劉澤晶， 徐 豐， 劉 勇， 呂 英， 錢曉蕊， 楊富佼， 趙琳琳， 劉 曦

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江省哈爾濱市150006；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第四醫(yī)院，黑龍江省哈爾濱市150001；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江省哈爾濱市150040)

腦缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，I/RI)是指缺血腦組織在恢復(fù)血流灌注后損傷反而加重的現(xiàn)象，多發(fā)于缺血性腦卒中、腦外傷、心肺復(fù)蘇等腦缺血后的再灌注過程中。既往研究認(rèn)為，I/RI過程中產(chǎn)生的大量氧自由基是導(dǎo)致腦皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的重要機(jī)制之一[1]，抗氧化劑治療可以清除腦組織過多的氧自由基，減輕腦組織氧化應(yīng)激損傷。奧拉西坦(oxiracetam，Oxi)是一種新型y-氨基丁酸環(huán)化衍生物，不僅能有效促進(jìn)腦氧代謝過程，還能激活、保護(hù)及修復(fù)神經(jīng)元細(xì)胞，發(fā)揮腦保護(hù)作用[2]。已有研究顯示，Oxi中的有效成分(S)-Oxi可以調(diào)節(jié)腦缺血大鼠腦皮質(zhì)區(qū)的能量代謝，發(fā)揮抗氧化作用，減輕腦組織損傷[3]。重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS)是一種通過在大腦中產(chǎn)生感應(yīng)聚焦電流，實(shí)現(xiàn)瞬間調(diào)制大腦皮層的無(wú)創(chuàng)刺激方式，在腦部疾病的診治中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[4]。既往研究顯示，接受rTMS刺激治療腦梗死患者的神經(jīng)功能缺損情況明顯優(yōu)于接受常規(guī)手段治療的患者[5]。但Oxi與rTMS聯(lián)合是否能發(fā)揮協(xié)同增效作用，且這一作用是否與氧化應(yīng)激過程相關(guān)尚不明確。因此，本研究探索了Oxi聯(lián)合rTMS對(duì)腦I/RI大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)神經(jīng)元的保護(hù)作用，并進(jìn)一步分析其對(duì)氧化應(yīng)激過程的調(diào)節(jié)作用，旨在為臨床治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物、試劑和儀器

SPF級(jí)SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量220～250 g，6～8周齡，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(黑)2019-001。實(shí)驗(yàn)開始前大鼠于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，溫度(25±2)℃，相對(duì)濕度(40±5)%，光照周期10～12 h，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中大鼠自由飲水和進(jìn)食。

Oxi(福安藥業(yè)集團(tuán)重慶博圣制藥公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20143232)；氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)(德國(guó)Biofroxx公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；B細(xì)胞淋巴瘤2(B cell lymphoma 2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、活化的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)、核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2 associated factor 2，Nrf2)、血紅素加氧酶(hemeoxygenase-1，HO-1)、醌氧化還原酶1(quinone oxidoreductase 1，NQO-1)單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)；辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG(艾美捷科技有限公司)。Rapid2型經(jīng)顱磁刺激儀(英國(guó)Magstim公司)。

1.2 腦缺血再灌注損傷模型的建立和分組

60只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，隨機(jī)均分為對(duì)照組、I/RI組、Oxi組、rTMS組和Oxi+rTMS組。除對(duì)照組外所有大鼠均采用Longa法[6]制備大鼠腦I/RI模型，腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液(2 μL/g)，于左側(cè)頸總動(dòng)脈離分叉處約5 mm處剪一小口，于近心端采用栓線結(jié)扎腦中動(dòng)脈，并縫合，缺血2 h后拔出栓線實(shí)現(xiàn)再灌注。對(duì)照組大鼠僅暴露腦中動(dòng)脈，插入栓線，不進(jìn)行結(jié)扎，其余步驟同手術(shù)組。若再灌注后24 h內(nèi)，造模大鼠出現(xiàn)神經(jīng)缺損癥狀，如左前爪伸展不完全，行走時(shí)身體有向左側(cè)轉(zhuǎn)圈或傾倒的傾向等，則為造模成功[7]。造模成功后，Oxi組以200 μg/g Oxi腹腔注射，1次/天；rTMS組以rTMS刺激，在大鼠清醒的狀態(tài)下固定頭部，將圓形線圈中線對(duì)準(zhǔn)人字縫，使線圈中心處于前囟與人字縫中間，磁刺激頻率10 Hz，100次/串，5串/天，每串間隔時(shí)間30 s，刺激強(qiáng)度0.5 T；Oxi+rTMS組以O(shè)xi干預(yù)聯(lián)合rTMS；對(duì)照組、I/RI組以等量生理鹽水腹腔注射，以上5組均連續(xù)干預(yù)14天。

1.3 大鼠神經(jīng)功能和腦梗死體積的檢測(cè)

