高澤鑫，孫武，胥聆銘，張蕾蕾，朱莉，詹曉北

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

細(xì)菌胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)是由細(xì)菌在發(fā)酵中產(chǎn)生的胞外多糖，可以低成本大量生產(chǎn)。大多數(shù)細(xì)菌EPS是高分子質(zhì)量多糖，通常由多個(gè)重復(fù)的糖單元組成，這些多糖在食品工業(yè)中廣泛用作懸浮劑，增稠劑和穩(wěn)定劑等[1]。EPS是生物膜的重要組成部分，具有多樣化的結(jié)構(gòu)特征和生物活性，因此受到了廣泛的關(guān)注[2-3]。目前，在許多種革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性的細(xì)菌中都發(fā)現(xiàn)了EPS的產(chǎn)生[4]。

芽孢桿菌是一個(gè)重要的細(xì)菌屬，具有耐酸、耐堿、耐高溫高壓和貯存時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)[5]。目前，有關(guān)EPS應(yīng)用的芽孢桿菌包括解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等。此外，蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)產(chǎn)生的伴胞晶體蛋白可以有效殺死多種害蟲(chóng)，但對(duì)人、畜類(lèi)、禽類(lèi)和水生動(dòng)物無(wú)毒，因此廣泛應(yīng)用于生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)[6]。然而，對(duì)B.thuringiensis產(chǎn)的EPS研究卻很少。

大分子的多糖在胃和小腸中不易消化，但可被腸道微生物部分或完全水解[7]。多糖能滋養(yǎng)和調(diào)節(jié)多種腸道微生物種群，誘導(dǎo)其多樣性和豐度的變化[8]。研究表明，腸道微生物對(duì)人類(lèi)健康起著重要作用，包括維持腸道屏障的完整性、調(diào)節(jié)宿主免疫力、抑制腸道病原體和促進(jìn)維生素的合成[9]。因此，保持腸道微生物的多樣性和保護(hù)微生態(tài)平衡對(duì)調(diào)節(jié)宿主健康至關(guān)重要。腸道微生物可以將多糖發(fā)酵形成短鏈脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)，主要成分是乙酸、丙酸和丁酸，它們?cè)诖x方面具有重要的作用[10]。乙酸是結(jié)腸上皮細(xì)胞的能量來(lái)源，并能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性[11]。丙酸在肝臟中的脂肪酸代謝和增強(qiáng)胰島素敏感性方面具有關(guān)鍵作用[12]。而丁酸可以通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)來(lái)改善腸道屏障功能的完整性[13]。

本文介紹了從郫縣豆瓣中分離出的B.thuringiensisIX-01采用高密度發(fā)酵法生產(chǎn)EPS，對(duì)提純后的BPS-2進(jìn)行體外細(xì)胞毒性分析，在確認(rèn)其無(wú)細(xì)胞毒性的基礎(chǔ)上通過(guò)10個(gè)健康人混合糞便微生物的體外靜態(tài)發(fā)酵探究了其EPS的益生功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種：從中國(guó)成都市郫都區(qū)市售豆瓣中分離出1株富含EPS的菌株，通過(guò)生理生化和16S rRNA分析，鑒定為B.thuringiensis被命名為IX-01，菌株已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC M 2020486)，16S rRNA基因序列被保存在GenBank(NCBI)中，登錄號(hào)為OL687443。

人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞(HcoEpiC)從中國(guó)科學(xué)院上海分院獲得。

單糖標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司；DEAE-Sepharose Fast Flow，索萊寶科技有限公司；Superdex 200，GE Healthcare公司；DMEM培養(yǎng)基，?？寺∩锘瘜W(xué)制品有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

B.thuringiensisIX-01的種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 1.0，胰蛋白胨 1.0，K2HPO40.025，KH2PO40.05，NaCl 0.5，pH 6.5。

B.thuringiensisIX-01的發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 111.24，大豆蛋白胨 9.64，BaSO40.24，K2HPO40.025，KH2PO40.05，NaCl 0.5。

腸道厭氧基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 2.0，酵母提取物 2.0，NaHCO32.0，NaCl 0.1，KH2PO40.04，K2HPO40.04，L-半胱氨酸鹽酸鹽 0.5，牛膽鹽 0.5，CaCl20.01，MgSO40.01，血紅素 0.025，刃天青0.001，維生素K 0.002，吐溫80 2。

