蔡沙沙，曾裔騰，鄧向點(diǎn)，張興鈺，何銀銀，張亞洲，鄒樹良

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)何首烏研究中心，貴州 貴陽 550025；2.貴州理工學(xué)院食藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

0 引言

何首烏為來源于蓼科植物何首烏(Polygonum Multiflorum Thunb)的干燥塊根，其性微溫，味苦、甘、澀。在中醫(yī)臨床上應(yīng)用于治療高脂血癥等相關(guān)的病證。何首烏廣泛分布于黃河流域以南的各個(gè)省份，并且在貴州省已有較大面積人工種植地區(qū)，對何首烏的發(fā)展也必將會(huì)對貴州省中藥種植產(chǎn)業(yè)起到一定有效推動(dòng)[1-5]。

何首烏樣品中化學(xué)成份較復(fù)雜，但與其功效相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)為其含有二苯乙烯苷和蒽醌類兩類主要化學(xué)成份[5-7]。作為物質(zhì)基礎(chǔ)的一類是大黃素和大黃素甲醚為蒽醌類，已有的研究證實(shí)其是何首烏藥材產(chǎn)生肝毒性的主要原因；而另一類則是二苯乙烯苷成份，其被認(rèn)為在一定程度上具有對肝臟功能的保護(hù)作用。二苯乙烯苷實(shí)驗(yàn)應(yīng)用總結(jié)中能夠產(chǎn)生降血脂的作用，并在對抗衰老、抑制腫瘤等方面具有較好的生理活性，在當(dāng)前老齡化的大情況下，對其進(jìn)行研究有重要的現(xiàn)實(shí)實(shí)際意義[6-7]。

本研究擬通過對何首烏中所含有的二苯乙烯苷采用一定的提取方法進(jìn)行有效的優(yōu)化篩選，對提取過程中的影響因素進(jìn)行考察，以期在一定程度與范圍內(nèi)優(yōu)化出最佳的提取條件，將來為何首烏中二苯乙烯苷的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)[8]。

1 儀器與材料

儀器：高效液相色譜儀，Agilent 1260，安捷倫公司；色譜柱：phenomenex，Gemini，4.6 mm×250 mm，5 μm，51234-9，菲羅門公司；分析天平，BSA124S，賽多利斯科學(xué)儀器公司；烘箱、干燥器、稱量瓶、托盤、小型打粉機(jī)和藥典篩等。

試劑：HPLC級(jí)的乙腈，0201028；HPLC級(jí)的甲醇，20201017；乙腈與甲醇均購自科龍公司；其他試劑與提取用乙醇為分析純試劑；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水，20201121；二苯乙烯苷對照品，20200719，含量>99%，購于四川成都德思特公司。

材料：本次實(shí)驗(yàn)所選用的何首烏藥材樣品來源于合作單位銅仁市供銷聯(lián)社提供(批號(hào)：20180517)，切片晾干，如圖1所示，收集日期為2018年4月7日，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)張亞洲老師進(jìn)行了其來源鑒定，確定為Polygonum multiflorum Thunb的干燥塊根(按2020版《中國藥典》中何首烏項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測，二苯乙烯苷的含量為4.48%，藥材含水份的量為11.92%；證明所選用的何首烏符合2020版《中國藥典》中何首烏的要求，為合格藥材)。

圖1 銅仁-生何首烏

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

本次實(shí)驗(yàn)分析條件參考《中國藥典》中何首烏項(xiàng)下要求進(jìn)行，分析時(shí)的流速確定為1.0 mL/min，流動(dòng)相使用水∶乙腈為80∶20的條件下進(jìn)行，分析過程中進(jìn)行等度分析，其檢測時(shí)設(shè)定的檢測波長為320 nm。

對照溶液配制：精密稱取二苯乙烯苷對照品117.0 mg，依據(jù)配制原則進(jìn)行配制，最后配制為濃度約0.234 mg/mL的溶液，10 μL進(jìn)樣，記錄峰面積分析，結(jié)果如圖2所示。

圖2 二苯乙烯苷對照品溶液的色譜圖

樣品處理：按提取實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行提取后，得到各次的實(shí)驗(yàn)所得溶液，用0.45 μm濾膜過濾該溶液后得濾液，再取以上濾液移取1 mL到10 mL量瓶中，50%乙醇至刻度搖勻后即得樣品溶液，10 μL進(jìn)樣。色譜峰顯示二苯乙烯苷能夠獲得較好的分離效果，如圖3所示。

圖3 何首烏樣品的色譜圖

2.2 分析指標(biāo)成份的線性關(guān)系

標(biāo)準(zhǔn)曲線制定：精密稱取所購含量符合要求的二苯乙烯苷對照品；萬分之一天平精密讀數(shù)為117.0 mg，在50 mL的量瓶中50%乙醇為溶液進(jìn)行溶解并至刻度后搖勻即得M。

精密移取M中溶液為6.0，5.0，4.0，3.0，2.0，1.0，0.5，0.1 mL分別置于10 mL量瓶中，50%乙醇至刻度搖勻后即得各對照溶液，分別10 μL進(jìn)樣，記錄色譜峰面積為縱坐標(biāo)Y，以進(jìn)樣二苯乙烯苷的實(shí)際質(zhì)量為橫坐標(biāo)X，X與Y兩變量得到的回歸方程為Y=3 378.38X+151.82(r=0.999 9)。

