張紅梅， 梁艷麗， 席 源， 魏 容， 周慧君

(遂寧市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川省遂寧市629000)

卵巢癌是女性生殖器最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，疾病早期缺乏有效的診斷生物學(xué)標(biāo)志物，約70%患者確診時(shí)已是晚期，5年生存率低于30%[1]。miRNA是一類(lèi)具有調(diào)控基因表達(dá)功能的小分子RNA，血清miRNA表達(dá)水平與腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移相關(guān)[2]。血清中miRNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，難降解，可在-80 ℃條件下長(zhǎng)期保存，有成為疾病診斷生物學(xué)標(biāo)志物的潛質(zhì)[3]。卵巢癌患者的血清中存在著多種miRNA的異常表達(dá)，miRNA的異常表達(dá)可靶向調(diào)控其下游的靶基因，促進(jìn)疾病的發(fā)展[4]。miR-205-5p是miRNA家族中的一種，其在多種腫瘤患者血清中均呈高表達(dá)，且與腫瘤惡性程度具有一定的相關(guān)性[5-6]。但是目前關(guān)于miR-205-5p在卵巢癌中研究的報(bào)道較為少見(jiàn)，因此本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測(cè)卵巢癌患者血清中miR-205-5p表達(dá)水平，并分析其臨床預(yù)后意義，為卵巢癌的臨床診斷和治療提供參考。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

選擇本院婦產(chǎn)科2016年1月—2017年12月收治的卵巢癌患者98例為卵巢癌組，另選取同期健康體檢女性98例為健康組。兩組一般資料比較差異無(wú)顯著性(P>0.05；表1)。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者和家屬均知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：①組織活檢確診為卵巢癌；②臨床資料完整；③肝腎功能正常；④進(jìn)行手術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠或哺乳；②伴有嚴(yán)重心、腦、肺功能障礙；③合并其他或嚴(yán)重婦科疾?。虎芊暖熁蚧熓?。

表1 兩組基本資料的比較(n=98)

1.2 主要試劑及儀器

RNA提取試劑盒(批號(hào)20132154)、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)2041245)、qRT-PCR試劑盒(批號(hào)2145874)均購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物有限公司。伯樂(lè)Mini-PRO熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.3 qRT-PCR

卵巢癌患者術(shù)前1天及術(shù)后7天各抽血1次，采集空腹靜脈血，健康組體檢當(dāng)天抽血。3 000 r/min，離心15 min，取上清置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)RNA試劑盒提取血清總RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA保存至-80 ℃?zhèn)溆?。qRT-PCR體系：SYBR Green qPCR SuperMix 16.25 μL，特異性引物2.0 μL，模板cDNA 3.25 μL，DEPC水補(bǔ)足至30 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s；70 ℃ 30 s；共40個(gè)循環(huán)。設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，根據(jù)公式(2-ΔΔCT法)計(jì)算mRNA表達(dá)情況。

1.4 隨訪(fǎng)

以門(mén)診或電話(huà)隨訪(fǎng)的方式進(jìn)行3年隨訪(fǎng)，半年1次，隨訪(fǎng)終點(diǎn)為2020年12月止或患者死亡時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 兩組血清miR-205-5p表達(dá)水平的比較

與健康組比較，卵巢癌組血清miR-205-5p表達(dá)水平更高(P<0.05)；與術(shù)前比較，卵巢癌組術(shù)后miR-205-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05；表2)。

表2 兩組血清miR-205-5p表達(dá)水平的比較

2.2 血清miR-205-5p對(duì)卵巢癌的診斷價(jià)值

ROC曲線(xiàn)結(jié)果顯示，血清miR-205-5p診斷卵巢癌的曲線(xiàn)下面積為0.810，最佳截?cái)嘀禐?.28，靈敏度為89.79%，特異度為86.73%(圖1)。

圖1 血清miR-205-5p對(duì)卵巢癌診斷價(jià)值的ROC曲線(xiàn)

2.3 miR-205-5p與卵巢癌患者臨床特征的關(guān)系

以術(shù)前血清miR-205-5p表達(dá)水平8.08為界值，將卵巢癌患者分為miR-205-5p低表達(dá)組(48例)和miR-205-5p高表達(dá)組(50例)，兩組患者腫瘤分化程度和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況比較，差異有顯著性(P<0.05；表3)。

表3 miR-205-5p與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4 miR-205-5p表達(dá)水平與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系

miR-205-5p低表達(dá)卵巢癌患者生存期、1年生存率、3年生存率均高于高表達(dá)卵巢癌患者(P<0.05；表4)。

表4 miR-205-5p表達(dá)水平與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.5 影響卵巢癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析

經(jīng)多因素Cox分析得出，腫瘤分化程度低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和miR-205-5p呈高表達(dá)均為影響卵巢癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05；表5)。