1.2 儀器與設(shè)備

Bio Flo 115發(fā)酵罐，美國(guó)New Brunswick Scientific公司；HYQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；Waters 600高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；ICS5000離子色譜儀，美國(guó)戴安公司；7890A氣相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；IX53倒置生物顯微鏡，日本奧林巴斯公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 EPS的生產(chǎn)

將IX-01的單個(gè)菌落接種到含有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在200 r/min和37 ℃下培養(yǎng)12 h，種子培養(yǎng)物接種于7-L發(fā)酵罐中。初始發(fā)酵培養(yǎng)基體積為4 L，種子接種量為10%(體積分?jǐn)?shù))。在發(fā)酵過(guò)程中，溫度保持在30 ℃，通過(guò)添加2.0 mol/L氨水使pH值保持在6.5。發(fā)酵開(kāi)始前加入111.24 g葡萄糖，在發(fā)酵后的3 h內(nèi)不添加葡萄糖。通過(guò)生物傳感分析儀監(jiān)測(cè)葡萄糖濃度，并調(diào)整相應(yīng)的葡萄糖進(jìn)料速度。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程共分為3個(gè)階段：0～18 h，攪拌速度250 r/min，通氣量為3 L/min；18～56 h，攪拌速度300 r/min，通氣量為4 L/min；56～72 h，攪拌速度350 r/min，通氣量為5 L/min。

1.3.2 EPS的提取

將發(fā)酵液11 000 ×g離心20 min，取上清液。先加入5 g/L胰蛋白酶和5 g/L胃蛋白酶在37 ℃下100 r/min反應(yīng)4 h，再加入5 g/L木瓜蛋白酶在 60 ℃下100 r/min反應(yīng)2 h。后加入Savage試劑[V(氯仿)∶V(正丁醇) = 4∶1]以體積比3∶1 混勻振蕩20 min，以5 000 r/min離心10 min收集上清液，將上清液用此方法重復(fù)8次，得到去除蛋白質(zhì)的上清液。再把上清液與4倍體積的無(wú)水乙醇混合，在4 ℃下放置24 h。收集沉淀并溶解在去離子水中，得到粗EPS溶液，在去離子水中透析72 h，凍干。將粗制的EPS(0.5 g)重新溶解在5 mL的去離子水中，注入DEAE-Sepharose快速流動(dòng)柱(1.6 cm × 50 cm)，用去離子水洗脫，然后用NaCl溶液(0.1～1 mol/L)進(jìn)行洗脫，流速為60 mL/h，收集餾分通過(guò)蒽酮-硫酸法測(cè)量糖含量。最后，將主要的碳水化合物組分通過(guò)Superdex 200柱(3.5 cm×100 cm)純化，使用去離子水進(jìn)行洗脫，流速為20 mL/h，得到一種EPS，命名為BPS-2。

1.3.3 BPS-2組成分析

用蒽酮-硫酸法和Bradford法分別測(cè)定了BPS-2的總糖和總蛋白含量[14-15]。采用高效凝膠滲透色譜法進(jìn)行測(cè)量多糖的分子質(zhì)量，通過(guò)Waters 600高效液相色譜儀，該儀器配有2410示差折光檢測(cè)器和Empower 工作站，Ultrahydrogel Linear(300 mm×7.8 mm)凝膠柱，柱溫保持在45.0 ℃，流速維持在0.95 mL/min，使用0.1 mol/L NaNO3作為流動(dòng)相，樣品制備為3 mg/mL的溶液。單糖組成測(cè)定的具體方法為：取5 mg BPS-2在安培瓶中加入300 μL的三氟乙酸(2 mol/L)在110 ℃中水解10 h。然后，通過(guò)氮?dú)獬ト宜幔瑢堄辔镉眉状既芙?，通過(guò)氮?dú)飧稍?，重?fù)以上操作3次。最后，將殘留物溶解在去離子水中，并使用0.22 μm膜過(guò)濾后進(jìn)行分析。通過(guò)CarboPac PA20色譜柱在Dionex離子色譜系統(tǒng)(ICS 5000)中檢測(cè)水解產(chǎn)物和1 g/L單糖標(biāo)準(zhǔn)品(葡萄糖，半乳糖，氨基葡萄糖，巖藻糖，果糖，木糖，甘露糖，鼠李糖和阿拉伯糖)的保留時(shí)間和峰面積，最終獲得BPS-2的單糖組成及其含量。