結(jié)果表明二苯乙烯苷的質(zhì)量在0.234～7.020 μg的范圍內(nèi)與儀器檢測時(shí)對應(yīng)的峰面積有好的線性關(guān)系，符合含量測定時(shí)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線的規(guī)定要求。

2.3 何首烏中二苯乙烯苷的提取正交工藝考察

何首烏提取二苯乙烯苷采用50%乙醇為溶劑，取打粉過篩后備用何首烏樣品30 g，提取時(shí)主要影響因素設(shè)定4個(gè)，每個(gè)因素下設(shè)3個(gè)水平，分別是提取的次數(shù)(1，2，3)、溶劑加入的倍數(shù)(12，10，10；10，8，8；8，6，6)、提取各次的時(shí)間(30，45，60 min)和是否需要浸泡的時(shí)間(浸泡0，0.5，1.0 h)進(jìn)行，按L9(34)安排正交實(shí)驗(yàn)，提取溶液紗布濾過后合并使用，按上述2.1項(xiàng)下樣品的溶液進(jìn)行配制、分析，因素與水平如表1所示。

表1 因素與水平

由于選定二苯乙烯苷作為何首烏的提取研究對象，實(shí)驗(yàn)考察評(píng)價(jià)中選用二苯乙烯苷的含量作為分析評(píng)價(jià)指標(biāo)，試驗(yàn)的具體安排和試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，表2中，R為極差，Kn為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)值之和。對最后結(jié)果按方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后如表3所示。

表2 正交試驗(yàn)安排與結(jié)果

表3 方差分析

從選定的各個(gè)因素來看，方差分析結(jié)果表明其影響因素對二苯乙烯苷的提取均無顯著的影響，但綜合分析發(fā)現(xiàn)實(shí)際上的具體影響大小則為A>C>B。最后確定最優(yōu)工藝為A2B3C2D3(即需要提取前浸泡1 h，加稀乙醇的量為12、10倍，提取的次數(shù)為2次，提取時(shí)間為60 min)。

此項(xiàng)研究結(jié)果的影響情況還應(yīng)綜合工業(yè)生產(chǎn)時(shí)的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益、時(shí)間效益和人力成本等進(jìn)行綜合評(píng)估。

2.4 何首烏中二苯乙烯苷提取工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)考察

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：具體操作按所確定的最優(yōu)提取方法進(jìn)行提取。樣品的配制按前述樣品處理中方法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表明其選取的優(yōu)化提取條件對何首烏中含有的二苯乙烯苷的重復(fù)性、提取效率均達(dá)到了較好的效果，二苯乙烯苷的提取率達(dá)到95.74% (RSD為0.67%，n=3)。

3 結(jié)語

實(shí)驗(yàn)研究中極其重要的是對實(shí)驗(yàn)中的評(píng)價(jià)指標(biāo)的合理選取，對何首烏的總結(jié)發(fā)現(xiàn)由于二苯乙烯苷是何首烏中關(guān)鍵的指標(biāo)性成分，本工作的目的是優(yōu)選有效條件來進(jìn)行提取二苯乙烯苷，為后續(xù)研究需要大量二苯乙烯苷提供了有效可行的途徑，所以本研究采用二苯乙烯苷的樣品含量作為它們提取效率好壞的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

在實(shí)驗(yàn)操作中發(fā)現(xiàn)：藥材的水份測定時(shí)要嚴(yán)格按要求進(jìn)行，藥粉厚度不要太厚，樣品從烘箱中取出放在干燥器中時(shí)一定要快速，且稱量時(shí)保持在干燥器中時(shí)間應(yīng)盡可能一致，藥材樣品的保存上要做好防蟲防潮。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過分析處理得出以下結(jié)論：

(1)提取過程中選定的影響因素均對提取效率表現(xiàn)為不顯著影響，但是提取的次數(shù)中，提取2次與提取3次效果優(yōu)于只提取1次的效果，提取2次與提取3次比較后發(fā)現(xiàn)其差異較不明顯，為節(jié)省提取時(shí)間與溶劑考慮，選取的提取次數(shù)為2次。

(2)比較發(fā)現(xiàn)后選取提取溶劑加入量12、10倍量優(yōu)于10、8倍及8、6倍，確定提取溶劑加入量為12、10倍。

(3)比較發(fā)現(xiàn)選取的提取時(shí)間60 min優(yōu)于45 min和30 min，確定提取的時(shí)間為1 h。

(4)通過浸泡而提高提取效率有利于節(jié)省提取的溶劑和提取的能耗，其方法較為可取，對藥材需要浸泡的時(shí)間，比較后選定了1 h 的浸泡時(shí)間較好。

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性、平行性較好，也說明對何首烏中二苯乙烯苷提取時(shí)，在選定的影響條件下50%乙醇對指標(biāo)成份的溶解性較好，提取效率也較高。本研究工作結(jié)果將為何首烏中活性成份二苯乙烯苷的開發(fā)與利用奠定前期的條件基礎(chǔ)。