王春艷，鄧 洲，武思雨，陳麗岳，楊炎凱，羅建成

（南陽理工學(xué)院 河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點實驗室，河南 南陽 473004）

黃酒是世界上最古老的酒類之一，與啤酒和葡萄酒并稱為“世界三大古酒”。2019年4月1日起實施的中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 13662—2018《黃酒》對黃酒進行了更為準(zhǔn)確的定義。黃酒是以稻米、黍米、谷、玉米、小麥、水等為主要原料，經(jīng)加曲和/或部分酶制劑、酵母等糖化發(fā)酵劑釀制而成的發(fā)酵酒。黃酒按其產(chǎn)品風(fēng)格分為傳統(tǒng)型黃酒、清爽型黃酒和特型黃酒。黃酒釀造的原料非常豐富，極大促進了黃酒的多元化發(fā)展。目前，市場上有糯米黃酒[1]、玉米黃酒[2]、青稞黃酒[3]、燕麥黃酒[4]、苦蕎黃酒[5]等。紅色釀酒谷子（簡稱紅酒谷或紅谷）是南陽盆地的特產(chǎn)，具有較高的營養(yǎng)價值[6-7]。南陽因紅谷黃酒的發(fā)展被評為世界美酒特色產(chǎn)區(qū)，但是目前對南陽紅谷黃酒的研究還非常薄弱。

高級醇俗稱“雜醇油”，指含3個以上碳原子醇類的總稱，是黃酒釀造過程中微生物通過氨基酸降解代謝和糖代謝產(chǎn)生的主要風(fēng)味物質(zhì)[8-9]，適量的高級醇給人一種醇香宜人的感受，但高級醇過量則容易引起異雜味和致醉性[10-11]。黃酒中的高級醇主要有異丙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇等[12-13]，釀造原料以及工藝的不同都會導(dǎo)致黃酒中高級醇類別和含量的差異。

本研究以南陽紅谷為原料通過蒸米工藝釀造黃酒，采用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法對紅谷黃酒釀造過程中產(chǎn)生的高級醇種類和含量進行鑒定，同時采用高通量測序技術(shù)對其細菌群落結(jié)構(gòu)進行解析，最后利用Spearman統(tǒng)計學(xué)方法對兩者之間的相關(guān)性進行預(yù)測，以期更好的了解南陽紅谷黃酒高級醇產(chǎn)生的微生物機制，為更好的品質(zhì)控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅谷：南陽新野縣；麥曲：山東梁山徐曙生物工程有限公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司；3-辛醇（色譜純）：美國Sigma公司；基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；QIAquick膠回收試劑盒：德國QIAGEN公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏試驗設(shè)備有限公司；LDZX-50FB立氏壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP-INNOWAX色譜柱（60 m×250 μm×0.5 μm）：美國安捷倫科技有限公司；T100TM梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國Bio-Rad公司；Miseq高通量測序儀：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 紅谷黃酒的發(fā)酵[7]

采用傳統(tǒng)攤飯法釀造紅谷黃酒，取0.25 kg紅谷淘洗干凈，置于潔凈的1 L燒杯內(nèi)，加自來水浸泡，燒杯口用兩層無菌紗布覆蓋，早晚各換1次水，室溫下浸泡24 h。將瀝干水分的紅谷攤平在托盤中，放入蒸箱中蒸1 h，攤涼冷卻至35 ℃。麥曲接種量為10.0%，釀酒酵母接種量為0.45%，均勻攪拌后，裝入黃酒發(fā)酵罐中，依次用封口膜（扎孔）和紗布進行封罐。將黃酒罐放置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵24 d，發(fā)酵前期對其進行攪拌，使其充分發(fā)酵。

1.3.2 紅谷黃酒發(fā)酵過程中樣品的選取

分別取發(fā)酵第0天（投料當(dāng)天）、2天、4天、6天、9天、12天、18天、24天的樣品10 g，樣本分別命名為A0、A2、A4、A6、A9、A12、A18、A24，4 000 r/min離心10 min，取上清液用于測定高級醇，剩余樣品轉(zhuǎn)入無菌離心管中，-20 ℃保存，用于微生物高通量測序分析。

