陳芷羽,胡群祺,馬益琪,費(fèi)雪瑜,李想,蔣晨琳,王涵芝,瞿思穎,方劍喬,何曉芬,蔣永亮

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院康復(fù)醫(yī)學(xué)院,杭州 310053)

糖尿病神經(jīng)痛(diabetic neuropathic pain, DNP)是一種常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥,屬于典型的外周性神經(jīng)病理性疼痛[1]。DNP常表現(xiàn)為對(duì)熱和機(jī)械性刺激的敏感性增高。DNP癥狀可采用鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)的糖尿病鼠模型進(jìn)行模擬,STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型大鼠有較長(zhǎng)的病程,造模后可出現(xiàn)顯著的熱痛和機(jī)械痛變化[2],有很多研究通過(guò)檢測(cè)大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾來(lái)評(píng)價(jià)DNP模型[3-4]。

小膠質(zhì)細(xì)胞在調(diào)節(jié)DNP的形成中發(fā)揮著重要作用,已成為治療 DNP的重要靶點(diǎn)[5]。脊髓中離子鈣結(jié)合適配器分子(ionized calcium binding adapter molecule 1, Iba1)是小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物之一。脊髓背角離子通道型嘌呤能受體 P2X4(purinergic ligand-gated ion channel 4 receptor, P2X4R)在神經(jīng)病理性痛痛覺(jué)過(guò)敏中起重要作用,P2X4R的表達(dá)下調(diào),痛覺(jué)過(guò)敏癥狀明顯減輕甚至逆轉(zhuǎn)[6-7]。目前電針已被廣泛用于治療各種慢性疼痛,已有研究表明電針能緩解DNP[8-9],但其鎮(zhèn)痛機(jī)制有待進(jìn)一步明確和探究。已有研究表明,在坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷模型中,電針可能通過(guò)下調(diào)P2X4R表達(dá)以提高大鼠熱痛閾[10]。ZHENG Y等[11]研究表明電針可降低小膠質(zhì)細(xì)胞P2X4R的高表達(dá)緩解 L5脊神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的神經(jīng)病理痛,但電針對(duì)DNP模型大鼠脊髓P2X4R的干預(yù)作用有待研究。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立DNP大鼠模型來(lái)探討電針鎮(zhèn)痛是否與其有效干預(yù)脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞和P2X4R表達(dá)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠20只,體質(zhì)量(200±50)g,由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供,許可證號(hào)為SCXK(滬)2018—0006。大鼠在12 h明暗交替、溫度20～25 ℃、濕度45%～55%的環(huán)境中飼養(yǎng),允許大鼠自由攝食和飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)操作。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有的操作嚴(yán)格遵守《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》中對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行處置的相關(guān)規(guī)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

鏈脲佐菌素(S0130,美國(guó)Sigma),兔抗Iba1抗體(ab178846,英國(guó) Abcam),兔抗 P2X4抗體(APR-002,以色列 Alomone),山羊抗兔二抗(7074,美國(guó) CST),韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(HANS-200E,南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司),足底熱痛儀(37370,意大利 Ugobasile),血糖儀(德國(guó) Roche Diagnostics GmbH),純水儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific),全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices),電泳儀(美國(guó) Bio-Rad),轉(zhuǎn)印儀(美國(guó) Bio-Rad),凝膠成像儀(美國(guó) Bio-Rad),移液器(德國(guó)Eppendorf),pH計(jì)(瑞士METTLER TOLEDO)。

1.3 分組與模型制備

將20只大鼠隨機(jī)選取6只作為對(duì)照組,對(duì)其余14只大鼠禁食16 h后參照KAUR N等[12]造模方法予以腹腔注射STZ溶液(65 mg/kg),監(jiān)測(cè)大鼠體質(zhì)量、空腹血糖和熱痛閾?？崭寡侵怠?6.7 mmol·L-1,熱痛閾下降≥15%以上[13-14]則表示DNP造模成功。DNP造模成功的大鼠有12只。對(duì)照組大鼠予以注射等量的檸檬酸鈉緩沖液。

