P<0.05)。制備負(fù)載熊果酸的殼聚糖納米顆粒的最佳條件為殼聚糖與熊果酸質(zhì)量比為4∶1，殼聚糖溶液質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL，殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比為4∶1，此條件下熊果酸的包埋率為79.52%。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experimental

表3 試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of experimental

2.3 結(jié)構(gòu)表征

為進(jìn)一步表征熊果酸在殼聚糖納米顆粒最佳制備條件下的包埋形貌，通過掃描電鏡觀察該納米顆粒的外觀(圖4)。干燥后的負(fù)載熊果酸的殼聚糖納米顆粒是球形，具有相對光滑的表面。顆粒分布相對均勻，表明離子凝膠法能有效地制備負(fù)載熊果酸的殼聚糖納米顆粒。

圖4 負(fù)載熊果酸的殼聚糖納米顆粒掃描電鏡圖Fig.4 Scanning electron micrograph of ursolic acid loaded chitosan nanoparticles

負(fù)載熊果酸的殼聚糖納米顆粒的粒徑分布如圖5所示。由圖5可知，負(fù)載熊果酸的殼聚糖納米顆粒的粒徑在180 nm左右，與文獻(xiàn)報道的采用自組裝方法制備的粒徑在200～300 nm的靶向羧甲基殼聚糖-熊果酸納米藥物相近[24]。殼聚糖納米顆粒粒徑越小，包埋率越高且具有緩釋作用[5]。負(fù)載熊果酸的殼聚糖納米顆粒的多分散指數(shù)為0.476±0.03，其粒徑呈正態(tài)分布且分布較窄，說明殼聚糖納米顆粒分布相對均勻和集中。

圖5 負(fù)載熊果酸的殼聚糖納米顆粒的粒徑分布Fig.5 Particle size distribution of ursolic acid loaded chitosan nanoparticles

2.4 體外溶出度分析

熊果酸和負(fù)載熊果酸的殼聚糖納米顆粒在模擬胃腸液中的溶出度如圖6所示。由圖6可知，熊果酸在模擬胃液和模擬腸液中的溶出度均低于10%，而負(fù)載熊果酸的殼聚糖納米顆粒在模擬胃腸液中的溶出度分別為55.8%和16.9%，分別是熊果酸原藥的4.7倍和1.1倍。表明負(fù)載熊果酸殼聚糖納米顆粒的溶解速率顯著高于未包埋的熊果酸，殼聚糖納米顆粒包埋熊果酸可以顯著提高熊果酸的溶解度。

圖6 負(fù)載熊果酸的殼聚糖納米顆粒在模擬 胃腸液中的溶出度Fig.6 Dissolution of ursolic acid loaded chitosan nanoparticles in simulated gastrointestinal fluid

3 結(jié)論

本文通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化了離子凝膠法制備殼聚糖納米顆粒的工藝，得到最佳制備工藝參數(shù)為：殼聚糖溶液質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，殼聚糖與熊果酸質(zhì)量比為4∶1，殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比為4∶1，此時的熊果酸包埋率為79.52%。在最佳制備條件下，負(fù)載熊果酸的殼聚糖納米顆粒呈表面光滑的球形，粒徑在180 nm左右，且分布較窄。負(fù)載熊果酸的殼聚糖納米顆粒在模擬胃腸液中的溶出度顯著提高。因此，利用正交試驗優(yōu)化的負(fù)載熊果酸殼聚糖納米顆粒的制備工藝可以有效提升熊果酸的溶出度。