1.3.4 細(xì)胞毒性分析

HcoEpiC細(xì)胞維持在DMEM培養(yǎng)基中，在孵化器中補(bǔ)充10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，青霉素(100 μg/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)，并在37 ℃下，5%CO2的潮濕環(huán)境中孵育。通過(guò)四唑鹽(MTT)法體外評(píng)估BPS-2對(duì)HcoEpiC細(xì)胞的毒性。HcoEpiC細(xì)胞經(jīng)過(guò)0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶消化后調(diào)整細(xì)胞濃度到3×104細(xì)胞/孔，在裝有0.1 mL培養(yǎng)基的96孔板中于37 ℃，5%CO2的潮濕環(huán)境中孵育。使HcoEpiC細(xì)胞黏附24 h，形成部分單層。然后甩出上清液，并用100 μL培養(yǎng)基洗滌單層。用培養(yǎng)基分別制備100 μL不同質(zhì)量濃度(100、75、50、25 μg/mL)的BPS-2溶液，并將其添加到各個(gè)孔中。每24 h進(jìn)行顯微鏡檢查并記錄觀察結(jié)果。培養(yǎng)48 h后，除去含BPS-2溶液的培養(yǎng)基。然后將附著的細(xì)胞在含有10 μL MTT溶液的培養(yǎng)基中孵育3 h。除去培養(yǎng)基后，加入200 μL的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，于搖床室溫振蕩10 min。用Thermo酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度。

1.3.5 利用人糞便微生物菌群體外發(fā)酵BPS-2

用無(wú)菌糞便收集管采集10名健康的志愿者(5男5女，年齡25～30歲)的糞便。將這10份新鮮糞便在厭氧環(huán)境下等量混合后，用無(wú)菌PBS稀釋?zhuān)玫郊S便勻漿10 g/mL。在無(wú)菌條件下通過(guò)4層紗布過(guò)濾去除殘?jiān)?，將糞便勻漿接種到不同組的腸道厭氧基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中。陰性對(duì)照組為腸道厭氧基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(無(wú)碳源)，實(shí)驗(yàn)組分別以菊粉(陽(yáng)性對(duì)照)和BPS-2為碳源添加到腸道厭氧基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，質(zhì)量濃度均為5 g/mL。37 ℃孵育48 h。在發(fā)酵0、24、48 h分別采集樣品進(jìn)一步分析。

將250 μL HCl溶液和1 mL的無(wú)水乙醚添加到1 mL 發(fā)酵上層清液液，向體系中加入0.1 mL 2-乙基丁酸內(nèi)標(biāo)溶液(0.1 mg/mL)后劇烈搖動(dòng)溶液5 min來(lái)制備樣品溶液。取上層有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉脫水，收集上清液，通過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾。采用HP-INNOWAX柱的氣相色譜儀分析SCFAs。進(jìn)樣器參數(shù)設(shè)置：烘箱溫度為60 ℃，在4 min內(nèi)升至190 ℃。注入器溫度設(shè)置為220 ℃，檢測(cè)器溫度設(shè)置為250 ℃。每個(gè)樣品5 μL，流速1.5 mL/min，分流比1∶20。根據(jù)每個(gè)SCFA與內(nèi)標(biāo)的峰面積比繪制校準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)標(biāo)定曲線(xiàn)，根據(jù)峰面積比計(jì)算樣品中SCFAs的濃度。

1.3.7 16S rRNA基因測(cè)序

采用QIAamp DNA Stool Mini Kit提取細(xì)菌基因組DNA。采用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴(kuò)增16S rRNA基因的V3～V4區(qū)。通過(guò)TruSeq-DNA PCR-Free樣品制備試劑盒生成測(cè)序文庫(kù)，并用MiSeq PE250平臺(tái)進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。分別使用FLASH(v1.2.7)和Qiime(v1.9.1)進(jìn)行配對(duì)末端讀段的組裝和質(zhì)量控制。利用Uparse算法(Uparse v7.0.1001)對(duì)所有樣本的全部 Effective Tags進(jìn)行聚類(lèi)，默認(rèn)以97%的一致性(identity)將序列聚類(lèi)成為操作分類(lèi)單元(operational taxonomic units，OTUs)，同時(shí)會(huì)選取OTUs的代表性序列，依據(jù)其算法原則，篩選的是OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。對(duì)OTUs序列進(jìn)行物種注釋?zhuān)肕othur方法與SILVA138(http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析，獲得分類(lèi)學(xué)信息并分別在門(mén)水平、屬水平上統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。所有的原始序列都存放在NCBI中，序列號(hào)為SAMN23526837-SAMN23526848。

