孫 睿， 王振紅， 謝欣怡

(1.江蘇省人民醫(yī)院溧陽分院麻醉科，江蘇省溧陽市 213300；2.南京市第一醫(yī)院麻醉科，江蘇省南京市 210000)

隨著各類手術(shù)和無痛診療技術(shù)的不斷發(fā)展，全身麻醉的應(yīng)用范圍也越來越廣泛[1]。右美托咪定是臨床常用的麻醉藥物，屬于高選擇性α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑，盡管右美托咪定在實(shí)踐中體現(xiàn)出良好的應(yīng)用價(jià)值，但術(shù)后對(duì)患者循環(huán)、呼吸的抑制作用無法立即恢復(fù)正常，需要采取必要手段使患者盡快蘇醒，以減少相關(guān)并發(fā)癥[2]。阿替美唑是α2-腎上腺素能受體的拮抗劑，具有高效性、高特異性和高專一性的特點(diǎn)，但其臨床應(yīng)用仍需要更多的安全性研究[3]。銀杏葉提取物是從銀杏葉中分離純化的提取物，具有抗炎、抗氧化、保護(hù)神經(jīng)、增強(qiáng)記憶等生理活性[4]。本研究旨在探討銀杏葉提取物對(duì)右美托咪定麻醉小鼠催醒作用及其潛在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

32只昆明種小鼠，清潔級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(京)2019-0001。銀杏葉提取物滴劑(德國威瑪舒培博士藥廠)，右美托咪定(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，阿替美唑(美國輝瑞動(dòng)物保健品有限公司)，Ca2+ATP酶、Mg2+-ATP酶、一氧化氮(nitric oxide,NO)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，鳥苷酸環(huán)化酶(guanylate cyclase，cGMP)ELISA試劑盒(上海一基生物試劑有限公司)，Orexin A、Orexin B、β-actin蛋白一抗(美國Abcam)。

1.2 動(dòng)物分組與處理

取32只昆明種小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、阿替美唑組、銀杏葉提取物低劑量組(低劑量組)及銀杏葉提取物高劑量組(高劑量組)，每組8只；各組小鼠腹腔注射1 mg/kg右美托咪定，90 min后分別注射2 mg/kg阿替美唑、50 mg/kg及100 mg/kg銀杏葉提取物，對(duì)照組以生理鹽水替代。

1.3 鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛評(píng)估

參照Granholm等[5]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，于右美托咪定給藥后90、95、120及180 min，對(duì)小鼠進(jìn)行鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛評(píng)分，其中鎮(zhèn)靜評(píng)分從自主體位(0～4分)、對(duì)聲音刺激的反應(yīng)(0～3分)、下頜及舌張力(0～3分)方面進(jìn)行評(píng)估，總分值越高表明鎮(zhèn)靜效果越好；用鉗夾鼠爪進(jìn)行鎮(zhèn)痛評(píng)分(0～3分)，分值越高表明鎮(zhèn)痛效果越好。

1.4 蘇醒時(shí)間記錄

以小鼠翻正反射消失持續(xù)時(shí)間為蘇醒時(shí)間。翻正反射消失評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)為連續(xù)3次仰臥后5 s無法恢復(fù)站立，翻正反射恢復(fù)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)為連續(xù)3次仰臥后可恢復(fù)站立[6]。

1.5 取材

各組小鼠蘇醒并完成鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛評(píng)估后斷頭處死，迅速取出腦組織，放入生理鹽水制備組織勻漿液，2 000 r/m離心10 min，分離上清液凍存待測(cè)。

1.6 腦組織Ca2+、Mg2+-ATP酶活性、NO、NOS及cGMP含量檢測(cè)

采用比色法，檢測(cè)各腦區(qū)Ca2+、Mg2+-ATP酶、NO及NOS含量，采用ELISA法檢測(cè)cGMP含量，蛋白定量后，以每小時(shí)每毫克組織蛋白中ATP產(chǎn)生的1 mol無機(jī)磷的量為一個(gè)ATP酶活力單位。

1.7 腦組織Orexin A和Orexin B蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用蛋白印跡法檢測(cè)腦組織中Orexin A和Orexin B蛋白表達(dá)，提取腦組織總蛋白，定量后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，再轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，放入封閉液中室溫孵育2 h，再分別加入Orexin A、Orexin B、β-actin蛋白一抗(1∶1 000)4 ℃下孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的蛋白二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，最后暗室中曝光顯影，結(jié)果用Image J軟件進(jìn)行灰度值定量，計(jì)算目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析與處理，計(jì)量資料采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 銀杏葉提取物對(duì)右美托咪定麻醉小鼠鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛評(píng)分的影響

右美托咪定麻醉90 min時(shí)，各組鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛評(píng)分的比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；麻醉給藥95、120及180 min時(shí)，與對(duì)照組比較，阿替美唑組和高劑量組鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛評(píng)分均降低(P<0.05)，且麻醉給藥95、120及180 min時(shí)，阿替美唑組和低劑量組鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；表1)。

表1 銀杏葉提取物對(duì)右美托咪定麻醉小鼠鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛評(píng)分的影響 單位：分

2.2 銀杏葉提取物對(duì)右美托咪定麻醉小鼠蘇醒時(shí)間的影響

對(duì)照組、阿替美唑組、低劑量組及高劑量組小鼠蘇醒時(shí)間分別為(90.56±11.84) min、(24.35±5.58) min、(83.62±10.62) min、(42.68±7.14) min，各組蘇醒時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較，阿替美唑組和高劑量組蘇醒時(shí)間縮短，且阿替美唑組蘇醒時(shí)間短于高劑量組(P<0.05)。