1.3.3 紅谷黃酒高級醇的測定

采用GC-MS法對紅谷黃酒中的高級醇進行檢測[12]。

樣品前處理：取8 mL已離心的紅谷黃酒發(fā)酵液加入20 mL頂空瓶中，再加入1.5 g NaCl和25 μL內(nèi)標(biāo)物（質(zhì)量濃度為300 mg/L的3-辛醇）。采用頂空進樣器處理樣品，樣品處理溫度60 ℃，定量環(huán)/閥溫度100 ℃，傳輸線溫度110 ℃，樣品處理時間45 min，壓力平衡時間0.25 min，進樣時間1 min。

氣相色譜-質(zhì)譜條件：進樣口溫度240 ℃；升溫程序為50 ℃保持2 min，以3 ℃/min升溫至80 ℃，再以5 ℃/min升溫至230 ℃，保持10 min；載氣為高純氦氣（He），流速1 mL/min；電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；掃描范圍29～350 u。

定性和半定量：通過美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（na tional institute of standards and technology，NIST）譜庫對比高級醇物質(zhì)進行定性，采用內(nèi)標(biāo)法進行半定量。

1.3.4 紅谷黃酒細菌群落結(jié)構(gòu)分析

使用基因組DNA提取試劑盒提取紅谷黃酒微生物基因組總DNA，以其為模板，采用引物B341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和B785R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）PCR擴增16S rDNA V3-V4區(qū)基因序列。PCR擴增體系：2×Taqmaster Mix 15 μL，DNA模板10 ng，10 μmol/L正反向引物各1 μL，雙蒸水（ddH2O）補充至30 μL。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共計25個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物切膠純化后進行精準(zhǔn)定量，送杭州開泰生物技術(shù)有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

為得到高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，以提高后續(xù)生物信息分析準(zhǔn)確性，使用Vsearch的fastq_mergepairs命令進行序列拼接，然后使用Cutadapt軟件去除序列中的引物，最后使用Vsearch的fastq_filter命令去除含有N堿基以及堿基長度＜100 bp的低質(zhì)量序列。97%相似性水平下對非重復(fù)序列（不含單序列）進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類分析，同時采用Denovo模塊去除嵌合體序列。選取OTU代表序列與Silva數(shù)據(jù)庫進行比對，使用Mothur軟件找出與OTU序列相似度最高且可信度達80%以上的物種信息用于OTU注釋，從而完成不同水平下的每個樣品的群落結(jié)構(gòu)分析。

1.3.5 紅谷黃酒高級醇與細菌群落相關(guān)性分析

利用RStudio中的psych軟件包計算高級醇與細菌群落之間的Spearman相關(guān)系數(shù)R，以R＞0.5且P＜0.05為閾值找出可視化對象，選用Gephi 0.92進行可視化，以表征微生物與高級醇之間的相關(guān)性[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅谷黃酒發(fā)酵過程中高級醇的動態(tài)變化

紅谷黃酒發(fā)酵過程中高級醇種類及含量的變化見表1。

由表1可知，紅谷黃酒整個發(fā)酵過程中共檢測到包括異丙醇在內(nèi)的15種高級醇。投料當(dāng)天（0 d），檢測出2種高級醇，分別為異丁醇和異戊醇。在整個發(fā)酵過程中，穩(wěn)定存在的高級醇（檢出次數(shù)≥4）包括正丙醇、正丁醇、正戊醇、正己醇、β-苯乙醇、異丁醇、異戊醇、叔己醇、2,3-丁二醇和3-甲硫基丙醇，其中正戊醇（4.29～16.24 μg/L）、叔己醇（6.24～16.32 μg/L）和3-甲硫基丙醇（9.96～15.73 μg/L）含量較低；除投料當(dāng)天（0 d），其余發(fā)酵時間（2～24 d）均有檢出的是正丙醇、正丁醇、β-苯乙醇、異丁醇、異戊醇和2,3-丁二醇，其中異戊醇和異丁醇是本次黃酒發(fā)酵檢測到的含量最高的兩種高級醇，分別占高級醇總含量的70.88%～74.36%和15.81%～18.76%。檢出次數(shù)＜4的高級醇包括七甘醇、1,2-丁二醇、2-乙氧基丙醇、2-乙烯氧基乙醇、2-乙氧基丙醇。發(fā)酵后期（9～24 d）高級醇含量顯著增加，發(fā)酵至第18天達到最高，為18 843.10 μg/L。

