劉正富 敖云勝 孫東紅 馬之攀

（重慶市計量質(zhì)量檢測研究院，重慶 409000）

地西泮為鎮(zhèn)靜劑類藥物，是一種安眠藥，具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗癲癇、抗驚厥等作用，用于治療焦慮癥、失眠、肌肉痙攣等疾病[1-2]。近幾年在水產(chǎn)品中檢出地西泮殘留的事件時有發(fā)生。一些不法商家為了保證水產(chǎn)品新鮮，在運輸過程中非法使用地西泮，用來降低水產(chǎn)品的新陳代謝，提高存活率，導(dǎo)致地西泮在水產(chǎn)品體內(nèi)殘留[3-4]。食用含有地西泮的水產(chǎn)品，會危害人體健康，引起嗜睡疲乏、動作失調(diào)、昏迷等癥狀，還可能使人體產(chǎn)生耐藥性。若以含有地西泮的水產(chǎn)品作為加工原料，將對水產(chǎn)品加工、水產(chǎn)品罐頭制造等輕工領(lǐng)域的產(chǎn)品質(zhì)量和安全產(chǎn)生影響。GB 31650-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定，地西泮在動物性食品中不得檢出。目前地西泮的檢測方法有液相色譜法[5]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]等，但是缺少對地西泮含量的不確定度評定的方法。本文建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定淡水魚中地西泮含量的不確定度的評定方法，確定測量過程中不確定度的來源[8-9],分析并計算出超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定淡水魚中地西泮含量的不確定度。

1 材料與方法

1.1 試劑、材料

甲醇、乙腈、氨水（色譜純）；QuECHERS（100 mg PSA、40 mg C18、600 mg 無水MgSO4，25 mL）；超純水（由ELGA 超純水系統(tǒng)提供）；淡水魚（市售，含有地西泮的試樣）；地西泮標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為1.000 mg/mL，相對擴展不確定度為1%（k=2），由阿爾塔公司提供）。

1.2 儀器

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（Waters Xevo TQ-S 三重四級桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源，美國沃特世公司）；電子天平（XPE 204，瑞士梅特勒-托利多公司）；高速冷凍離心機（Allegra 64R，貝克曼庫爾特公司）；渦旋儀（IKA MS3 Digital，艾卡公司）。

1.3 樣品前處理

稱取樣品2 g→加乙酸銨緩沖溶液8 mL，渦旋，靜置→加1%氨水-乙腈溶液15 mL，5.0 g 無水硫酸鈉提取→取上清液層溶液→剩余混合物中加入1%氨水-乙腈溶液15 mL 再次提取→取上清液層溶液，合并兩次提取有機相→QuECHERS 凈化→濃縮至近干→2.0 mL 的10%乙腈-水溶液溶解殘渣→過濾。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

移取0.5 mL 地西泮標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.000 mg/mL）于50 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到地西泮中間液（10 μg/mL）。移取0.5 mL 地西泮中間液于50 mL 容量瓶中，用甲醇定容，得到地西泮標(biāo)液（100 ng/mL）。分別移取地西泮標(biāo)液50 μL、100 μL、200 μL、500 μL、1 000 μL、2 000 μL 于6 個10 mL容量瓶，用空白基質(zhì)溶液定容，得到濃度為0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

1.5 儀器條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm 2.1×50 mm；柱溫：40.0℃；進(jìn)樣量：1 μL；流速：0.2 mL?min-1；流動相：乙腈、0.1%甲酸水。離子源：ESI+；離子對：定量285.2 ＞193，定性285.2 ＞154；錐孔電壓：90 V；碰撞能量：20 V。

2 數(shù)學(xué)模型

根據(jù)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定淡水魚中地西泮含量的原理，依據(jù)JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》、CNAS-GL006:2019《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》建立不確定度評定的數(shù)學(xué)模型，淡水魚中地西泮含量的計算公式為：

式（1）中：X為試樣中地西泮的含量，單位μg/kg；C為樣品溶液中地西泮的濃度，單位ng/mL；V為樣品溶液的體積，單位mL；m為試樣的質(zhì)量，單位g；R為回收率。

3 結(jié)果與分析

3.1 不確定度的來源

從測量過程的試驗步驟和數(shù)學(xué)模型分析，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定淡水魚中地西泮含量的不確定度來源如圖1所示。

圖1 不確定度的來源

3.2 測量重復(fù)性引入的不確定度

按照1.3 小節(jié)的方法測量試樣，測量數(shù)據(jù)及結(jié)果如表1 所示。

表1 重復(fù)性試驗

根據(jù)JJF 1059.1-2012 的評定方法，計算出淡水魚中地西泮含量的標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