2.3 銀杏葉提取物對(duì)右美托咪定麻醉小鼠腦組織Ca2+、Mg2+-ATP酶活性的影響

與對(duì)照組比較，阿替美唑組和高劑量組Ca2+、Mg2+-ATP酶活性升高(P<0.05)，阿替美唑組和低劑量組Ca2+、Mg2+-ATP酶活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；表2)。

表2 銀杏葉提取物對(duì)右美托咪定麻醉小鼠腦組織Ca2+、Mg2+-ATP酶活性的影響 單位：mol Pi/(mg·h)

2.4 銀杏葉提取物對(duì)右美托咪定麻醉小鼠腦組織NO/cGMP信號(hào)通路的影響

與對(duì)照組比較，阿替美唑組和高劑量組NO、NOS活性及cGMP水平升高(P<0.05)，阿替美唑組和低劑量組NO、NOS活性及cGMP水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；表3)。

表3 銀杏葉提取物對(duì)右美托咪定麻醉小鼠腦組織NO/cGMP信號(hào)通路的影響

2.5 銀杏葉提取物對(duì)右美托咪定麻醉小鼠腦組織Orexin系統(tǒng)的影響

與對(duì)照組比較，阿替美唑組和高劑量組OrexinA和OrexinB蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，阿替美唑組和低劑量組OrexinA和OrexinB蛋白表達(dá)的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05;圖1和表4)。

圖1 小鼠腦組織Orexin系統(tǒng)的表達(dá)

表4 銀杏葉提取物對(duì)右美托咪定麻醉小鼠腦組織Orexin系統(tǒng)的影響

3 討 論

高齡、電解質(zhì)紊亂、麻醉藥物、體溫過低等因素均可引起患者全麻后蘇醒延遲[7]。臨床使用藥物催醒存在一定的不良反應(yīng)，需要探索高效、安全的催醒手段。銀杏葉提取物是目前應(yīng)用最為廣泛的植物藥提取物之一，含有黃酮類、萜類內(nèi)酯、有機(jī)酸等多種活性成分，常用于心腦血管疾病的治療[8]。近期研究表明，銀杏葉提取物對(duì)患者全身麻醉后認(rèn)知功能障礙具有防治作用[9]。同時(shí)，本課題前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)右美托咪定麻醉小鼠注射銀杏葉提取物后可加快小鼠的蘇醒，但具體機(jī)制尚不清楚。蘇醒延遲是全身麻醉常見的并發(fā)癥，本研究以不同劑量銀杏葉提取物處理右美托咪定麻醉小鼠，發(fā)現(xiàn)高劑量銀杏葉提取物可明顯降低麻醉小鼠的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛評(píng)分，顯著縮短其蘇醒時(shí)間。

ATP酶是一類能將ATP水解為二磷酸腺苷和磷酸根離子的酶，普遍存在于活細(xì)胞內(nèi)，參與物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞及維持細(xì)胞膜完整等過程[10]。Ca2+、Mg2+-ATP酶是體內(nèi)的鈣離子泵，可維持細(xì)胞內(nèi)低含量的游離Ca2+，其活性水平反映出線粒體功能和能量代謝水平[11]。據(jù)報(bào)道，麻醉過程中，麻醉藥物可引起腦組織突觸體Ca2+、Mg2+-ATP酶活性的變化，引起突觸內(nèi)Ca2+含量變化，釋放突觸前異質(zhì)性神經(jīng)遞質(zhì)，阻滯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)揮麻醉性鎮(zhèn)痛作用[12]。本研究結(jié)果顯示，注射銀杏葉提取物后腦組織Ca2+、Mg2+-ATP酶活性明顯提高，有利于維持神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量低穩(wěn)態(tài)，從而降低右美托咪定的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛效果，縮短小鼠蘇醒時(shí)間。

NO/cGMP信號(hào)通路是胞內(nèi)重要的信號(hào)通路，參與多種生理過程，如細(xì)胞生長、神經(jīng)傳遞、肌肉收縮等[13]。NO/cGMP信號(hào)通路與中樞神經(jīng)通路的興奮性與抑制性密切相關(guān)，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)NO、cGMP含量升高可引起興奮性，維持機(jī)體清醒狀態(tài)[14]。本研究中，高劑量銀杏葉提取物可提高小鼠腦組織中NO、NOS活性及cGMP水平，這可能也是銀杏葉提取物促進(jìn)麻醉小鼠蘇醒的潛在途徑之一。

腦內(nèi)睡眠和覺醒系統(tǒng)對(duì)于睡眠和覺醒的產(chǎn)生與維持有重要作用，神經(jīng)肽Orexins作為覺醒系統(tǒng)的主要成分，由下丘腦神經(jīng)元產(chǎn)生，還可參與機(jī)體攝食、能量代謝、免疫功能等生理調(diào)控[15]。Orexins系統(tǒng)的激活有助于麻醉蘇醒和疼痛控制[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于對(duì)照組，高劑量銀杏葉提取物組OrexinA和OrexinB蛋白表達(dá)量升高，表明銀杏葉提取物可能通過促進(jìn)Orexins系統(tǒng)，發(fā)揮催醒作用。雖然阿替美唑的催醒效果最好，但銀杏葉提取物也能縮短蘇醒所用時(shí)間，且其耐受性良好，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，銀杏葉提取物對(duì)右美托咪定麻醉小鼠具有催醒作用，可能與提高Ca2+、Mg2+-ATP酶活性、促進(jìn)NO/cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和Orexin系統(tǒng)有關(guān)，這為臨床催醒藥物的選擇提供了新的思路。