徐菁雯,王偉明,史海粟,陳麗艷,胡心玉,趙 悅,烏日娜*
(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院 遼寧省食品發(fā)酵技術(shù)工程研究中心,遼寧 沈陽 110866;2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150036)
豆豉和淡豆豉都是主要以完整豆粒為原料,微生物發(fā)酵獲得的中國傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品。從南宋開始,淡豆豉作為中藥材進(jìn)入了人們的生活,豆豉則逐漸轉(zhuǎn)化為食品食用[1]。豆豉多以黃豆為原料,根據(jù)地區(qū)和工藝不同,可大致分為細(xì)菌型豆豉、毛霉型豆豉、根霉型豆豉和曲霉型豆豉,多用作調(diào)味品。淡豆豉則以黑豆為原料,通過青蒿和桑葉輔助發(fā)酵,相比于豆豉發(fā)酵多一個(gè)再悶過程,作為中藥具有解表、除煩、宣發(fā)郁熱的功效,常用于治療感冒、寒熱頭痛、煩躁胸悶、虛煩不眠等病癥[2]。
多年來,食品領(lǐng)域主要針對豆豉的工藝、風(fēng)味和品質(zhì)等方面進(jìn)行研究和應(yīng)用,對其中功能成分的研究和開發(fā)尚在起步階段,而中醫(yī)藥領(lǐng)域研究者則主要關(guān)注淡豆豉功效成分提取和療效,對其形成機(jī)制和產(chǎn)品開發(fā)不足。隨著淡豆豉被列入《既是食品又是藥品的物品名單》,豆豉和淡豆豉其中功能成分的臨床研究和在功能性食品研發(fā)中的潛力受到關(guān)注。尤其在新冠疫情期間,大豆發(fā)酵食品對新冠病毒的預(yù)防功效,也成為新興研究關(guān)注的方向之一[3]。本文對近年來關(guān)于豆豉和淡豆豉微生物組學(xué)分析與功能性成分相關(guān)研究進(jìn)行綜述,總結(jié)在豆豉和淡豆豉發(fā)酵過程中微生物組成和活性物質(zhì)變化間的相關(guān)規(guī)律,為后續(xù)研究提供理論依據(jù),期望可以用于優(yōu)化豆豉和淡豆豉的生產(chǎn)利用。
豆豉和淡豆豉多為自然發(fā)酵生產(chǎn),參與發(fā)酵微生物種類繁多,且由于我國幅員遼闊,地區(qū)間環(huán)境條件相差巨大,因此不同地區(qū)不同發(fā)酵工藝所生產(chǎn)的豆豉和淡豆豉中含有豐富微生物資源,包括很多中國特有的微生物群落。但自然發(fā)酵易受雜菌污染等問題也是不可避免的,要在合理利用傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物資源的同時(shí),優(yōu)化發(fā)酵過程,采取純種發(fā)酵,最大限度的保證豆豉和淡豆豉原先的風(fēng)味、功效并且提高產(chǎn)品質(zhì)量。
高通量測序、擴(kuò)增子分析、宏基因組學(xué)和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及宏蛋白質(zhì)組學(xué)和高分辨率代謝組學(xué)等組學(xué)技術(shù)在探索傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物群落動(dòng)態(tài)和功能表征方向上的應(yīng)用在近幾年來飛速發(fā)展,在探索了食品發(fā)酵的潛在機(jī)制的同時(shí),揭示了發(fā)酵食品是有價(jià)值基因和生物活性物質(zhì)的重要來源[4]。
