陳雪梅，王芳凌，明昆洋，勾選枝，黎 英

（1.龍巖學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖 364012；2.閩西特色農(nóng)產(chǎn)品精深加工公共服務(wù)平臺，福建 龍巖 364012）

黃秋葵（Abelmoschus esculentus）又名羊角豆、毛茄、咖啡黃葵，被稱為“綠色人參”[1]、“美人指”[2]，據(jù)研究調(diào)查表明，每100 g秋葵果莢中含蛋白質(zhì)2.10 g，碳水化合物8.20 g，脂肪0.20 g，粗纖維1.70 g，鈣84.00 mg，鐵1.20 mg，維生素B20.08 mg，維生素B10.04 mg，維生素C 47.00 mg[3]；秋葵果莢和秋葵籽中含有豐富的多酚類化合物，主要由黃酮醇衍生物和低聚兒茶酚組成，包括蘆丁、兒茶素、表兒茶素等，具有抗氧化、抗發(fā)炎性和抗菌等生理活性[4]；黃秋葵果莢中特有的黏液狀物質(zhì)主要由水溶性果膠、半乳聚糖和阿拉伯樹膠等多糖和少量糖蛋白組成[5]，不僅使其肉質(zhì)柔嫩、口感爽滑、風(fēng)味特殊，還可以刺激中樞神經(jīng)，加速血液循環(huán)、促進(jìn)新陳代謝，并能與膽固醇和膽汁酸結(jié)合，促進(jìn)有害物質(zhì)轉(zhuǎn)入肝臟代謝[3]。因此，黃秋葵作為一種食療蔬菜，長期食用具有健胃、保肝、強(qiáng)腎、抗氧化、降血脂、降膽固醇等作用，其特殊的營養(yǎng)價值和保健功效使其具有很好的市場開發(fā)前景。黃秋葵的收獲季節(jié)集中在7、8月份，處理不及時易褐變、纖維老化、肉質(zhì)粗老、失去食用價值，因此，為提高黃秋葵的利用率，以其為原料制作成泡菜具有重要的意義。

泡菜是我國的傳統(tǒng)美食，作為流行較廣的傳統(tǒng)民間食品，其歷史悠久、生產(chǎn)成本低、制作工藝簡單。但是，我國傳統(tǒng)家庭自制泡菜生產(chǎn)大多停留在自然發(fā)酵工藝上，這種工藝以復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境為基礎(chǔ)，不僅生產(chǎn)周期長，而且產(chǎn)品的品質(zhì)和安全性也得不到保證。受傳統(tǒng)工藝的限制，泡菜中的亞硝酸鹽含量居高不下，這一直是泡菜困擾大眾的食用安全問題，也是全民關(guān)注的焦點(diǎn)。關(guān)于泡菜中亞硝酸鹽含量的控制方法，目前有許多相關(guān)研究[6-8]。由于亞硝酸鹽主要是發(fā)酵初期雜菌生長繁殖產(chǎn)生的硝酸鹽還原酶所引起，因此，如何控制雜菌生長是關(guān)鍵。其中，篩選合適菌種、改變發(fā)酵方法是當(dāng)前研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。國內(nèi)外對乳酸菌降解亞硝酸鹽做了較多的研究[9-15]，有研究表明，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）等[16-23]都可以改變不同蔬菜泡菜亞硝峰的出現(xiàn)時間以及減少亞硝酸鹽的含量。

本研究以黃秋葵為主要原料，采用人工接種結(jié)合自然發(fā)酵工藝，利用植物乳桿菌發(fā)酵制作黃秋葵泡菜，研究亞硝酸鹽含量的變化，并研究發(fā)酵條件對亞硝酸鹽含量的影響，以期通過發(fā)酵工藝參數(shù)的控制減少亞硝酸鹽的含量來保證產(chǎn)品的安全，以期為工業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)營養(yǎng)、安全并具有保健作用的黃秋葵泡菜提供一定的理論基礎(chǔ)，也為廣大農(nóng)戶提供一種簡單且成本低的黃秋葵加工貯藏方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

黃秋葵、食鹽、白糖、花椒、辣椒、生姜、蒜等：市售；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CICC 21805：上海保藏生物技術(shù)中心。

1.1.2 主要試劑

亞硝酸鈉、四硼酸鈉、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、冰醋酸等（均為分析純）：西隴化工股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基[19]：蛋白胨10.0 g，牛肉粉5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸二銨2.0 g，乙酸鈉5.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，吐溫80 1.0 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 6.2～6.4，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-5800紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；SHP-250型生化培養(yǎng)箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HVE-50型壓力蒸汽滅菌器：廈門柏嘉生物科技有限公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；FA1004B電子天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；JYL-C19V料理機(jī)：九陽股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌發(fā)酵黃秋葵泡菜的制作工藝流程及操作要點(diǎn)[24-26]

