姜東明，柳寧寧，張福艷，李澤霞*

（1.河北衡水老白干酒業(yè)股份有限公司，河北 衡水 053000；2.河北省白酒釀造技術創(chuàng)新中心，河北 衡水 053000；3.河北省固態(tài)發(fā)酵釀酒產業(yè)技術研究院，河北 衡水 053000）

釀酒原料是決定白酒產量和質量的物質基礎，不同品種的原料賦予酒體不同的風格[1]，高粱釀酒香、玉米釀酒甜、小麥釀酒糙、大米釀酒凈、大麥釀酒沖，根據原料及其配比中國白酒可分兩種：一種是采用純高粱，現習慣稱之“單糧型”，如茅臺、瀘州老窖、汾酒、衡水老白干等，一直以來都是以高粱為釀酒主體原料；另一種是以適當配比，傳統(tǒng)為“雜糧”酒，現習慣稱之“多糧型”，如五糧液、劍南春、洋河等。多糧釀酒可以彌補單糧釀酒所存在的不足，充分發(fā)揮多種原料的優(yōu)勢，汲取各種糧食的精華作用互補，為豐富味覺提供了較為全面的物質基礎。

陳彬等[2]通過研究發(fā)現，高粱最適宜釀造白酒，大米能夠給白酒提供干凈、綿甜的風味，玉米能夠為白酒提供甘甜、糧香的風味。陳翔等[3]通過對九種原料進行白酒釀造試驗，發(fā)現多糧釀造互補性很強，是釀造綿柔型酒的基礎，關鍵是各種原料要有合理的量比關系和相適應的科學生產工藝，姚亞林等[4]比較了五糧液陳氏配方、經典五糧配方、新五糧配方的釀造特性，陳氏配方有更高的支鏈淀粉，更有利于白酒產香。目前，為解決各類生產實際問題，國內各大酒廠都開始進行多糧酒的研究[5-7]，研究主要集中在濃香型和清香型白酒，成功的范例是洋河酒廠，其從傳統(tǒng)的單糧型改變?yōu)榱硕嗉Z型生產工藝，成功解決了困擾江淮流域濃香型白酒廠多年的“增己降乳”、壓窖后第二排“掉排”等問題[8-9]，清香型白酒當中的重慶江津酒廠、北京牛欄山等均研究多糧發(fā)酵來改善其酒的口感，使其更加醇厚豐滿[10-11]。目前，多糧酒的研究還主要停留在生產工藝方面[12-13]，單一糧食釀酒特性[14-15]，而系統(tǒng)分析多糧酒與單糧酒的差異性化合物的研究較少，如何利用科學合理的方法對單糧酒和多糧酒的差異性進行分析和合理的解釋未見有公開的報道。

固相微萃取技術（solid phase microextraction，SPME）自20世紀90年代加拿大Waterloo大學Pawliszyn研究小組發(fā)明以來[16]，結合氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術在白酒的原料[17-18]、大曲[19-20]、酒醅[21-22]、蒸餾[23]、風味特征[24-26]等研究領域取得了豐富的科研成果。

本研究以單糧型、多糧型老白干酒為研究對象，利用頂空固相微萃取（SPME）結合氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）技術提取單糧型和多糧型白酒揮發(fā)性風味物質的指紋圖譜，利用XCMS 5.0軟件進行預處理，并將數據集導入代謝組學軟件Simca14.1進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）。采用化學計量學和代謝組學技術對兩種白酒進行差異性研究，試圖從化學物質的角度來對造成兩種白酒差異的原因進行比對分析，為多糧型老白干香型白酒的工藝優(yōu)化和質量的提高提供理論的支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

以河北衡水老白干酒業(yè)股份有限公司2號工房為實驗車間，以2-6、2-7、2-8三個班組為對照組按正常生產單糧酒，以2-9、2-10兩個班組為實驗組生產多糧酒，投料量，用曲量保持一致，發(fā)酵期28 d，連續(xù)投料5 d，以班組名稱加生產時的天數為樣品編號，如單糧酒班組2-6組第1天生產的基酒編號2-6-1，第2天生產的基酒編號2-6-2，以此類推，以新產基酒為實驗材料。

1.1.2 化學試劑

C8～C40正構烷烴：美國Accustandard公司；乙酸乙酯、乙縮醛標準品（純度＞98%）：北京百靈威科技有限公司；娃哈哈純凈水：杭州娃哈哈集團公司；NaCl（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；2-辛醇（內標）：上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀：安捷倫科技（中國）有限公司；50/30DVD/CVB/PMDS固相微萃取頭：美國Supelco公司；CombiPAL進樣器：瑞士CTC公司；IKA vortex3漩渦混合器：德國IKA公司；Sniffer9000系統(tǒng)：瑞士Brechbühler公司。