在過去的一段時(shí)間中,通過分離篩選的方法,已經(jīng)對于豆豉和淡豆豉在不同發(fā)酵階段和不同地區(qū)之間微生物組成進(jìn)行過一些研究對比。如通過對不同產(chǎn)地淡豆豉成品進(jìn)行分離篩選,從河北、黑龍江等七地樣品中都有發(fā)現(xiàn)毛霉(Mucorsp.),從甘肅樣品中還各分離出了一株青霉(Penicilliumsp.)、在廣州樣品中還分離出一株根霉(Rhizopussp.),而在甘肅、安徽和廣州樣品中還篩選出曲霉菌(Aspergillussp.),僅在甘肅和廣州樣品中各分理出一株微球菌(Streptococcussp.),說明主要還是以真菌為主[5-6]。而在神農(nóng)架采集的豆豉樣本中也篩選出4株枯草芽孢桿菌,但未分離出乳酸菌[7]。分離篩選的方式有助于解豆豉和淡豆豉中存在的菌,但由于分離篩選條件及菌種之間抑制等原因,并不能完全分離所有菌種,并且如果對發(fā)酵過程菌種進(jìn)行分析對比,以分離篩選的方式操作起來較為復(fù)雜且可能不夠全面。
隨著高通量測序和宏組學(xué)等飛速發(fā)展,將組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于分析發(fā)酵食品在發(fā)酵過程中微生物組成動(dòng)態(tài)變化的研究也越來越深入。在國外,組學(xué)技術(shù)在發(fā)酵食品中的應(yīng)用對發(fā)酵大豆食品微生物菌落分析做出了很大貢獻(xiàn),如對印度、不丹、尼泊爾等地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品kinema中的細(xì)菌和真菌中的組成進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)了每個(gè)國家樣本中獨(dú)特的屬,同時(shí)發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是共同的核心細(xì)菌,并對其進(jìn)行功能預(yù)測,最大功能主要是谷氨酸的代謝[8]。在韓國傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品Doenjang和Ganjang中通過比較研究,發(fā)現(xiàn)以嗜鹽或耐鹽微生物為主要優(yōu)勢,在Doejang中德巴利菌(Debaryomyces)和葡萄球菌(Staphylococcus)占優(yōu)勢,而最終產(chǎn)物多為異黃酮、大豆皂苷和氨基酸,而在干醬中生物胺和類苯基丙烷含量豐富,可能由于其主要優(yōu)勢菌為酵母(Meyerozyma)和四聯(lián)球菌(Tetragenococcus)[9]。
代謝組學(xué)分析有利于了解發(fā)酵食品中微生物群落變化[10],近期組學(xué)分析豆豉和淡豆豉發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌種的動(dòng)態(tài)變化見表1[11-20]。
表1 不同地區(qū)豆豉和淡豆豉微生物差異Table 1 Microbial differences of Douchi and Dan-douchi in different regions
續(xù)表
以曲霉型豆豉為代表,在發(fā)酵前期葡萄球菌屬占優(yōu)勢地位,在中期乳酸菌細(xì)菌屬會逐漸占據(jù)優(yōu)勢,而在發(fā)酵后期,葡萄球菌屬(Staphylococcus)和腸桿菌屬(Enterobacter)又會重新成為優(yōu)勢微生物[12,21]。毛霉型豆豉在制曲過程中主要由細(xì)菌、真菌進(jìn)行作用。在細(xì)菌中,魏斯氏菌(Weissella)是發(fā)酵前期的優(yōu)勢菌屬,芽孢桿菌(Bacillus)、乳酸桿菌(Lactobacillus)是后期的優(yōu)勢菌屬;在真菌中,總狀毛霉(Phycomycetes)是優(yōu)勢菌屬,另外幾種根霉也在豆豉的糖化中起到重要作用[22]。細(xì)菌型豆豉則是以假絲酵母(Candida)等酵母菌以及曲霉(Aspergillus)、毛孢子菌屬(Trichosporon)、米根霉屬(Rhizopus)為真菌優(yōu)勢菌種,芽孢桿菌屬(Bacillus)、魏斯氏菌屬(Weissella)、片球菌屬(Pediococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)等多種細(xì)菌為優(yōu)勢菌種[23]。