操作要點(diǎn)：

清洗：選擇質(zhì)地脆嫩、無病蟲害的黃秋葵，清洗干凈。

整形、適度晾曬：除去果蒂等不宜食用的部分，適度晾曬去掉原料表面的明水后即可入壇泡制。

植物乳桿菌的擴(kuò)大培養(yǎng)：于超凈臺中將凍干菌粉甩至安瓿瓶底部，尖頭一側(cè)用酒精棉消毒后敲開，取0.2～0.3 mL無菌水至菌種管中，使菌粉溶解、混勻，用無菌吸頭吸出溶解液，接入5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)2 d；將活化后的植物乳桿菌接入100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下擴(kuò)大培養(yǎng)2～3 d，使得發(fā)酵液中的活菌數(shù)達(dá)到108～109CFU/mL。

入壇：將準(zhǔn)備就緒的黃秋葵裝入壇內(nèi)，裝至半壇時放入香料包，再裝黃秋葵至距壇口6 cm為止。在水中加入6%食鹽、2%糖和2%料酒，配制鹽鹵水，為了保脆，加入0.8%的乳酸鈣，同時按2%的接種量加入已活化的植物乳桿菌發(fā)酵液，混合均勻。將配制的鹽鹵水1 000 mL注入泡菜壇，淹沒黃秋葵。

水封：在泡菜壇水槽中加注15%食鹽水，蓋上壇口小碗。

發(fā)酵：將泡菜壇置于常溫（28 ℃）下發(fā)酵7 d，得到成品。

1.3.2 植物乳桿菌對黃秋葵泡菜亞硝酸鹽含量的影響

以自然發(fā)酵的黃秋葵泡菜為對照組（CK組），以接種植物乳桿菌發(fā)酵的黃秋葵泡菜為試驗(yàn)組（Lp組），發(fā)酵過程中，每24 h取樣測定亞硝酸鹽含量。

1.3.3 植物乳桿菌發(fā)酵黃秋葵泡菜工藝參數(shù)的優(yōu)化

為了減少亞硝酸鹽的含量，首先采用單因素試驗(yàn)，分別研究接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、發(fā)酵溫度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）、發(fā)酵時間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d）、鹽鹵水食鹽濃度（0、2%、4%、6%、8%、10%、12%）對黃秋葵泡菜亞硝酸鹽含量的影響。然后在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以亞硝酸鹽含量（Y）為響應(yīng)值，接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）及食鹽水濃度（D）為自變量，采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化黃秋葵泡菜的發(fā)酵工藝參數(shù)，以期通過控制發(fā)酵條件減少黃秋葵泡菜亞硝酸鹽的產(chǎn)生，使之含量在食用安全范圍之內(nèi)，同時縮短發(fā)酵周期。

1.3.4 亞硝酸鹽含量的測定

參照GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的紫外分光光度法測定亞硝酸鹽含量。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007、SPSS 20.0軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)并作圖，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果的平均值，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；響應(yīng)面試驗(yàn)采用Design-Expert 10.0.7軟件分析處理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌對黃秋葵泡菜亞硝酸鹽含量的影響

不同發(fā)酵組黃秋葵泡菜中亞硝酸鹽含量的變化見圖1。由圖1可知，CK組在發(fā)酵后的第4天，黃秋葵泡菜中的亞硝酸鹽含量達(dá)到最高，為17.58 mg/kg，發(fā)酵后期緩慢降低；Lp組發(fā)酵第2天時，黃秋葵泡菜中的亞硝酸鹽含量達(dá)到最高，為9.78 mg/kg，隨后迅速下降。與CK組相比，亞硝峰出現(xiàn)時間（4 d）較早，峰值較低，發(fā)酵周期較短，說明采用植物乳桿菌發(fā)酵可以使黃秋葵泡菜中的亞硝峰出現(xiàn)時間提前，縮短發(fā)酵期，同時降低亞硝酸鹽的含量，分析原因可能是接種植物乳桿菌發(fā)酵能使乳酸菌從發(fā)酵開始就成為優(yōu)勢菌，既能抑制其他雜菌的生長，同時生成的乳酸又降低了pH值，即使有亞硝酸鹽產(chǎn)生，在酸性條件下也能加速其還原和降解[26-27]。

圖1 黃秋葵泡菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的變化Fig.1 Changes of nitrite contents during pickled okra of fermentation groups process