1.3.8 α多樣性分析與β多樣性分析

使用Qiime軟件(v1.9.1)計(jì)算Chao1，Shannon，Simpson和ACE指數(shù)，使用R軟件(v2.15.3)進(jìn)行α多樣性指數(shù)組間差異分析，檢測(cè)方法選用Tukey檢驗(yàn)。

用Qiime軟件(v1.9.1)計(jì)算Unifrac距離，使用R軟件(v2.15.3)進(jìn)行β多樣性指數(shù)組間差異分析，使用R軟件繪制主成分分析(principal component analysis，PCA)圖。PCA使用R軟件的ade4包和ggplot2軟件包，檢測(cè)方法選用Tukey檢驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用Origin 2018軟件作圖，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行Tukey′s test，P<0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中差異顯著。

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2 結(jié)果與分析

2.1 7-L發(fā)酵罐分批發(fā)酵

通過(guò)7-L發(fā)酵罐對(duì)B.thuringiensisIX-01進(jìn)行分批發(fā)酵，探究了菌種在高密度環(huán)境下對(duì)EPS生產(chǎn)的影響。眾所周知，碳源的加入與EPS產(chǎn)量有很大的關(guān)系，為了提高葡萄糖的利用率，在EPS的生產(chǎn)中采用了碳饑渴的調(diào)控機(jī)制。在發(fā)酵到17～21 h時(shí)，通過(guò)線(xiàn)下監(jiān)控維持發(fā)酵罐中葡萄糖含量在1 g/L以下，此時(shí)EPS產(chǎn)量迅速降低，在發(fā)酵進(jìn)行到26 h時(shí)，細(xì)胞干重(dry cell weight,DCW)達(dá)到峰值并在之后的發(fā)酵過(guò)程中維持在23～26 g/L(圖1-A)。結(jié)果表明，在細(xì)胞濃度處于一個(gè)高水平時(shí)，會(huì)大量消耗周?chē)囊磺叙B(yǎng)分，從而導(dǎo)致了EPS含量降低。因此，通過(guò)控制碳源的補(bǔ)加策略在提高細(xì)胞濃度的同時(shí)降低了細(xì)胞整體的碳饑渴程度。

該策略不僅使B.thuringiensisIX-01能達(dá)到高密度發(fā)酵要求，而且為產(chǎn)生更多EPS創(chuàng)造了有利條件。當(dāng)碳饑渴時(shí)間為4 h，發(fā)酵72 h時(shí)，IX-01的EPS產(chǎn)量達(dá)到最大(16.19±0.55)g/L，同時(shí)該組的葡萄糖調(diào)控結(jié)果是所有試驗(yàn)組中的最佳值(圖1-B)。

A-維持碳饑餓4 h的情況下的發(fā)酵結(jié)果；B-不同的碳饑餓 時(shí)間對(duì)EPS生產(chǎn)的影響圖1 7-L發(fā)酵罐水平、葡萄糖調(diào)控對(duì)EPS生產(chǎn)的影響Fig.1 The influence of 7-L fermenter level, glucose regulation on EPS production.

2.2 EPS的分離純化與成分分析

粗制的EPS經(jīng)DEAE-Sepharose快速流動(dòng)柱純化，用純水和不同濃度NaCl洗脫。如圖2-A所示，EPS關(guān)鍵組分在NaCl緩慢增加到0.2 mol/L時(shí)被洗脫下來(lái)。收集的EPS關(guān)鍵組分再通過(guò)Superdex 200色譜柱用水進(jìn)行洗脫，洗脫曲線(xiàn)見(jiàn)圖2-B，洗脫后得到1個(gè)吸光度值最大的組分，命名為BPS-2。

A-DEAE-Sepharose快速流動(dòng)柱的洗脫曲線(xiàn)；B-Superdex 200 色譜柱的洗脫曲線(xiàn)圖2 BPS-2的純化洗脫曲線(xiàn)Fig.2 Purification elution curves of BPS-2