從淡豆豉中篩選出的菌種大多為霉菌,還有少部分細(xì)菌[5],可能是因?yàn)榈刽l(fā)酵過程中,高溫環(huán)境較多,導(dǎo)致在整體環(huán)境下,細(xì)菌比較難存活,而霉菌占據(jù)主要優(yōu)勢。分析淡豆豉不同發(fā)酵時(shí)期的菌種變化,隨著發(fā)酵過程進(jìn)展,畢赤酵母(Pichia pastoris)、桔青霉(Penicillium tangerinii)、米根霉(Rhizopus oryzae)、羅倫隱球酵母(Saccharomyces lorendii)等菌種逐漸出現(xiàn),總發(fā)酵前期主要是微球菌和酵母菌占優(yōu)勢,在中期時(shí),推測由于發(fā)酵溫度較高,不利于細(xì)菌和酵母菌的生長,或者由于不同菌種的生長速度不同,霉菌生長的速度慢于酵母,而在霉菌占據(jù)優(yōu)勢后,抑制酵母菌的生長,從而使霉菌在發(fā)酵中期成為優(yōu)勢菌,后期細(xì)菌和酵母菌再度成為主要優(yōu)勢菌種,但整體過程中粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、日本曲霉(Aspergillus nippon)始終占較高比例,所以推測粗糙脈孢菌和曲霉為主要優(yōu)勢菌種[5,13]。
豆豉和淡豆豉是以豆類為原料,在多種微生物混合發(fā)酵后,獲得累積大豆異黃酮、大豆低聚糖、活性肽等多種活性物質(zhì)的最終產(chǎn)品。通過研究發(fā)酵前后功能成分變化規(guī)律,根據(jù)相關(guān)成分在疾病保健功能研究和臨床研究中的進(jìn)展,進(jìn)一步利用其功能成分開發(fā)相關(guān)產(chǎn)品。
大豆中營養(yǎng)物質(zhì)豐富,含有皂苷、異黃酮等生物活性物質(zhì),具有預(yù)防心血管疾病、抗腫瘤等作用[24,25-26],但大豆中異黃酮(soy isoflavone,SI)和皂苷等活性物質(zhì)多以糖基取代形式存在,難以被人體吸收利用,而通過發(fā)酵,可以將異黃酮苷、皂苷等分解為異黃酮苷元、低糖鏈皂苷存在,更有助于人體吸收利用[27]。通過對大豆發(fā)酵前后物質(zhì)含量的測定發(fā)現(xiàn),在發(fā)酵后,SI含量不變,大豆苷元和染料木苷含量減少,而可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,起到抗病毒的作用[28],更易被人體吸收[29]的大豆苷元和染料木素含量增加[30]。
另外發(fā)酵也會產(chǎn)生一些新物質(zhì),如γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)也是近年來深受大家關(guān)注的一種功能性物質(zhì),有一定的抗抑郁、改善失眠等作用[31-32],在黑豆中未有被檢出的報(bào)道,但是經(jīng)過發(fā)酵后,在淡豆豉中檢測出GABA,并且含量相對較高[33]。陳青峰[34]通過研究發(fā)現(xiàn),GABA的形成主要在淡豆豉發(fā)酵的再悶階段,推測乳酸菌、大腸桿菌(Escherichia coli)、真菌、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等可能是GABA生產(chǎn)的主要發(fā)酵微生物。
此外關(guān)于發(fā)酵前后,大豆中的一些酶在人體中的利用和代謝效率存在一定區(qū)別也深受關(guān)注。很多研究表明,發(fā)酵后大豆的抗氧化性和血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)移酶(angiotensin transferase,ACE)抑制活性得到了進(jìn)一步提升[35-36]。另外隨著發(fā)酵過程進(jìn)展,微生物的代謝產(chǎn)物不斷累積,增加活性,很多研究也說明發(fā)酵豆制品中異黃酮的利用率和代謝率的提高[29],其主要機(jī)理也可能是隨著發(fā)酵時(shí)間變長,β-葡萄糖苷酶的活性增加,由于β-葡萄糖苷酶對于異黃酮苷元和酚類的消化吸收有一定的促進(jìn)作用,對于人體更好的吸收大豆中的營養(yǎng)物質(zhì)有很大的幫助[35]。