1.4 干預(yù)方法

電針干預(yù)于造模后第 14天開(kāi)始,選取自制的布套[15]將大鼠予以固定,根據(jù)邰昭霞等[16]實(shí)驗(yàn)大鼠選穴依據(jù),選取大鼠膝關(guān)節(jié)后外側(cè),在腓骨小頭下5 mm的足三里穴和大鼠后肢外踝尖與跟腱之間凹陷處的昆侖穴。用規(guī)格為0.25 mm×13 mm的針灸針進(jìn)行針刺,并連接電針儀進(jìn)行電針干預(yù),電針頻率為 2 Hz,強(qiáng)度為1～2 mA,每次治療30 min,每日1次,連續(xù)電針7 d。對(duì)照組和模型組大鼠于電針組干預(yù)的相同時(shí)間段不做任何干預(yù),僅予以固定,每次固定 30 min,連續(xù)固定7 d。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 空腹血糖測(cè)定

用尾靜脈采血檢測(cè)各組大鼠的空腹血糖,并在0 d、7 d、14 d、21 d測(cè)大鼠的體質(zhì)量。

1.5.2 熱痛閾測(cè)定

參照FEI X Y等[17]測(cè)定大鼠熱痛閾的方法,待大鼠安靜后采用足底熱痛儀照射大鼠足底中部直至其產(chǎn)生抬足、舔足的反應(yīng)時(shí)間,記作熱痛閾。檢測(cè)大鼠0 d、7 d、14 d、21 d足跖熱痛閾。

1.5.3 脊髓組織中Iba1和P2X4R蛋白表達(dá)檢測(cè)

參考杜俊英等[18]取大鼠脊髓背角的方法,腹腔注射戊巴比妥溶液麻醉大鼠并對(duì)其進(jìn)行開(kāi)胸,用生理鹽水快速灌注左心室及升主動(dòng)脈至大鼠肝臟發(fā)白。將大鼠開(kāi)背置于冰上,剪斷脊柱兩旁的肋骨,剪取L4節(jié)段以上約5 cm的脊柱,用50 mL注射器沖出脊髓,留取中間膨大區(qū)域并用刀片切取大鼠脊髓背角,放置超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。用Western blot法檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba1和P2X4R蛋白表達(dá)。取出大鼠脊髓背角,加入裂解液,勻漿后離心。用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量檢測(cè),再進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,將分離的蛋白電泳至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉,加入一抗,稀釋比依次為兔抗 Iba1(1:1 000),P2X4R(1:1 000),內(nèi)參β-actin抗體(1:5 000),4 ℃過(guò)夜。TBST洗滌3次后加入山羊抗兔二抗孵育1 h,用TBST洗滌3次,最后用ECL顯影。應(yīng)用Image J軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行圖像分析,計(jì)算目的蛋白與β-actin的灰度比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用多次重復(fù)測(cè)量方差分析方法分析,其余數(shù)據(jù)采用單因素方差(one-way ANOVA)分析;若方差齊,組間兩兩比較采用LSD法,若方差不齊則采用Dunnett’s T3分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量變化

各組大鼠 0 d體質(zhì)量比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與對(duì)照組比較,模型組和電針組大鼠在7 d、14 d、21 d體質(zhì)量明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與模型組比較,電針組大鼠在7 d體質(zhì)量上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化情況

2.2 各組大鼠空腹血糖變化

各組大鼠 0 d空腹血糖比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與對(duì)照組比較,模型組和電針組大鼠在7 d、14 d、21 d空腹血糖明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。詳見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠空腹血糖變化情況

2.3 各組大鼠熱痛閾變化情況

各組大鼠0 d和7 d熱痛閾比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與對(duì)照組比較,模型組大鼠在14 d、21 d熱痛閾明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與對(duì)照組比較,電針組大鼠在14 d熱痛閾明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與模型組比較,電針組大鼠在21 d熱痛閾明顯升高(P＜0.01)。詳見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠熱痛閾變化情況

2.4 各組大鼠脊髓Iba1、P2X4R蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組比較,模型組Iba1、P2X4R蛋白表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型組比較,電針組Iba1、P2X4R蛋白表達(dá)顯著減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見(jiàn)圖4、圖5。