末次干預(yù)后，采用Zea Longa 5分制標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行神經(jīng)體征缺失評(píng)分(neurological defectscore, NDS)。檢測(cè)后，斷頸處死各組大鼠，取大鼠左側(cè)腦皮質(zhì)組織，-20 ℃冰箱中冷凍20 min后，腦組織冠狀切片后置于2%氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)溶液，37 ℃ 15 min。隨后取出切片，生理鹽水沖洗2次后置于4%多聚甲醛中進(jìn)行組織固定，24 h后采用圖像處理軟件Image J測(cè)量各組腦梗死灶面積，并計(jì)算腦梗死體積百分比(infarct volume rate，IVR)。

1.4 腦組織損傷和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)

取大鼠左側(cè)腦皮質(zhì)組織，4%多聚甲醛固定， 4 μm組織切片，行常規(guī)HE染色或者TUNEL染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)，采用Image J對(duì)TUNEL染色圖像進(jìn)行分析處理，每張圖片隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察每個(gè)視野凋亡細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞核呈棕褐色或棕黃色顆粒的細(xì)胞)和總細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞凋亡率(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.5 腦組織中氧化應(yīng)激相關(guān)因子的檢測(cè)

取大鼠左側(cè)腦皮質(zhì)組織，制備組織勻漿，嚴(yán)格按照試劑盒說明書，黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)腦組織中SOD水平，化學(xué)比色法檢測(cè)腦組織GSH-Px水平，硫代巴比妥檢測(cè)腦組織MDA水平。

1.6 Western blotting檢測(cè)腦組織Nrf2、HO-1、NQO-1和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

取大鼠左側(cè)腦皮質(zhì)組織，勻漿，提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白水平，依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，滴加5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h，滴加一抗Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶1 000)、NQO-1(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Caspase-3(1∶1 000)和Cleaved Caspase-3(1∶1 000)，4 ℃搖床中孵育24 h后洗膜，滴加二抗(1∶5 000)，滴加ECL顯影劑顯影，采用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 Oxi聯(lián)合rTMS改善I/RI大鼠神經(jīng)功能缺損和腦組織損傷

Oxi組、rTMS組和Oxi+rTMS組大鼠NDS評(píng)分和IVR明顯低于I/RI組，Oxi+rTMS組IVR進(jìn)一步低于Oxi組和rTMS組(P<0.05；表1)。HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組腦組織未見明顯病理變化；I/RI組左側(cè)腦皮質(zhì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較疏松，間隙變寬，細(xì)胞核固縮深染，出現(xiàn)變性和壞死細(xì)胞；Oxi組、rTMS組和Oxi+rTMS組左側(cè)腦皮質(zhì)神經(jīng)元水腫程度減輕，變性和壞死細(xì)胞數(shù)量減少(圖1)。

表1 Oxi聯(lián)合rTMS改善I/RI大鼠神經(jīng)功能和腦組織損傷

圖1 Oxi聯(lián)合rTMS減輕I/RI大鼠腦組織損傷(HE， 400×)

2.2 Oxi聯(lián)合rTMS抑制腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡

I/RI組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率、Bax/Bcl-2和Cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；而Oxi組、rTMS組和Oxi+rTMS組上述指標(biāo)明顯低于I/RI組(P<0.05)；與Oxi組和rTMS組比較，Oxi+rTMS組上述改變更為顯著(P<0.05；圖2)。

圖2 Oxi聯(lián)合rTMS抑制I/RI大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡

2.3 Oxi聯(lián)合rTMS降低I/RI大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平

I/RI組大鼠腦組織SOD和GSH-Px明顯低于對(duì)照組，MDA明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。Oxi組、rTMS組和Oxi+rTMS組腦組織SOD和GSH-Px明顯高于I/RI組，MDA明顯低于I/RI組(P<0.05)；與Oxi組和rTMS組比較，Oxi+rTMS組上述改變更為顯著(P<0.05；表2)。

表2 Oxi聯(lián)合rTMS降低I/RI大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平

2.4 Oxi聯(lián)合rTMS促進(jìn)I/RI大鼠腦組織Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)

I/RI組大鼠腦組織Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。Oxi組、rTMS組和Oxi+rTMS組腦組織Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白表達(dá)明顯高于I/RI組(P<0.05)；與Oxi組和rTMS組比較，Oxi+rTMS組上述改變更為顯著(P<0.05；圖3)。

圖3 Oxi聯(lián)合rTMS促進(jìn)I/RI大鼠腦組織Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)(Western blotting)