現(xiàn)代社會,由于環(huán)境及人們自身的原因,慢性病的發(fā)病率越來越高,但目前在臨床醫(yī)學(xué)上,對于慢性病的治療還缺乏快速有效的治療手段,只能通過長時(shí)間服用藥物進(jìn)行慢性治療。相較于帶有不良副作用的藥物,食品中對于預(yù)防和控制慢性病的有效功能成分物質(zhì),能夠通過飲食攝入,再被人體吸收利用,從而對慢性病起到防治的效果。
2.2.1 在心血管疾病治療中的應(yīng)用
發(fā)酵大豆中含有很多對控制血壓和改善血管功能有效的物質(zhì),如多酚、降壓肽、GABA等[36],所以被認(rèn)為對于心血管疾病有一定的預(yù)防和改善作用。如豆豉和淡豆豉中都含有的SI對心血管疾病就存在積極作用[25-26],研究表明,在補(bǔ)充SI后,因?yàn)檠装Y因子水平降低,活性氧生成減少,抑制轉(zhuǎn)酮醇酶(transketolase,TKT),激活依賴于環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)、調(diào)節(jié)血管舒張因子和收縮因子比例等途徑,在一定程度上改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能,降低血管通透性[26]。同時(shí),SI對于修復(fù)神經(jīng)損傷也有一定的作用[37],所以對于腦卒中這類沒有特效藥的神經(jīng)疾病,也可以充分提取利用豆豉和淡豆豉中的相關(guān)有效成分進(jìn)行預(yù)防性功能產(chǎn)品的研發(fā)。
由于ACE可以催化血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ,從而導(dǎo)致高血壓,所以ACE是高血壓預(yù)防和治療中一個(gè)重要的抑制位點(diǎn),合成ACE抑制劑被廣泛用于控制高血壓,但長時(shí)間使用這些合成藥物會造成腎功能下降、肺癌風(fēng)險(xiǎn)增加等副作用,所以天然來源的ACE抑制肽可以提供更安全的治療手段[38]。大豆也被認(rèn)為是很好的ACE抑制肽天然植物來源,很多發(fā)酵大豆食品都被證實(shí)含有豐富的ACE抑制肽,包括豆豉等[39-40],經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),大豆中ACE抑制活性在發(fā)酵后明顯增強(qiáng)[36],是良好的食物源性ACE抑制肽生產(chǎn)來源。
除此之外,異黃酮中的金雀異黃酮、染料木黃酮等都能一定程度抑制脂肪的生成[41],有效地預(yù)防肥胖引發(fā)的健康問題,如肝炎、脂肪肝等,也可以減少心血管疾病并發(fā)的幾率,對預(yù)防心血管疾病起到重要作用。
2.2.2 在神經(jīng)疾病治療中的應(yīng)用
隨著人口老齡化越來越嚴(yán)重,阿茲海默癥也成為近年引起人們重視的一種最常見的神經(jīng)退行性病變,研究證明大豆異黃酮(SI)可以通過抗氧化應(yīng)激,抗神經(jīng)毒物性物質(zhì)損傷,促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá),保護(hù)血腦屏障,降低炎性反應(yīng)達(dá)到抗阿爾茲海默癥的作用[26]。JANG C H等[42]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn),說明大豆異黃酮改善了大鼠卵巢切除模型的認(rèn)知功能,且通過抗氧化活性減輕一氧化氮生成,減輕β-淀粉樣蛋白肽(beta amyloid peptide,β-AP)毒性,改善β-AP導(dǎo)致的阿茲海默癥動(dòng)物模型神經(jīng)元死亡的損傷,還可以通過抗炎活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞信號通路和抗氧化活性減少神經(jīng)元死亡并防止神經(jīng)系統(tǒng)退化[42]??寡趸瘎ρ趸瘧?yīng)激密切相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病產(chǎn)生有益影響。