表1 紅谷黃酒發(fā)酵過程中高級醇種類及含量的變化Table 1 Changes of kinds and contents of higher alcohols during red millet Huangjiu fermentation process μg/L

已研究的不同類型的黃酒有紹興機械化黃酒[15]、燕麥黃酒[16]、清爽型黃酒[17]、麥曲黃酒[18]，將其發(fā)酵過程中的高級醇種類、主要高級醇平均含量（去除投料當(dāng)天）與紅谷黃酒進行對比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，燕麥黃酒高級醇種類最多（18種），紹興機械化黃酒種類最少（10種），主要高級醇類型均為異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇3種，清爽型黃酒和紹興機械化黃酒主要高級醇的平均含量較高，是其他類型黃酒的1～2個數(shù)量級。在上述5種類型的黃酒中，紅谷黃酒的高級醇種類居中，β-苯乙醇含量相對較低，異丁醇、異戊醇的平均含量高于麥曲黃酒和燕麥黃酒。由此可見，不同釀造工藝、不同風(fēng)味的黃酒高級醇含量差別較大。

2.2 紅谷黃酒細菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 高通量測序結(jié)果及Alpha多樣性分析

利用Illumina Miseq測序平臺得到樣品A0、A2、A4、A6、A9、A12、A18、A24的原始測序數(shù)據(jù)分別為24 252、22 682、29 071、25 530、22 117、24 631、25 188、20 698條，經(jīng)過質(zhì)控得到有效數(shù)據(jù)，并對其Alpha多樣性進行分析，結(jié)果見表2。由表2可知，8個樣品的覆蓋率均＞99.5%，表明試驗測序深度合理，測序結(jié)果可以反映真實的樣本情況。4個指數(shù)中，香農(nóng)指數(shù)越大、辛普森指數(shù)越低，說明群落物種的多樣性越高，Chaol指數(shù)和ACE指數(shù)越大則表明群落物種豐富度越高[19]。樣本A6的香農(nóng)指數(shù)（1.48）最高，辛普森指數(shù)（0.39）最低，Chaol指數(shù)（119.33）及ACE指數(shù)（156.03）均較高，表明紅谷黃酒發(fā)酵第6天時細菌群落多樣性達到峰值，隨著發(fā)酵的進行，微生物多樣性和豐富度明顯下降。

表2 紅谷黃酒樣品細菌群落Alpha多樣性分析結(jié)果Table 2 Alpha diversity analysis results of bacterial community of red millet Huangjiu samples

2.2.2 細菌群落結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)高通量測序結(jié)果所獲取的信息，基于門水平對紅谷黃酒細菌群落結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果見圖1。由圖1可知，紅谷黃酒細菌群落共注釋到4個門，分別是變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），這與多數(shù)黃酒釀造微生物的相關(guān)研究一致[20-22]。其中，優(yōu)勢細菌門（平均相對豐度≥1%）為變形菌門和厚壁菌門，發(fā)酵前6天，變形菌門的相對豐度為64.95%～94.98%；發(fā)酵第9天至結(jié)束，厚壁菌門增長迅速，其相對豐度均＞80%。

圖1 基于門水平紅谷黃酒樣品細菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.1 Analysis results of bacterial community structure in red millet Huangjiu samples based on phylum level

為進一步了解紅谷黃酒的細菌群落結(jié)構(gòu)組成，基于屬水平對紅谷黃酒細菌群落結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果見圖2。

圖2 基于屬水平紅谷黃酒樣品細菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.2 Analysis results of bacterial community structure in red millet Huangjiu samples based on genus level