1.3 方法

1.3.1 指紋圖譜的提取

樣品的前處理：樣品稀釋到酒精度5.0%vol，取稀釋樣品5 mL，加入質量濃度為200 mg/L的2-辛醇內標10 μL和2.5 g NaCl于20 mL低流失樣品瓶中，在60 ℃、250 r/min條件下孵化40 min，插入萃取頭萃取40 min，于250 ℃條件下在進樣口解吸6 min后，進行氣質聯用分析，整個萃取操作過程由CTC進樣器自動操作運行[27]。

氣相色譜條件：安捷倫CP-Wax 57 CB色譜柱（50 m×0.2 μm×0.25 mm）；高純氦氣（He）（純度99.999%）為載氣；程序升溫：柱溫40 ℃保持5 min，以3.5 ℃/min升至180 ℃，然后以10 ℃/min升至210 ℃保持25 min；不分流進樣；載氣流速1.2 mL/min；進樣口溫度250 ℃。

質譜條件：電子離子（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；接口溫度250 ℃；掃描方式為全掃描，掃描范圍30～450 m/z。

定性定量分析：以在CPWAX上計算的揮發(fā)性風味物質的保留指數和美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）14譜庫提供的保留指數相比較，并結合標準品對未知化合物進行定性；以2-辛醇為內標，用內標法進行半定量計算。

1.3.2 差異性化合物的篩選

以變量重要性投影（variable importance in the projec tion，VIP）值的大小和組間變化的顯著性（P＜0.05）進行差異性代謝產物的篩選，VIP值＞1且P＜0.05 的化合物為差異化合物。

1.3.3 關鍵差異化合物的篩選

以VIP值的大小和組間變化的顯著性（P＜0.05）進行差異性代謝產物的篩選，VIP值＞1.5且P＜0.05的化合物為關鍵差異化合物。

1.3.4 數據處理

數據預處理采用軟件XCMS 5.0，使用軟件Excel 2016進行數據整理，將處理的數據矩陣導入軟件SIMCA14.1，進行主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA）等多元統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 單糧酒和多糧酒揮發(fā)性風味成分分析

單糧酒和多糧酒揮發(fā)性風味成分GC-MS分析總離子流色譜圖見圖1，各風味物質含量分析結果見表1。

圖1 單糧白酒（a）和多糧白酒（b）中揮發(fā)性物質GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile compounds in single-grain Baijiu (a) and multiple-grain Baijiu (b) analyzed by GC-MS

由表1可知，從單糧白酒和多糧白酒中共檢出揮發(fā)性風味化合物89種，包括醛類11種，酮類7種，醇類14種，酯類40種，酸類4種，酚類5種，縮醛類3種，萜烯類2種，硫類化合物1種，吡嗪類1種，呋喃類1種。從單糧酒中檢出83種揮發(fā)性風味化合物，從多糧酒種檢出84種揮發(fā)性風味化合物。

表1 單糧酒和多糧酒中揮發(fā)性化合物的定性定量結果Table 1 Qualitative and quantitative results of volatile compounds in single-grain and multi-grain Baijiu

續(xù)表

續(xù)表

2.2 主成分分析建模

主成分分析（PCA）是一種無監(jiān)督的學習方法，其利用矩陣的線性轉換從原始多個變量中選出較少個數的能解釋大部分數據的重要變量，來實現數據降維的過程。PCA得分圖（score plot）表示樣本數據的分類信息，數據越相似的樣本在得分圖上距離越近，PCA得分圖的聚散程度反映了樣本中數據的相近程度，即酒中化合物的聚類情況，越接近的點在得分圖上越接近。

多糧酒和單糧酒揮發(fā)性風味成分主成分分析結果見圖2。由圖2可知，多糧酒和單糧酒在得分圖上能有效分開，說明多糧酒和單糧酒當中化合物差異比較大，多糧酒樣本主要集中在第一、二象限，而單糧酒樣本主要集中在第三、四象限，說明通過無監(jiān)督的PCA可以看出單糧酒組和多糧酒組的樣本之間確實存在組間的差異性。

圖2 多糧白酒和單糧白酒揮發(fā)性風味成分主成分分析得分散點圖Fig.2 Score scatter plot of principal component analysis of volatile compounds in single-grain and multi-grain Baijiu

2.3 正交偏最小二乘法建模

偏最小二乘法（partial least squares，PLS）是當前在計量化學和代謝組學領域中有監(jiān)督分析的常用方法，偏最小二乘利用潛變量的概念，描述自變量矩陣X和因變量矩陣Y之間的關系，可以用于處理高維數據[28]，正交偏最小二乘（OPLS）是繼PLS回歸之后發(fā)展的一種處理高維數據的方法，該方法利用正交信號校正（orthogonal signal correction，OSC）的思想，把與Y無關的正交變量從預測結果中分離出來，OPLS方法增強了模型的解釋性[29]。