根據(jù)蒽酮-硫酸法和考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得的BPS-2總糖和蛋白含量分別為(91.29±3.71)%、(1.31±0.27)%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。分子質(zhì)量與單糖組成結(jié)果表明，BPS-2的分子質(zhì)量為27.96 kDa，主要由氨基半乳糖、阿拉伯糖、氨基葡萄糖、葡萄糖和甘露糖組成，摩爾百分比為5.53∶1.77∶4.74∶3.24∶1。

RAMAMOORTHY等[16]從海洋中篩選得到一株B.thuringiensisRSK CAS4，通過(guò)搖瓶發(fā)酵后提取得到的EPS由果糖(43.8%)，半乳糖(20%)，木糖(17.8%)，葡萄糖(7.2%)，鼠李糖(7.1%)和甘露糖(4.1%)組成。WANG等[17]選用一株B.thuringiensis4D19通過(guò)搖瓶發(fā)酵后提取得到了一種EPS，其單糖組成是甘露糖(44.2%)、氨基葡萄糖(35.5%)、氨基半乳糖(8.0%)、葡萄糖(5.5%)、阿拉伯糖(5.1%)、半乳糖(0.9%)、甘露糖醛酸(0.3%)和葡萄糖醛酸(0.2%)。本研究得到的BPS-2分子質(zhì)量和單糖組成與以往報(bào)道均不同，表現(xiàn)出其EPS的特異性，其中氨基糖(氨基葡萄糖與氨基半乳糖)的占比達(dá)到63.1%。這可能是由于B.thuringiensisIX-01在高密度發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)氨水調(diào)控pH誘導(dǎo)的。

2.3 BPS-2的細(xì)胞毒性分析

微生物EPS與化學(xué)合成分子相比幾乎沒(méi)有副作用，但關(guān)于EPS對(duì)多種類(lèi)型細(xì)胞的特異性和非特異性細(xì)胞毒性仍需要得到重視。EPS和細(xì)胞的生物相容性是評(píng)估EPS生物活性的一個(gè)重要前提條件。由于B.thuringiensisIX-01是從傳統(tǒng)發(fā)酵食品郫縣豆瓣中篩選的，從菌株來(lái)源來(lái)上分析是安全的。但B.thuringiensis以往的研究報(bào)告多用于生物農(nóng)藥方向，其菌株產(chǎn)EPS的安全性評(píng)估的研究極少。

考慮到BPS-2作為一種潛在益生元，我們?cè)谘芯恐羞x用HcoEpiC細(xì)胞通過(guò)MTT法進(jìn)行了體外細(xì)胞毒性的測(cè)試。如圖3-A所示，隨著B(niǎo)PS-2的反應(yīng)濃度不斷升高，均未表現(xiàn)出對(duì)HcoEpiC細(xì)胞的顯著抑制作用，細(xì)胞形態(tài)均未表現(xiàn)出形變。同時(shí)，隨反應(yīng)時(shí)間的增加，也未表現(xiàn)出對(duì)HcoEpiC細(xì)胞的顯著抑制作用，細(xì)胞生存率均在98%以上(圖3-B、圖3-C)。結(jié)果表明，B.thuringiensisIX-01產(chǎn)的BPS-2無(wú)細(xì)胞毒性。

A-BPS-2與HcoEpiC細(xì)胞的相互作用(比例尺=100 μm)；B-HcoEpiC細(xì)胞的生存能力(24 h)；C-HcoEpiC細(xì)胞的生存能力(48 h)圖3 BPS-2與HcoEpiC細(xì)胞的毒性分析Fig.3 Toxicity analysis of BPS-2 with HcoEpiC cells.注：相同小寫(xiě)字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.4 BPS-2對(duì)SCFAs的影響

SCFAs是腸道微生物群的主要代謝產(chǎn)物，參與宿主的各種生理過(guò)程，包括保護(hù)腸道屏障，調(diào)節(jié)肝臟中脂質(zhì)代謝，以及調(diào)節(jié)激素釋放[18]。本研究中，用健康人的糞便細(xì)菌在厭氧管中進(jìn)行菊粉、BPS-2和空白的體外發(fā)酵，在發(fā)酵0、24、48 h后測(cè)定SCFAs濃度(圖4)。

A-乙酸；B-丙酸；C-丁酸；D-總SCFAs圖4 不同碳源與糞菌發(fā)酵后SCFAs濃度的變化Fig.4 Changes in the concentration of SCFAs after fermentation with different carbon sources and fecal bacteria