試樣重復(fù)測量引入的不確定度為：

3.3 試樣稱重引入的不確定度

使用XPE204 電子天平稱取試樣，其檢定證書給出的允差為±0.000 2 g，按均勻分布實際稱取試樣質(zhì)量的平均值為2.023 7 g，則試樣稱重引入的不確定度為：

3.4 試樣定容體積引入的不確定度

試樣定容采用2 mL A 級單標(biāo)線吸取管，根據(jù)JJG 196-2006《常用玻璃量器》，2 mL A 級單標(biāo)線吸取管的容量允差為±0.010 mL，按均勻分布則吸取管引入的不確定度為：

在20℃時，乙腈的體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3℃-1，水的體積膨脹系數(shù)為2.08×10-4℃-1，則10%乙腈-水溶液的體積膨脹系數(shù)為3.24×10-4℃-1。實驗室環(huán)境溫度控制在（20±2）℃，按均勻分布則溫度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

因此，試樣定容體積引入的不確定度為：

3.5 樣品濃度引入的不確定度

3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量引入的不確定度

由阿爾塔公司提供的地西泮標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為1.000 mg/mL），相對擴展不確定度為1%（k=2），則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量引入的不確定度為：

3.5.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)溶液制備過程中，實驗室環(huán)境溫度為（20±2）℃，根據(jù)JJG 196-2006《常用玻璃量器》、JJG 646-2006《移液器》、CNAS-GL006:2019《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》，按均勻分布，標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程中所使用的體積因容量瓶與移液槍容量允差、溫度變化引入相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量如表2 所示。

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)溶液制備過程中，體積因容量允差引入的不確定度為：

標(biāo)準(zhǔn)溶液制備過程中，體積因溫度變化引入相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

因此，標(biāo)準(zhǔn)溶液制備引入的不確定度為：

3.5.3 線性擬合引入的不確定度

測量標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，6 個點通過最小二乘法擬合得到線性方程Y=5 106X+580，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液線性擬合數(shù)據(jù)如表3 所示。線性擬合引入的不確定度為：

表3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液線性擬合

3.5.4 儀器測量引入的不確定度

使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定淡水魚中地西泮含量，儀器根據(jù)JJF 1317-2011《液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀校準(zhǔn)規(guī)范》進(jìn)行校準(zhǔn)，查詢校準(zhǔn)證書，給出的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為3.6%（k=2），則儀器測量引入的不確定度為：

3.6 加標(biāo)回收引入的不確定度

在試樣中加入地西泮，按照1.3 小節(jié)的方法進(jìn)行測量，回收率為94.0%、95.2%、93.5%、94.3%、92.1%、96.7%，平均值為94.3%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.56%。加標(biāo)回收引入的不確定度為：

式（14）中：z為加標(biāo)回收試驗的次數(shù)；為平均回收率；S(R)為標(biāo)準(zhǔn)偏差。

當(dāng)置信度p=95%，自由度ν=n-1=5 時，查詢JJF 1059.1-2012 的t值分布表可得，t0.05,5=2.57。根據(jù)CNASGL006:2019，用t檢驗來評價平均回收率與1.0 是否有顯著性差異。

由于計算出來的t＞t0.05,5，說明平均回收率與1.0 有顯著性差異，淡水魚中地西泮的檢測結(jié)果需要進(jìn)行回收率校正，因此需要計算加標(biāo)回收引入的不確定度。

3.7 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

綜合以上結(jié)果，測定淡水魚中地西泮含量的不確定度分量如表4 所示。對表4 中的不確定度分量進(jìn)行合成，得到合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

表4 不確定度分量結(jié)果

3.8 擴展不確定度

當(dāng)?shù)~中地西泮含量為7.58 μg/kg 時，取置信水平為95%，k=2，淡水魚中地西泮的擴展不確定度為：

淡水魚中地西泮含量結(jié)果可表示為：X=(7.58±0.53)μg/kg，k=2。

4 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定淡水魚中地西泮含量的不確定度評定方法，通過對不確定度分量進(jìn)行分析，結(jié)果表明，天平稱取試樣重量對不確定度的影響很小，儀器測量、標(biāo)準(zhǔn)溶液制備對不確定度的影響較大。在今后的檢測工作中，確保儀器性能穩(wěn)定、關(guān)注標(biāo)準(zhǔn)溶液制備，從而確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。