多糧酒和單糧酒正交偏最小二乘-判別分析結果見圖3。由圖3可知，多糧酒和單糧酒得到了很好的區(qū)分，多糧酒樣本主要集中在第一、四象限，而單糧酒樣本主要集中在第二、四象限，說明通過有監(jiān)督的OPLS判別分析，單糧酒和多糧酒組間的差異性明顯，可以明顯地分為兩組樣本，而多糧酒樣品集中度較高，多糧酒的組內差異性較小。

圖3 多糧白酒和單糧白酒揮發(fā)性風味成分正交偏最小二乘-判別分析得分散點圖Fig.3 Score scatter plot of orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis of volatile compounds in singlegrain and multi-grain Baijiu

2.4 差異化合物和關鍵差異化合物

經置換檢驗模型沒有過度擬合，以VIP＞1且P＜0.05定義為差異化合物，以VIP＞1.5且P＜0.05定義為關鍵差異化合物，得到多糧酒和單糧酒中的差異化合物及關鍵差異化合物，結果見表2。

從表2可以看出，多糧酒及單糧酒共有26種差異化合物，其中有11種關鍵差異化合物。相對于單糧酒，多糧酒有白氨酸乙酯、十四酸乙酯、苯乙酸乙酯、棕櫚酸乙酯、正丙醇、丁二酸二乙酯、β-大馬士酮、正丁醇、糠醛、2-糠醇、壬二酸二乙酯、β-苯乙醇、異戊酸乙酯、1,1二乙氧基-3-甲基-丁烷、十三酸乙酯等15種物質的含量上升，乙縮醛、正癸醇、4-乙基苯酚、己酸乙酯、戊酸乙酯、6-甲基-3,5-庚二烯酮、正戊醇、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、（E,E）-2,4-癸二烯醛、6,10,14-三甲基-2-十五酮（植酮）11種物質的含量下降。

表2 單糧酒和多糧酒中的差異化合物和關鍵差異化合物Table 2 Differential compounds and key different compounds in single-grain and multi-grain Baijiu

多糧酒中大量的具有花香，甜香的化合物的含量增加，使得白酒中的甜味增加，更加綿甜，例如十四酸乙酯具有棗香，棗香是國標中老白干香型白酒的特征香氣，多糧酒棗香氣更加明顯[27]，苯乙酸乙酯具有玫瑰花香，蜂蜜香甜香，丁二酸二乙酯具有水果香，糖果香，異戊酸乙酯具有蘋果香，水果香[30]，大馬士酮對白酒香氣有重要影響，具有蘋果、蜂蜜的香氣，其在白酒中的香氣閾值極低（20.0 μg/L），是清香型白酒中十分重要的一種香氣物質[31]，苯乙醇富有特點的玫瑰花香，是米香型等小曲酒中的特征性風味成分[32]，糠醛具有甜香，杏仁香[33]，十六酸乙酯（焦香味）可以為白酒帶來厚重的口感[34]。而一些影響白酒感官特征的微量成分下降，使得多糧酒更加柔和，綿甜，減少了暴辣，入口沖，使酒體香氣協(xié)調均勻。如（E,E）-2,4-癸二烯醛呈脂肪香氣，青草香，具有一定的刺激性，其具有極低的香氣閾值7.71 μg/L[35]，乙基苯酚有煙熏味、藥味[36]，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚是來自于糠殼的糠味[37]。

有11種化合物的VIP＞1.5而且P＜0.05是造成多糧酒相較于單糧酒更加柔和，綿甜，利口的主要原因，是造成多糧酒和單糧酒差異的關鍵化合物，正是由于多糧酒中甜味物質十四酸乙酯，大馬士酮，苯乙醇等含量的增加，而刺激性的物質4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，（E,E）-2,4-癸二烯醛等含量的下降使得多糧型老白干酒更加柔和、綿甜，入口刺激性小。

3 結論

本研究通過建立的頂空固相微萃取（SPME）結合氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）技術建立單糧型和多糧型白酒揮發(fā)性風味物質的指紋圖譜，利用化學計量學和代謝組學工具對多糧酒和單糧酒在微量成分上的差異性進行了研究，從中鑒別出具有統(tǒng)計學意義的26種差異化合物，其中有11種物質為關鍵性的差異化合物，從感官評價的角度對差異化合物的上升和下降進行了分析，解釋了多糧型老白干酒的綿甜，柔順，利口合理性，對于進一步的工藝優(yōu)化和產品質量的提高提供了理論的依據。