眾所周知，菊粉是天然的益生元，同時(shí)是理想的功能性食品配料，因此本研究選用菊粉作為BPS-2的陽(yáng)性對(duì)照。在發(fā)酵48 h時(shí)，菊粉和BPS-2產(chǎn)生的總SCFAs濃度分別為(50.12±0.85)、(50.59±1.54) mmol/L(圖4-D)，顯著高于0 h時(shí)CK(陰性對(duì)照)組中的總SCFAs濃度(P<0.05)，這一結(jié)果表明，BPS-2與菊粉均能顯著提高糞菌發(fā)酵過(guò)程中SCFAs的產(chǎn)量。但在發(fā)酵24 h時(shí)，菊粉的總SCFAs濃度遠(yuǎn)高于BPS-2，造成該情況原因可能是由于BPS-2分子質(zhì)量遠(yuǎn)高于菊粉，腸道微生物在接觸BPS-2初期無(wú)法迅速利用。在發(fā)酵48 h時(shí)，BPS-2產(chǎn)生的乙酸，丙酸和丁酸的含量分別為(31.59±0.73)、(10.82±0.65)、(8.18±0.2) mmol/L(圖4-A～圖4-C)，與CK相比，BPS-2和菊粉組中的乙酸，丙酸和丁酸濃度均顯著增加(P<0.05)。乙酸能夠保持腸道環(huán)境的穩(wěn)定，控制宿主食欲減少脂肪的產(chǎn)生，并有助于滋養(yǎng)腸道中產(chǎn)丁酸的細(xì)菌，促進(jìn)腸道有益菌群的多樣性[9]。在發(fā)酵48 h時(shí)，BPS-2的丙酸濃度顯著高于CK組(P<0.05)，同時(shí)其含量也明顯高于同時(shí)間的菊粉。丙酸是SCFAs 的重要組成成分，在宿主體內(nèi)可以通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞來(lái)達(dá)到降低肝臟和血漿中脂肪酸的水平[19]。在發(fā)酵48 h時(shí)，BPS-2組的丁酸濃度相較于CK組與菊粉組顯著升高(P<0.05)。丁酸是結(jié)腸細(xì)胞的重要供能物質(zhì)，起到維護(hù)腸道上皮屏障的功能穩(wěn)定，并通過(guò)刺激脂肪酸氧化基因的表達(dá)，降低肝臟中的總膽固醇[20]。有研究表明，丁酸在結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖和分化時(shí)起到了重要的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)丁酸具有誘導(dǎo)腸道癌細(xì)胞凋亡的作用[21]。

以上結(jié)果表明，BPS-2能促進(jìn)腸道微生物產(chǎn)生SCFAs，尤其是丙酸和丁酸的產(chǎn)生。

2.5 BPS-2對(duì)腸道微生物菌群的影響

現(xiàn)在越來(lái)越多的多糖被用于調(diào)節(jié)腸道微生物群，改善人類(lèi)的健康。LIU等[22]發(fā)現(xiàn)，蘆薈多糖能顯著增強(qiáng)小鼠糞便中SCFAs的產(chǎn)生，主要通過(guò)副桿菌屬(Parabacteroides)降解蘆薈多糖，對(duì)腸道微生物菌群產(chǎn)生有益的影響。本研究通過(guò)16S rRNA檢測(cè)腸道微生物菌群的變化。在體外厭氧發(fā)酵的情況下，評(píng)估了菊粉和BPS-2對(duì)糞便微生物菌群組成的影響。

如圖5-A所示，BPS(BPS-2)組的Shannon、Simpson和Chao1指數(shù)均顯著高于CK(空白)組(P<0.05)，表明BPS-2發(fā)酵相對(duì)于CK組而言，明顯提高了物種的多樣性。而PCA圖將CK、菊粉和BPS的發(fā)酵分成3個(gè)不相近的群組(圖5-B)，表明各組之間的糞便微生物菌群組成存在明顯差異。但腸道微生物在多糖代謝中的作用是復(fù)雜的，必須在門(mén)和屬的水平上進(jìn)行更加深入的研究。