3 討 論

腦缺血再灌注(I/R)過程中誘導(dǎo)產(chǎn)生了大量氧自由基，引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，破壞線粒體結(jié)構(gòu)，影響腦組織能量代謝障礙，還可以激活凋亡相關(guān)的信號(hào)通路，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，加重腦組織損傷[9]。Oxi是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)藥物，可以提高癡呆大鼠腦組織抗氧化酶活性，減輕腦組織氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮腦保護(hù)作用，目前已應(yīng)用于臨床腦血管疾病的治療[10]。rTMS利用電磁感應(yīng)的原理，可以重復(fù)使用脈沖磁場(chǎng)刺激大腦皮質(zhì)神經(jīng)元，影響神經(jīng)元活動(dòng)，調(diào)節(jié)腦組織能量代謝，改善神經(jīng)功能[11]。本研究觀察了Oxi聯(lián)合rTMS干預(yù)對(duì)腦I/RI大鼠腦組織損傷的影響，發(fā)現(xiàn)Oxi和rTMS可以顯著改善I/RI大鼠的神經(jīng)功能，減輕腦皮質(zhì)組織損傷，縮小其腦梗死面積，且Oxi聯(lián)合rTMS干預(yù)可以明顯提高臨床作用效果，提示臨床可聯(lián)合應(yīng)用Oxi聯(lián)合rTMS減輕腦缺血患者I/RI損傷，改善神經(jīng)功能。

本研究中，Oxi和rTMS均可以抑制腦I/RI大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，抑制Bax/Bcl-2和Cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白表達(dá)，且Oxi聯(lián)合rTMS干預(yù)可以明顯提高臨床作用效果。細(xì)胞凋亡信號(hào)通路主要包括由線粒體介導(dǎo)的內(nèi)部細(xì)胞凋亡信號(hào)通路和死亡受體介導(dǎo)的外部細(xì)胞凋亡信號(hào)通路[12]。Bax/Bcl-2是一組調(diào)控線粒體凋亡途徑的蛋白，已有研究發(fā)現(xiàn)，I/RI過程中大量氧自由基可以誘導(dǎo)Bax轉(zhuǎn)位至膜上與Bcl-2結(jié)合，破壞線粒體膜的完整性，導(dǎo)致線粒體細(xì)胞色素C釋放進(jìn)入胞漿，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，活化凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3，誘導(dǎo)腦組織細(xì)胞凋亡[13]。Hong等[14]研究顯示，rTMS刺激可以抑制腦I/RI大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，縮小腦梗死體積，改善神經(jīng)功能，提示Oxi聯(lián)合rTMS可能通過抑制腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，減輕腦組織損傷，改善神經(jīng)功能。

本研究中，Oxi和rTMS均可以促進(jìn)腦I/RI大鼠腦組織Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白表達(dá)，且Oxi聯(lián)合rTMS干預(yù)可以明顯提高臨床作用效果。Nrf2是機(jī)體內(nèi)最重要的抗氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)控多個(gè)抗氧化基因HO-1、NQO-1等表達(dá)，清除機(jī)體過多的氧自由基[15]。既往研究顯示，當(dāng)細(xì)胞受到氧自由基刺激時(shí)，Nrf2可與其特異性受體Keap1發(fā)生解偶聯(lián)，轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，啟動(dòng)抗氧化反應(yīng)元件所調(diào)控的HO-1、NQO-1等基因表達(dá)[16]。趙宗剛等[17]研究顯示，Oxi可以促進(jìn)腦梗死大鼠腦組織Nrf2表達(dá)，提高腦組織抗氧化能力，減輕腦組織氧化應(yīng)激損傷，改善神經(jīng)功能，提示Oxi聯(lián)合rTMS可以協(xié)同調(diào)節(jié)腦I/RI大鼠的氧化應(yīng)激水平，減輕腦組織損傷。本研究中，Oxi和rTMS均可以升高腦I/RI大鼠腦組織SOD和GSH-Px活性，降低MDA水平，且Oxi聯(lián)合rTMS干預(yù)可以明顯提高臨床作用效果。SOD和GSH-Px均為細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化酶，MDA可以反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)氧自由濃度，提示Oxi聯(lián)合rTMS可以提高腦I/RI大鼠的抗氧化能力。關(guān)園等[18]研究顯示，Oxi可以提高心肌I/RI大鼠的心肌組織抗氧化能力，清除過多氧自由基，抑制心肌組織細(xì)胞凋亡，減輕心肌組織損傷。王金華等[19]研究顯示，rTMS可以提高血管性癡呆大鼠的腦組織抗氧化酶活性，抑制腦組織細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，提示Oxi聯(lián)合rTMS可能通過調(diào)節(jié)Nrf2表達(dá)，降低I/RI過程中的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕腦I/RI大鼠的氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，Oxi聯(lián)合rTMS可以促進(jìn)腦I/RI大鼠腦組織Nrf2蛋白表達(dá)，提高抗氧化酶活性，抑制缺血側(cè)腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，減輕腦組織氧化應(yīng)激損傷，改善神經(jīng)功能，臨床可采用Oxi聯(lián)合rTMS治療減輕腦I/RI損傷。本研究不足之處在于僅在動(dòng)物水平上探索了Oxi聯(lián)合rTMS對(duì)大鼠腦I/RI氧化應(yīng)激損傷的影響，尚需大量的臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證。