由圖2可知，紅谷黃酒細菌群落共注釋到66個屬，其中平均相對豐度≥1%的優(yōu)勢細菌屬共有7個，分別為魏斯氏菌屬（Weissella）、大洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、Lentilactobacillus、乳酪桿菌屬（Lacticaseibacillus）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）、克魯沃菌屬（Kluyvera）和腸球菌屬（Enterococcus），非優(yōu)勢菌屬及未分類的OTU歸為其他（others）。由圖2亦可知，紅谷黃酒發(fā)酵過程中細菌群落結(jié)構(gòu)變化顯著，發(fā)酵前期（2～6 d）細菌菌群結(jié)構(gòu)較為豐富，Weissella、Oceanobacillus、Enterococcus、Kroppenstedtia和Kluyvera的相對豐度最高值均出現(xiàn)在該階段，Lacticaseibacillus的相對豐度持續(xù)增加，Lentilactobacillus未檢出。發(fā)酵后期（9～24 d）細菌群落結(jié)構(gòu)相對簡單，僅檢出Lacticaseibacillus、Lentilactobacillus和Weissella。Lacticaseibacillus的相對豐度均＞80%，在第18天達到最高值93.65%，Lentilactobacillus有所增長，最終相對豐度為6.14%。本研究中檢測到的Weissella、Lentilactobacillus、Lacticaseibacillus和Enterococcus同樣存在于已報道的其他類型黃酒發(fā)酵過程的優(yōu)勢細菌組成中[23-25]，而Kroppenstedtia和Kluyvera鮮見報道。

2.3 紅谷黃酒優(yōu)勢細菌與高級醇的相關(guān)性

選取紅谷黃酒發(fā)酵第2～24天樣本的優(yōu)勢細菌屬的相對豐度值與對應(yīng)采樣時間點的高級醇含量進行相關(guān)性分析，計算他們之間的Spearman相關(guān)系數(shù)R，選取R＞0.5且P＜0.05作為有效的網(wǎng)絡(luò)連接并繪圖，結(jié)果見圖3。

圖3 高級醇與優(yōu)勢細菌屬的Spearman相關(guān)性分析結(jié)果Fig.3 Results of Spearman correlation analysis between higher alcohols and dominant bacterial genera

由圖3可知，與優(yōu)勢細菌屬相關(guān)的高級醇主要為異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇和正丙醇，其中異丁醇與Oceanobacillus、Lentilactobacillus、Lacticaseibacillus、Kroppenstedtia、Kluyvera和Enterococcus均具有相關(guān)性，異戊醇與β-苯乙醇均與Oceanobacillus和Weissella具有相關(guān)性，正丙醇僅與Kluyvera相關(guān)。紅谷黃酒發(fā)酵過程的優(yōu)勢細菌屬中Oceanobacillus是連接最大的屬，其次是Kluyvera和Weissella。結(jié)果表明，紅谷黃酒發(fā)酵過程中，對高級醇產(chǎn)生起到主要貢獻的細菌菌群為Oceanobacillus、Kluyvera和Weissella。孫樂平等[16]采用與本研究類似的方法研究了燕麥黃酒發(fā)酵過程中細菌、真菌群落對高級醇的影響，發(fā)現(xiàn)異丁醇與片球菌屬（Pediococcus）和變形桿菌屬（Proteus）等7個屬微生物建立關(guān)聯(lián)；異戊醇與嗜熱真菌屬（Thermomyces）相關(guān)；β-苯乙醇與根霉菌屬（Rhizopus）相關(guān)。分析造成關(guān)聯(lián)不一致的原因可能是與黃酒釀造原料、發(fā)酵工藝的不同有關(guān)。

3 結(jié)論

采用氣相色譜-質(zhì)譜法從南陽特色紅谷黃酒發(fā)酵過程中共檢測到15種高級醇，其中異戊醇、異丁醇含量較高，分別占高級醇總含量的70.88%～74.36%和15.81%～18.76%。采用高通量測序技術(shù)對紅谷黃酒釀造過程中的細菌群落結(jié)構(gòu)進行研究發(fā)現(xiàn)，黃酒發(fā)酵至第6天時，細菌群落多樣性達到峰值，隨著發(fā)酵的進行，細菌菌群多樣性和豐富度明顯下降。優(yōu)勢細菌門（平均相對豐度≥1%）為變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes），優(yōu)勢細菌屬（平均相對豐度≥1%）為魏斯氏菌屬（Weissella）、大洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、Lentilactobacillus、乳酪桿菌屬（Lacticaseibacillus）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）、克魯沃菌屬（Kluyvera）和腸球菌屬（Enterococcus）。采用Spearman統(tǒng)計學(xué)方法對兩者之間的相關(guān)性進行分析發(fā)現(xiàn)，對高級醇產(chǎn)生主要貢獻的細菌群為大洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、克魯沃菌屬（Kluyvera）和魏斯氏菌屬（Weissella）。本研究結(jié)果為黃酒高級醇含量有效調(diào)控奠定理論基礎(chǔ)。