圖4 各組大鼠脊髓Iba1蛋白表達(dá)情況

圖5 各組大鼠脊髓P2X4R蛋白表達(dá)情況

3 討論

糖尿病是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的慢性疾病之一[19],糖尿病神經(jīng)痛(DNP)是其常見(jiàn)的并發(fā)癥之一[20]。DNP在臨床上表現(xiàn)為肢體疼痛、感覺(jué)減退、麻木、灼熱、冰涼等,也可表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、痛覺(jué)過(guò)敏、痛覺(jué)超敏,甚至發(fā)展至糖尿病足潰瘍或需要截肢,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。STZ可誘發(fā)糖尿病[21],它可通過(guò)破壞胰島β細(xì)胞,導(dǎo)致血糖升高[22]。本實(shí)驗(yàn)采用單次腹腔注射STZ誘導(dǎo)DNP大鼠模型,STZ注射后大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降,空腹血糖明顯上升,在STZ注射2周后熱痛閾下降,且持續(xù)至模后3周,說(shuō)明DNP造模成功。

足三里為足陽(yáng)明胃經(jīng)的合穴,《靈樞·五邪》:“邪在脾胃,則病肌肉痛,陽(yáng)氣有余,陰氣不足,則熱中善饑;陽(yáng)氣不足,陰氣有余,則寒中腸鳴腹痛;陰陽(yáng)俱有余,若俱不足,則有寒有熱,皆調(diào)于三里?！庇纱丝梢?jiàn),除了本經(jīng)的作用養(yǎng)胃健脾,足三里還可以鎮(zhèn)痛、平衡陰陽(yáng)。有研究證明針刺足三里可以提高痛閾[23],臨床治療急性腎絞痛[24]、癌痛[25]、肩周炎[26]、三叉神經(jīng)痛[27]效果顯著。昆侖為足太陽(yáng)膀胱經(jīng)的經(jīng)穴,《針灸大成》中提到“昆侖主腰尻腳氣,足腨腫不得履地,鼽衄,腘如結(jié),踝如裂,頭痛,肩背拘急,咳喘滿,腰脊內(nèi)引痛……”,可見(jiàn)昆侖對(duì)身體各部有鎮(zhèn)痛作用,臨床多用來(lái)治療腰扭傷[28]、坐骨神經(jīng)痛[29]、眉棱骨痛[30]等,近年來(lái)在無(wú)痛分娩[31]方面也取得了成效。更有研究發(fā)現(xiàn),電針下肢穴位鎮(zhèn)痛效果比上肢更明顯[32],故本實(shí)驗(yàn)選取足三里和昆侖二穴治療DNP。研究結(jié)果表明,電針可提高DNP大鼠的熱痛閾。

研究發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑米諾環(huán)素[33]和P2X4R拮抗劑可抑制脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞和P2X4R的表達(dá)[4]。小膠質(zhì)細(xì)胞源性腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的合成與釋放與P2X4R密切相關(guān)[34-35]。周?chē)窠?jīng)損傷后,P2X4可通過(guò)刺激小膠質(zhì)細(xì)胞釋放 BDNF作用于脊髓背角神經(jīng)元的酪氨酸激酶B受體參與神經(jīng)痛[36]。王英等[37]研究表明,電針能夠通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)元內(nèi)生物活性物質(zhì)的合成與釋放以發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)。ZHENG Y等[38]研究還發(fā)現(xiàn)電針可通過(guò)下調(diào)大鼠脊髓P2X4R緩解神經(jīng)病理性疼痛。課題前期研究[39]表明,電針可能通過(guò)抑制DNP大鼠脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)和 BDNF的表達(dá)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。故本課題進(jìn)一步探究電針治療DNP除了與下調(diào)DNP大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞BDNF有關(guān)以外,是否還與其有效干預(yù)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞和 P2X4R有關(guān)。研究結(jié)果表明,STZ注射后模型組大鼠脊髓背角上小膠質(zhì)細(xì)胞和P2X4蛋白表達(dá)增多,電針可下調(diào)其蛋白表達(dá)。

綜上所述,低頻電針能有效改善糖尿病神經(jīng)痛,可能與其有效干預(yù)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞和 P2X4蛋白表達(dá)有關(guān)。