陳偉鴻， 熊 潔， 查 駿

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院急診綜合科，廣州口腔疾病研究所，口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，廣東 廣州 510140）

口腔鱗狀細胞癌（OSCC）常常會引起咀嚼、語言 障礙和吞咽困難，每年確診的患者超過50 萬[1]，是世界上第六大常見的癌癥， 約占所有惡性腫瘤的5%[2]。 OSCC 是頭頸部惡性腫瘤發(fā)病率最高的腫瘤，患者通常容易發(fā)生細胞浸潤和轉(zhuǎn)移。 此外，雖然目前治療OSCC 的方法很多，包括手術(shù)切除、放療和化療，但經(jīng)這些方法治療后，患者預(yù)后均較差，且容易產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用， 如面部畸形或部分功能缺失等。 因此，探索OSCC 的分子機制、尋找新的治療靶點和診斷標(biāo)志是目前函待解決的問題。

CYP3A5 是細胞色素P450 酶系（cytochrome P450 enzyme system，CYPs）3A 亞家族的主要成員，主要分布于一些肝外組織如腸壁、腎、前列腺和肺等中，其傳統(tǒng)的生物學(xué)功能為參與內(nèi)外源性物質(zhì)代謝。 目前的研究表明， 細胞色素P450 參與腫瘤治療，并與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[3-5]。CYP3A5 是參與內(nèi)源性分子如藥物、外源性致癌物質(zhì)和類固醇代謝過程細胞色素P450 超家族酶的成員[6]。 早期的報道顯示，CYP3A5 的異常表達與肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的進展有關(guān)，可作為治療丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）相關(guān)HCC 及標(biāo)志物的靶點[7]。 但是，CYP3A5 與OSCC 之間的關(guān)系尚未見報道。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑

CYP3A5 siRNA NC （對照組）、CYP3A5 siRNA（銳博公司，中國）；DMEM-F12 培養(yǎng)液、DMEM 培養(yǎng)液、胰蛋白酶、胎牛血清（Gibco 公司，美國）；TRIzol試劑（Invitrogen 公司，美國）；SYBR Premix ExTaq 試劑盒（TaKaRa 公司，日本）；Matrigel 膠（BD 公司，美國）；GenMuteTM轉(zhuǎn)染試劑 （SignaGen 公司， 美國）；CCK8 試劑盒（同仁公司，日本）；BCA 蛋白測定試劑盒（Beyotime 公司，中國）；一抗、抗β-actin、IgG（Abcam 公司，英國）。

1.2 細胞株來源、臨床標(biāo)本及細胞培養(yǎng)

SCC-9、SCC-25、CAL-27 細胞為人舌鱗癌細胞株， 購買于美國模式菌種收集中心（American type culture collection，ATCC）。 HOK 細胞為正常人口腔角質(zhì)細胞株，購買于Sciencell 研究實驗室。OSCC 及癌旁組織來源于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，該研究已取得患者同意并簽署書面知情同意書，同時通過廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會同意（批準(zhǔn)號：KY2017015）。 經(jīng)病理檢查確診為OSCC，術(shù)前均未接受過化療、放療及免疫治療。

HOK 細胞用DMEM-F12 培養(yǎng)液 （含10%胎牛血清） 培養(yǎng)，SCC-9、SCC-25、CAL-27 細胞用DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

根據(jù)GenMuteTM轉(zhuǎn)染試劑操作指南進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 天， 將細胞接種于2 mL 無抗生素完全培養(yǎng)液的6 孔板中，每孔為1×105個，當(dāng)細胞生長至密度為50%~60%時更換為完全培養(yǎng)液 （含抗生素和10%胎牛血清），將CYP3A5 siRNA 和CYP3A5 siRNA NC 轉(zhuǎn)染于不同孔中， 用無血清及抗生素的DMEM培養(yǎng)液稀釋CYP3A5 siRNA 和CYP3A5 siRNA NC至10 nmol/L，各取80 μL ddH2O、20 μL 5×transfection buffer、4 μL GenMuteTM至5 μL 上述無血清及抗生素的DMEM 培養(yǎng)液稀釋液中，混勻、室溫下孵育20 min 后加入不同孔板中， 再加入1 mL 完全培養(yǎng)液，48 h 后提RNA 檢測轉(zhuǎn)染后基因表達水平的改變情況，并完成增殖、遷移、侵襲等實驗。