2.2 植物乳桿菌發(fā)酵黃秋葵泡菜工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 接種量對亞硝酸鹽含量的影響

植物乳桿菌接種量對黃秋葵泡菜中亞硝酸鹽含量的影響見圖2。由圖2可知，隨著植物乳桿菌接種量的升高，黃秋葵泡菜中的亞硝酸鹽含量呈先下降后趨于平緩的趨勢，分析原因可能是接種量過低，植物乳桿菌降解亞硝酸鹽的能力弱，導(dǎo)致產(chǎn)品亞硝酸鹽殘留量較高；當(dāng)接種量＞3%之后，植物乳桿菌降解亞硝酸鹽的能力達(dá)到一定的極限，亞硝酸鹽含量不再下降。此外還有研究表明[24]，接種量還會影響黃秋葵泡菜的風(fēng)味，接種量過小，產(chǎn)品酸味不足，滋味和香氣較差；接種量過大，產(chǎn)品酸味過重，風(fēng)味不協(xié)調(diào)。因此，接種量選擇2%～4%較好。

圖2 接種量對黃秋葵泡菜亞硝酸鹽含量的影響Fig.2 Effect of inoculum on nitrite contents in pickled okra

2.2.2 發(fā)酵溫度對亞硝酸鹽含量的影響

發(fā)酵溫度對黃秋葵泡菜中亞硝酸鹽含量的影響見圖3。由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，黃秋葵泡菜中的亞硝酸鹽含量先下降后升高，分析原因可能是當(dāng)發(fā)酵溫度為20 ℃時，植物乳桿菌生長慢，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量少，產(chǎn)酸少，因此抑制雜菌的作用小，降解亞硝酸鹽的能力弱，最終泡菜的亞硝酸鹽殘留較高；當(dāng)發(fā)酵溫度在20～30 ℃范圍內(nèi)，乳酸菌生長繁殖就能達(dá)到一定的速度，亞硝酸鹽含量明顯降低；當(dāng)發(fā)酵溫度在30～35 ℃范圍內(nèi)，乳酸菌生長繁殖達(dá)到一定極限，亞硝酸鹽含量降低不明顯；隨溫度的繼續(xù)升高，當(dāng)發(fā)酵溫度高于35 ℃之后，亞硝酸鹽含量又有所回升，可見高溫抑制了植物乳桿菌的生長。因此，發(fā)酵溫度選擇25～35 ℃為宜。

圖3 發(fā)酵溫度對黃秋葵泡菜亞硝酸鹽含量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on nitrite contents in pickled okra

2.2.3 發(fā)酵時間對亞硝酸鹽含量的影響

發(fā)酵時間對黃秋葵泡菜中亞硝酸鹽含量的影響見圖4。由圖4可知，隨著發(fā)酵時間的延長，黃秋葵泡菜中的亞硝酸鹽含量先上升后下降。發(fā)酵時間為2 d時，黃秋葵泡菜中亞硝酸鹽出現(xiàn)峰值，達(dá)到8.78 mg/kg；隨著發(fā)酵時間的延長，亞硝酸鹽含量不斷下降，當(dāng)發(fā)酵時間＞4 d后，下降幅度變得緩慢，考慮到生產(chǎn)周期的成本，發(fā)酵時間選擇4～6 d為宜。

圖4 發(fā)酵時間對黃秋葵泡菜亞硝酸鹽含量的影響Fig.4 Effects of fermentation time on nitrite contents in pickled okra

2.2.4 食鹽水濃度對亞硝酸鹽含量的影響

食鹽水濃度對黃秋葵泡菜中亞硝酸鹽含量的影響見圖5。由圖5可知，隨著食鹽水濃度的增加，黃秋葵泡菜中的亞硝酸鹽含量呈先下降后上升的趨勢。當(dāng)食鹽水濃度為4%～8%時，亞硝酸鹽含量較低。分析原因可能是泡菜不加鹽，發(fā)酵早期會有大量的細(xì)菌雜菌快速生長繁殖，比乳酸菌生長更快，大量雜菌繁殖分泌較多的硝酸鹽還原酶，將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，從而導(dǎo)致泡菜亞硝酸鹽含量高。雜菌一般不耐鹽，添加一定濃度的食鹽即可抑制蔬菜表面附著的雜菌；但是當(dāng)食鹽濃度過高時，其產(chǎn)生的高滲透壓也會抑制乳酸菌的生長。食鹽不僅具有調(diào)節(jié)微生物生長的作用，還有調(diào)味的作用，食鹽濃度過高時，產(chǎn)品咸味重。因此，選擇適宜的食鹽水濃度在4%～8%。

