吳明月， 黃紫霞， 許 鋒， 龔 俊， 熊 韜， 王睎之， 王德明

(1.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院麻醉科，湖南省衡陽市421001；2.南華大學(xué)船山學(xué)院，湖南省衡陽市421001)

內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙和形態(tài)學(xué)損傷可導(dǎo)致白細(xì)胞黏附、血小板活化、氧化應(yīng)激和炎癥，進(jìn)而促進(jìn)動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)的形成[1-2]。預(yù)防血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷對于防治As性疾病具有重大意義。扁塑藤素(pristimerin，Pri)是一種天然三萜系化合物，扁塑藤素及其相關(guān)化合物表現(xiàn)出抗炎、抗氧化和抗瘧疾的活性，以及對不同類型癌癥的抗腫瘤作用[3-5]。本實驗擬建立脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)損傷模型，探究扁塑藤素對LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制，從而為扁塑藤素的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

HUVEC(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；LPS(Sigma-Aldrich 公司，美國)；扁塑藤素(Santa cruz公司，美國)； CCK-8試劑盒(GLPBIO公司，美國)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；人白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β) 、IL-18酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)試劑盒(R&D Systems,美國)；GAPDH抗體(Proteintech公司，美國)；Anti-pro Caspase-1+p10+p12抗體(Abcam,ab179515)；GSDMD抗體(Santa cruz,sc-393656)；NLRP3抗體(Novusbio,NBP2-12446SS);RNA快速提取試劑盒(奕杉生物科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒(Takara,日本)。

1.2 HUVEC培養(yǎng)及分組

HUVEC用含10%FBS、1%青鏈霉素雙抗DMEM高糖完全培養(yǎng)基,在37 ℃、5%CO2、95%空氣的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HUVEC細(xì)胞分為對照組、LPS組(10 mg/L)、低、中、高劑量(0.1、0.2、0.4 μmol/L)扁塑藤素組。根據(jù)分組分別加入培養(yǎng)基、含終質(zhì)量濃度為10 mg/L LPS的培養(yǎng)基或含LPS+低、中、高劑量扁塑藤素的培養(yǎng)基。各給藥組的扁塑藤素均在LPS刺激前2 h加入，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,用于后續(xù)檢測分析。

1.3 CCK-8法檢測HUVEC細(xì)胞活力

在96孔板中加入100 μL HUVEC細(xì)胞懸液(6×102個/L)，培養(yǎng)箱中孵育12 h，預(yù)實驗確定LPS質(zhì)量濃度。給藥 24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑后繼續(xù)培養(yǎng)2 h。酶標(biāo)儀450 nm處測定各組光密度，計算細(xì)胞增殖活力。HUVEC增殖活力(%)=(OD給藥-OD空白)/(OD對照-OD空白)×100%。

1.4 乳酸脫氫酶釋放實驗

收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，使用乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒，按照說明書測定乳酸脫氫酶水平。酶標(biāo)儀490 nm處測定各組樣品光密度。

1.5 ELISA檢測IL-18、IL-1β蛋白

收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，使用ELISA試劑盒，按照說明書檢測IL-18、IL-1β含量。

1.6 MDA和SOD水平的測定

收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，使用MDA和SOD檢測試劑盒，按照說明書檢測MDA和SOD含量。

1.7 Western blotting法檢測焦亡相關(guān)分子蛋白

提取總蛋白，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，采用BCA法進(jìn)行蛋白含量測定，提取的蛋白變性上樣后進(jìn)行電泳，電泳后電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下作用2 h，4 ℃孵育一抗過夜，洗膜30 min后室溫孵育二抗1 h，再次洗膜30 min，ECL化學(xué)發(fā)光法得到條帶，并計算蛋白相對表達(dá)水平。

1.8 qPCR檢測焦亡相關(guān)分子mRNA

用RNA快速提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，Nano Drop2000分光光度計測定RNA水平，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq II 試劑盒進(jìn)行定量PCR檢測。通過2-ΔΔct對結(jié)果進(jìn)行分析，使用GAPDH作為內(nèi)參基因，各基因引物序列及擴(kuò)增片段長度見表1，計算目的基因的相對表達(dá)量。

表1 引物序列和擴(kuò)增片段長度

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 扁塑藤素對細(xì)胞活力的影響

隨著LPS質(zhì)量濃度增加，HUVEC細(xì)胞活力逐漸下降， 20 mg/L LPS處理24 h時細(xì)胞死亡數(shù)較多，因此選擇了細(xì)胞活力50%時的10 mg/L LPS。使用低、中、高劑量扁塑藤素對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后，扁塑藤素可以改善 LPS對HUVEC的損傷，并呈劑量依賴性，0.4 μmol/L時效果最佳(P<0.05；圖1)。

圖1 扁塑藤素對LPS誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞活力的影響(n=3)

2.2 扁塑藤素對LDH含量的影響

與對照組比較，LPS組LDH含量顯著升高(P<0.05)；扁塑藤素組LDH含量均顯著降低，高劑量扁塑藤素組降低最顯著(P<0.05；圖2)。

圖2 扁塑藤素對LPS誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞上清液中LDH含量的影響(n=3)