同時(shí)異黃酮被證明對另一種同樣常見的神經(jīng)性退行性疾病帕金森癥也具有一定的防治作用,金雀異黃素可保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受帕金森模型中脂多糖誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥的影響,同時(shí)異黃酮對多種組織中線粒體生物發(fā)生和自噬具有影響,帕金森被證明與線粒體自噬失調(diào)有關(guān),從而說明大豆產(chǎn)品中的異黃酮為帕金森提供了治療和一定的預(yù)防潛力[42]。
另外,通過芽孢桿菌發(fā)酵的大豆發(fā)酵品中因?yàn)楹懈吆康摩?聚-L-谷氨酸(γ-polyglutamic acid,γ-PGA),可以有效地提高葡萄糖代謝和記憶功能,也可以改善記憶功能[43],基于此結(jié)論可以研發(fā)相關(guān)提高記憶力的功能產(chǎn)品,GABA經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也被證實(shí)對抑郁癥有一定的作用,可以很好的改善小鼠的快感缺失、行為絕望等抑郁癥狀[44],但具體作用機(jī)制和與淡豆豉中其他物質(zhì)協(xié)同相關(guān),還是只與GABA相關(guān)需要進(jìn)一步研究探索。
2.2.3 其他臨床研究及功能成分
發(fā)酵大豆食品對于糖尿病、癌癥這類疾病也有一定的預(yù)防和治療作用。在發(fā)酵過程中,大豆的α-葡萄糖苷的活性顯著增加,尤其是在中后期有大幅增加達(dá)到較高水平,可以對高血糖和二型糖尿病起到治療作用[35]。除此之外,γ-氨基丁酸(GABA)通過試驗(yàn)表明,對于糖尿病也有一定的治療和預(yù)防作用[45-46],可以通過阻止脾細(xì)胞和MHC-Ⅱ蛋白識別來為治療一型糖尿病提供臨床靶點(diǎn)和其他治療資料[45]。
從發(fā)酵大豆中分離出異黃酮對慢性粒細(xì)胞白血病有一定的治療和預(yù)防作用,因?yàn)楫慄S酮可以誘導(dǎo)K562細(xì)胞周期停止,自噬甚至凋亡,通過對異黃酮抗白血病作用的轉(zhuǎn)基因組學(xué)研究,為白血病靶向治療等提供了新的治療方向[47]。淡豆豉中的提取物對癌細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)和促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡有一定的效果,最新研究發(fā)現(xiàn)[48-51],大豆異黃酮中的金雀異黃素可以通過使非編碼核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)失調(diào),達(dá)到抗腫瘤作用。
豆豉和淡豆豉作為中國傳統(tǒng)的兩種大豆發(fā)酵食品,有較高的藥用價(jià)值和食用價(jià)值,但是目前在食品領(lǐng)域關(guān)于豆豉的研究較多,主要集中于菌群、發(fā)酵工藝上,相關(guān)淡豆豉的研究較少,在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域相關(guān)臨床研究方面存在不足,尤其是物質(zhì)轉(zhuǎn)化和功能性成分研究比較單一,大部分還集中在異黃酮,近年我國來關(guān)于GABA的相關(guān)分析逐漸增多,但是相比于其他國家,我國在大豆發(fā)酵產(chǎn)品相關(guān)功能活性研究方面還有明顯差距。在日本,關(guān)于納豆臨床應(yīng)用起步早,并已經(jīng)取得了一定成果,而在韓國發(fā)酵食品作為功能性食品在多種疾病上的治療作用也被不斷強(qiáng)調(diào)[52],而豆豉和淡豆豉其中的活性成分價(jià)值還未被完全開發(fā),尤其是淡豆豉,作為歷史悠久的藥食兩用食材,需要對發(fā)酵過程中物質(zhì)變化情況進(jìn)行了解和掌握,研究功能物質(zhì)在不同疾病的具體臨床使用,對充分利用傳統(tǒng)發(fā)酵食品資源提供進(jìn)一步的參考依據(jù)。