圖5 食鹽水濃度對黃秋葵泡菜亞硝酸鹽含量的影響Fig.5 Effect of salt content in water on nitrite contents in pickled okra

2.3 植物乳桿菌發(fā)酵黃秋葵泡菜工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以亞硝酸鹽含量（Y）為響應(yīng)值，接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）、食鹽水濃度（D）為自變量，采用Design-Expert 10.0.7軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 植物乳桿菌發(fā)酵黃秋葵泡菜工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization of pickled okra by Lactobacillus plantarum

表2 植物乳桿菌發(fā)酵黃秋葵泡菜工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments for fermentation process optimization of pickled okra by Lactobacillus plantarum

續(xù)表

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

采用Design-Expert 10.0.7軟件對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項回歸擬合，得到響應(yīng)值與各因素之間的回歸方程：

由表3可知，回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），說明該模型方程與實(shí)際情況擬合程度良好，4個因素對黃秋葵泡菜亞硝酸鹽含量的影響的主次順序依次為C（發(fā)酵時間）＞A（接種量）＞D（食鹽水濃度）＞B（發(fā)酵溫度）；該模型方程的決定系數(shù)R2=0.966 2，校正決定系數(shù)R2Adj=0.932 5，說明該模型方程中4個因素對黃秋葵泡菜亞硝酸鹽含量的影響是可信的，用該方程進(jìn)行分析和預(yù)測，預(yù)測值和實(shí)際測定值之間相關(guān)性較高。由表3亦可知，一次項A、B、C、D、交互項AD及二次項A2、B2、C2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項AC、BC、CD對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他項對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

2.3.2 響應(yīng)面分析

一般來說，響應(yīng)面曲面越陡、等高線形狀越接近橢圓形，則因素之間的交互作用越顯著[28]。各因素間的交互作用對黃秋葵泡菜中亞硝酸鹽含量影響的響應(yīng)曲面及等高線見圖6。由圖6可知，AC、AD、BC和CD交互作用的曲面較陡，等高線較密集且呈橢圓形或馬鞍形，說明接種量與發(fā)酵時間、接種量與食鹽水濃度、發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間、發(fā)酵時間與食鹽水濃度的交互作用對亞硝酸鹽含量的影響更顯著，這與方差分析的結(jié)果基本一致。

圖6 各因素間交互作用對黃秋葵泡菜中亞硝酸鹽含量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of interaction between each factor on nitrite contents in pickled okra

根據(jù)回歸模型方程得到植物乳桿菌發(fā)酵黃秋葵泡菜最佳發(fā)酵工藝為：植物乳桿菌接種量3.32%，發(fā)酵溫度30.05 ℃，發(fā)酵時間5.41 d，食鹽水濃度4.00%，此時亞硝酸鹽含量的理論值最低，為3.06 mg/kg。為便于實(shí)際操作，將最佳發(fā)酵工藝條件適當(dāng)調(diào)整為：接種量3.5%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間5.5 d，食鹽水濃度4.0%。在此最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下發(fā)酵制作的黃秋葵泡菜中亞硝酸鹽含量實(shí)際值為（2.98±0.02）mg/kg，低于GB 2762—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》腌漬蔬菜亞硝酸鹽的限量標(biāo)準(zhǔn)（≤20 mg/kg），且與理論值3.06 mg/kg接近，說明模型方程擬合程度良好，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的發(fā)酵工藝條件對減少和控制黃秋葵泡菜亞硝酸鹽的產(chǎn)生基本準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

本研究以新鮮黃秋葵為主要原料，采用植物乳桿菌發(fā)酵黃秋葵泡菜，不僅可以使亞硝峰提前，縮短發(fā)酵期，還可以降低亞硝酸鹽的含量。為減少和控制亞硝酸鹽產(chǎn)生，采用單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化確定植物乳桿菌發(fā)酵黃秋葵泡菜的最佳工藝條件為：植物乳桿菌接種量3.5%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間5.5 d，食鹽水濃度4.0%。采用最優(yōu)工藝制備的黃秋葵泡菜的亞硝酸鹽含量為2.98 mg/kg，低于國家醬腌菜亞硝酸鹽的限量標(biāo)準(zhǔn)（≤20 mg/kg），比優(yōu)化前降低1.21 mg/kg。本試驗(yàn)提供了一種營養(yǎng)、安全并具有一定保健作用的大眾餐桌食品，也給廣大農(nóng)戶提供了一種操作簡單、成本低的黃秋葵加工貯藏方法。