2.3 扁塑藤素對MDA、SOD含量的影響

與對照組比較，LPS組MDA顯著增加，SOD顯著降低(P<0.05)。與LPS組比較，中、高劑量扁塑藤素組MDA降低，SOD升高 (P<0.05；圖3)，提示扁塑藤素以劑量依賴的方式逆轉(zhuǎn)LPS作用。

圖3 扁塑藤素對LPS誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞上清液中MDA、SOD含量的影響(n=3)

2.4 扁塑藤素對細(xì)胞焦亡的影響

與對照組比較，LPS顯著提高HUVEC細(xì)胞上清液中IL-18和IL-1β蛋白水平，且該效應(yīng)能被扁塑藤素組以劑量依賴的方式逆轉(zhuǎn)(P<0.05;圖4A和B)。與對照組比較，LPS顯著提高 HUVEC 中焦亡相關(guān)分子NLRP3、GSDMD和Caspase-1的蛋白和mRNA表達(dá)水平，且該效應(yīng)能被扁塑藤素組以劑量依賴的方式逆轉(zhuǎn)(P<0.05;圖4C、D和E)。

圖4 扁塑藤素對LPS誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞焦亡的影響(n=3)

3 討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞在組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、維持體液平衡、炎癥細(xì)胞浸潤等方面起著重要作用，動脈粥樣硬化的形成與血管炎癥密切相關(guān)，而內(nèi)皮功能障礙是動脈粥樣硬化形成的第一階段。LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要原因是其對內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用[6]。本研究探索了扁塑藤素在炎癥誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞毒性中的作用，發(fā)現(xiàn)LPS處理抑制了HUVEC的增殖，同時增加了LDH的釋放，這表明LPS可誘導(dǎo)細(xì)胞功能損傷，而扁塑藤素預(yù)處理可呈劑量依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞功能損傷。

氧化應(yīng)激是由氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的不平衡引起的。LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的主要始發(fā)者。LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙與ROS的產(chǎn)生有關(guān)[7]。MDA是活性氧(reactive oxygen species，ROS)攻擊細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸形成的，是氧化應(yīng)激的一個常用的生物標(biāo)志物。SOD作為細(xì)胞抗氧化酶，是抵抗ROS毒性作用的第一道防線，在抗氧化防御系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用。研究表明，扁塑藤素通過核因子E2相關(guān)因子和MAPK/核因子-κB通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和抗炎作用[8]。為了了解扁塑藤素在LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中的影響，本研究測定了MDA及SOD含量，結(jié)果顯示， LPS處理后HUVEC中MDA增加，SOD降低；然而，中、高劑量的扁塑藤素均可抑制上述反應(yīng)。以上提示，抑制LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是扁塑藤素對內(nèi)皮功能障礙起保護(hù)作用的機(jī)制。

Cheng等[9]研究表明，脂多糖引起的細(xì)胞內(nèi)損傷會引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞焦亡和血管完整性的喪失。同時文獻(xiàn)[10-11]報道，內(nèi)皮細(xì)胞死亡是動脈粥樣硬化形成過程中的一個關(guān)鍵的初始階段，而焦亡是動脈粥樣硬化相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞死亡的主要類型。焦亡是一種新發(fā)現(xiàn)的促炎性、程序性細(xì)胞死亡類型，與包括動脈粥樣硬化在內(nèi)的幾種心血管疾病有關(guān)[12-13]。焦亡的特征是Gasdermin家族介導(dǎo)膜孔的形成、細(xì)胞腫脹和質(zhì)膜破裂，以及促炎性細(xì)胞內(nèi)容物的釋放，包括白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-18和高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein 1，HMGB1)[14]。GSDMD被激活的Caspase-1裂解，通過形成膜孔引發(fā)細(xì)胞焦亡[15]。研究表明，扁塑藤素通過直接阻斷NEK7-NLRP3的相互作用來干擾NLRP3炎癥體以及Caspase-1的激活和IL-1β的釋放[16]，這可能有助于解釋其抑制細(xì)胞焦亡作用。本研究假設(shè)扁塑藤素可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的焦亡在炎癥中發(fā)揮作用，并進(jìn)行了這項研究來證明這一點。

本研究表明，LPS介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞焦亡，引起焦亡相關(guān)指標(biāo)NLRP3、GSDMD、Caspase-1的蛋白及mRNA表達(dá)量升高，增加了細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-18的蛋白含量，提示發(fā)生了細(xì)胞焦亡，而扁塑藤素能以劑量依賴的方式逆轉(zhuǎn)上述反應(yīng)，緩解了LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞焦亡，并調(diào)節(jié)焦亡相關(guān)蛋白，以抑制LPS引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

綜上所述，扁塑藤素對LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷呈劑量依賴性保護(hù)，可能是通過抑制細(xì)胞焦亡和減輕氧化應(yīng)激從而改善內(nèi)皮細(xì)胞功能實現(xiàn)的。