隨著生物組學(xué)技術(shù)在食品中不斷深入應(yīng)用,逐步解釋了發(fā)酵食品中微生物作用機(jī)理,通過改良菌種,采用純菌發(fā)酵逐漸成為發(fā)酵工藝改進(jìn)的方向。
現(xiàn)在多有通過采用高活性菌發(fā)酵或多種菌種混合發(fā)酵,來提高產(chǎn)品中活性物質(zhì)含量。例如在細(xì)菌型豆豉中,通過利用前期篩選出的貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)進(jìn)行豆豉發(fā)酵,可以得到低生物胺水平的豆豉,在優(yōu)化發(fā)酵條件后,以最佳工藝參數(shù)進(jìn)行發(fā)酵后,得到的豆豉產(chǎn)品品質(zhì)優(yōu)異,具有典型的豉香味,生物胺含量降低,尤其是其中的精胺、酪胺、苯乙胺,提升了產(chǎn)品的安全性[53]。
豆豉纖溶酶作為從發(fā)酵豆制品中獲取高產(chǎn)菌種來生產(chǎn)的代謝產(chǎn)物,發(fā)展時(shí)間較長,相對工業(yè)發(fā)展也較為完善,最早是從豆豉中分離得到的具有溶纖能力的蛋白酶[54],在淡豆豉的炮制過程中也有發(fā)現(xiàn)[55],這幾年多用于降壓或預(yù)防高血壓相關(guān)藥物研究,以及應(yīng)用于針對高血壓人群研發(fā)的食品中。如通過前期篩選獲得優(yōu)良的貝萊斯芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)出的水豆豉,在優(yōu)化發(fā)酵條件中,其中豆豉纖溶酶活性約為市售水豆豉的400倍[56]。
除此之外,研究表明,通過從豆豉中分離出的貝萊斯枯草芽孢桿菌確定了表達(dá)蛋白酶的相關(guān)基因,采用基因工程技術(shù)對大腸桿菌進(jìn)行改造后,可將其作為工程菌大量生產(chǎn)蛋白纖溶酶這種天然溶栓劑,因?yàn)槠鋬r(jià)廉、安全、活性高,生產(chǎn)成本低,生長周期短的特點(diǎn),應(yīng)用前景廣闊且市場競爭力強(qiáng)[57]。
GABA作為淡豆豉中具有一定抗抑郁作用的活性成分,被認(rèn)為可能是淡豆豉解表除煩的主要成分[32],近年來備受關(guān)注,陳青峰[34]通過研究發(fā)現(xiàn),GABA的形成主要在淡豆豉發(fā)酵的再悶階段,推測乳酸菌、大腸桿菌、真菌、枯草芽孢桿菌等可能是GABA生產(chǎn)的主要發(fā)酵微生物。如果可以通過進(jìn)一步的研究確定生產(chǎn)GABA的菌種,并從淡豆豉中分離獲取優(yōu)秀生產(chǎn)菌種,對生產(chǎn)GABA并且用于其他功能性食品研發(fā)或優(yōu)化發(fā)酵菌種增強(qiáng)淡豆豉中GABA含量也有很大的幫助。
豆豉和淡豆豉作為我國傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品,在食品應(yīng)用領(lǐng)域范圍主要集中于發(fā)酵菌種改良,向低鹽化發(fā)展,二者中含有的微生物資源豐富,含有多種優(yōu)勢細(xì)菌和真菌,包括很多當(dāng)?shù)赝辽N,是可以充分進(jìn)行利用的菌種資源,并且很多菌種在功能性成分產(chǎn)生過程中起到了重要作用,也更具有開發(fā)和利用的價(jià)值。但對于不同地區(qū)淡豆豉中的發(fā)酵過程不同階段微生物組,以及各個(gè)階段優(yōu)勢菌種及相關(guān)代謝作用還有待進(jìn)一步研究。