表5 影響卵巢癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析

3 討 論

卵巢癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在女性惡性腫瘤中僅次于宮頸癌和子宮體癌，卵巢上皮癌在各種類(lèi)型卵巢癌中死亡率最高[7]。由于卵巢體積小且位于盆腔內(nèi)，導(dǎo)致卵巢癌早期臨床癥狀不明顯，且難以發(fā)現(xiàn)，因此患者容易錯(cuò)過(guò)早期的最佳治療時(shí)間。當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生迅速增殖和擴(kuò)散，導(dǎo)致患者癌細(xì)胞擴(kuò)散至盆腔內(nèi)臟器時(shí)，往往已經(jīng)到了疾病的晚期，患者病情加重，臨床治療困難。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年全球預(yù)計(jì)卵巢癌確診病例為29.5萬(wàn)，中國(guó)卵巢癌發(fā)病率為5.37例/10萬(wàn)，死亡率為2.22例/10萬(wàn)[8]。因此尋找有效的、新穎的檢測(cè)方法和治療靶點(diǎn)，以提高卵巢癌早期發(fā)現(xiàn)率、個(gè)性化治療及預(yù)后是一個(gè)迫切的問(wèn)題。

miR-205-5p是miR-205-5家族中的一種，已被證實(shí)在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，肺癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌和胃癌患者血清miR-205-5p異常高表達(dá)，表明在多種腫瘤中miR-205-5p均可作為一項(xiàng)有價(jià)值的檢測(cè)指標(biāo)，有成為潛在生物學(xué)標(biāo)志物的可能性[9-10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組血清miR-205-5p表達(dá)水平顯著高于健康組，表明卵巢癌的發(fā)生會(huì)引起機(jī)體血清miR-205-5p的異常高表達(dá)，因此miR-205-5p異常升高可能與卵巢癌發(fā)生具有一定的相關(guān)性。同時(shí)本研究還檢測(cè)了卵巢癌患者術(shù)前、術(shù)后血清miR-205-5p表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)手術(shù)后患者miR-205-5p表達(dá)水平較術(shù)前顯著降低，表明當(dāng)疾病終止時(shí)，患者血清miR-205-5p有趨向正常水平的趨勢(shì)，進(jìn)一步說(shuō)明了miR-205-5p與卵巢癌發(fā)展密切相關(guān)，也提示miR-205-5p有成為卵巢癌治療靶點(diǎn)的可能性。

已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-205-5p對(duì)腫瘤細(xì)胞分化、增殖及轉(zhuǎn)移均具有調(diào)控作用[11]。目前認(rèn)為其作用機(jī)制為miR-205-5p高表達(dá)可作用于抑癌基因的上游靶位點(diǎn)，從而抑制抑癌基因表達(dá)，為腫瘤細(xì)胞增殖和分化提供了良好的體內(nèi)環(huán)境基礎(chǔ)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌患者血清中存在著多種miRNA的異常表達(dá)，miR-199a、miR-9、miR-223等在卵巢癌患者中均表達(dá)異常[13-15]。而本研究分析miR-205-5p在卵巢癌患者血清的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者血清miR-205-5p的表達(dá)水平與腫瘤的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否密切相關(guān)，患者腫瘤分化程度越低，血清miR-205-5p表達(dá)水平越高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增加，這表明miR-205-5p表達(dá)水平與患者的疾病進(jìn)程具有密切的相關(guān)性，患者腫瘤惡性程度高，同時(shí)癌細(xì)胞發(fā)生擴(kuò)散均可導(dǎo)致miR-205-5p表達(dá)水平升高，進(jìn)一步說(shuō)明miR-205-5p可作為卵巢癌患者診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。本研究還對(duì)卵巢癌患者的生存時(shí)間進(jìn)行了分析發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者miR-205-5p高表達(dá)組1年和3年生存率均顯著低于miR-205-5p低表達(dá)組，提示miR-205-5p的表達(dá)水平對(duì)卵巢癌術(shù)后患者的康復(fù)情況有一定的影響，miR-205-5p高表達(dá)可能不利于卵巢癌患者的預(yù)后。多因素Cox分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤分化程度低、腫瘤細(xì)胞有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和miR-205-5p呈高表達(dá)水平均是影響卵巢癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，因此對(duì)以上患者治療后應(yīng)密切關(guān)注其康復(fù)情況。同時(shí)本研究也存在一定的局限性，后期應(yīng)加大樣本量的收集，同時(shí)對(duì)多個(gè)miRNA進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，以找到最有效的靶點(diǎn)。

綜上所述，卵巢癌患者血清miR-205-5p表達(dá)水平異常升高，同時(shí)miR-205-5p異常高表達(dá)可能會(huì)引起患者腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)增加，術(shù)后生存率可能降低，因此miR-205-5p有成為臨床卵巢癌治療靶點(diǎn)的可能。