糞便微生物組成在門(mén)水平上的變化如圖5-C所示，與CK組相比，BPS組和菊粉組的變形菌門(mén)(Proteobacteria)的相對(duì)豐度明顯降低。在BPS組的發(fā)酵過(guò)程中，擬桿菌門(mén)(Bacteriodetes)的相對(duì)豐度明顯高于菊粉和CK組。大分子多糖是Bacteriodetes的主要能量來(lái)源，參與人類(lèi)結(jié)腸的許多重要代謝活動(dòng)，其中Bacteriodetes產(chǎn)生的多糖降解酶要比厚壁菌門(mén)(Firmicutes)多，可水解不可消化的多糖以促進(jìn)SCFAs的產(chǎn)生[23]。因此，在有BPS-2的情況下，腸道微生物菌群的組成相對(duì)于菊粉來(lái)說(shuō)更有利于多糖的分解。

A-腸道微生物群的α多樣性；B-基于加權(quán)Unifrac距離的OTU水平的微生物群的PCA；C-門(mén)水平的菌群相對(duì)豐度； D-屬水平的菌群相對(duì)豐度圖5 空白組、菊粉組和BPS-2組分別與糞便細(xì)菌發(fā)酵期間(48 h)的細(xì)菌分類(lèi)概況Fig.5 Bacterial taxonomic profiles during CK, inulin and BPS-2 fermentations with fecal bacteria at 48 h

而糞便微生物組成在屬水平上的變化如圖5-D所示，與菊粉組相比，BPS組中巨球形菌屬(Megasphaera)、梭桿菌屬(Fusobacterium)和巨單胞菌屬(Megamonas)的相對(duì)豐度明顯降低(P<0.05)，而Parabacteroides的相對(duì)豐度相比于菊粉組與CK組顯著增加(P<0.05)。據(jù)報(bào)道，Megamonas是亞洲人群中的一個(gè)典型菌屬，但其高豐度與結(jié)腸癌的發(fā)病率明顯相關(guān)[24]。相對(duì)于菊粉組，BPS組也顯著降低了Fusobacterium的相對(duì)豐度(P<0.05)。Fusobacterium的高豐度對(duì)人類(lèi)來(lái)說(shuō)是不利的，與膽汁代謝異常和腸道炎癥相關(guān)[25]。在BPS-2發(fā)酵過(guò)程中，Parabacteroides成為核心群落。相關(guān)研究表明，腸道微生物群中的Parabacteroides可以通過(guò)產(chǎn)生乙酸來(lái)減少中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而達(dá)到減輕乙酰肝素酶對(duì)急性胰腺炎的不利影響[26]。

以上結(jié)果證實(shí)BPS-2可以作為一種潛在的益生元，在豐富有益菌Parabacteroides的同時(shí)抑制潛在的有害微生物群，如Megamonas和Fusobacterium。

3 結(jié)論

本文研究了B.thuringiensisIX-01產(chǎn)生的BPS-2，并對(duì)其作為益生元的特性進(jìn)行評(píng)價(jià)。以葡萄糖、大豆蛋白胨為主要原料，采用高密度發(fā)酵對(duì)IX-01進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，通過(guò)碳調(diào)控機(jī)制的優(yōu)化使EPS的產(chǎn)量達(dá)到最大(16.19±0.55) g/L。經(jīng)過(guò)純化后，BPS-2的總糖含量達(dá)到91.29%，蛋白質(zhì)含量為1.31%，其分子質(zhì)量為27.96 kDa。BPS-2單糖組成為氨基半乳糖、阿拉伯糖、氨基葡萄糖、葡萄糖和甘露糖，摩爾百分比為5.53∶1.77∶4.74∶3.24∶1。用HcoEpiC細(xì)胞對(duì)BPS-2的細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，在確認(rèn)BPS-2無(wú)明顯細(xì)胞毒性的基礎(chǔ)上進(jìn)行體外健康人的糞便菌群發(fā)酵，結(jié)果表明BPS-2可以顯著增加Parabacteroides的相對(duì)豐度，減少有害微生物菌群的豐度，如Megamonas和Fusobacterium，進(jìn)而參與改善腸道微生物菌群的組成。同時(shí)BPS-2在發(fā)酵過(guò)程中能被糞便菌群有效利用，并顯著增加SCFAs中丙酸與丁酸的產(chǎn)生。綜上，B.thuringiensisIX-01產(chǎn)生的BPS-2具有一定的益生功能。但離真正推廣到食品領(lǐng)域中還有很長(zhǎng)距離，接下來(lái)應(yīng)從體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)入手，為BPS-2在食品中應(yīng)用提供更加充分?jǐn)?shù)據(jù)和理論支持。