1.4 細胞增殖

收集轉(zhuǎn)染CYP3A5 siRNA 及CYP3A5 siRNA NC 的細胞接種于96 孔板中， 以每孔5 000 個細胞的密度常規(guī)培養(yǎng)于培養(yǎng)箱中，分別于0、24、48、72 h 時于每孔中加入10 μL CCK8 試劑， 于培養(yǎng)箱中放置4 h，用酶標(biāo)儀測定其在450 nm 處的吸光度值。

1.5 細胞侵襲遷移

用無血清培養(yǎng)液對8 g/L 的Matrigel 膠進行水化，取50 μL 包被于Transwell 小室底部，37 ℃下靜置2 h， 取對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染CYP3A5 siRNA 及CYP3A5 siRNA NC 后的細胞，制成1×106個/mL 的無血清細胞懸液， 向每個鋪膠的Transwell 小室中加入200 μL 細胞懸液，并在24 孔板每孔對應(yīng)加入600 μL的完全培養(yǎng)液，然后將小室放入孔中，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后取出，用4%多聚甲醛固定及結(jié)晶紫染色，高倍顯微鏡下隨機3 個視野觀察細胞，計數(shù)并統(tǒng)計。

1.6 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）

取各組對數(shù)生長期細胞，使用TRIzol 試劑提取總RNA，采用NanoDrop 2000 進行定量，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA， 使用Prime-ScriptTMRT 試劑盒進行RT-qPCR，反應(yīng)條件如下：95 ℃30 s，95 ℃5 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，40 個循環(huán)。通過2-ΔΔCt法進行結(jié)果計算，所有試驗重復(fù)3 次。引物及內(nèi)參引物均由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計合成，見表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 The primer sequences of the genes used for RT-qPCR

1.7 Western blotting 檢測蛋白表達水平

取轉(zhuǎn)染后48 h 的細胞，加入RIPA 裂解液后提取總蛋白， 根據(jù)BCA 蛋白定量試劑盒說明書進行蛋白定量，將制備好的蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 （sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE），采用Western blotting 檢測CYP3A5 蛋白表達情況。

1.8 免疫組織化學(xué)

使用一抗在4 °C 下對脫蠟的OSCC 組織切片進行免疫組織化學(xué)（IHC）染色，陰性對照則將一抗替換為正常IgG，在4 °C 下過夜，隨后用二抗處理載玻片并用蘇木精復(fù)染，隨機拍攝免疫組織化學(xué)染色后的5 組圖片， 通過Image J 軟件分析陽性面積并進行統(tǒng)計，取平均值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2 組間比較采用獨立樣本t 檢驗、配對t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分法，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CYP3A5 在OSCC 組織和細胞中的表達水平

RT-qPCR 結(jié)果顯示，在10 例OSCC 組織（0.16±0.16）中，CYP3A5 的基因表達水平顯著低于其在癌旁組織（1.04±0.16）中（圖1A，P<0.001）；同時，對比HOK細胞系，SCC-9、SCC-25、CAL-27 細胞中，CYP3A5 基因同樣呈現(xiàn)低表達水平 （圖1B，P<0.01）。 CYP3A5蛋白在OSCC 組織及細胞系中均為低表達水平（圖1C、D，P<0.05）。

圖1 OSCC 組織及細胞系中CYP3A5 的基因及蛋白表達水平Figure 1 Genetic and protein expression levels of CYP3A5 in OSCC tissues and cell lines

2.2 CYP3A5 siRNA 的轉(zhuǎn)染效率檢測及細胞系篩選

RT-qPCR 結(jié)果顯示， 轉(zhuǎn)染CYP3A5 siRNA-1 及siRNA-2 后，SCC-9 （siRNA-1: 0.61±0.07；siRNA-2:0.69±0.12）、SCC-25 （siRNA-1: 0.53±0.08；siRNA-2:0.80±0.07）、 CAL-27 （siRNA-1: 0.53±0.19；siRNA-2:0.74±0.23）細胞中CYP3A5 基因的相對表達量均顯著低于對照組（圖2，P<0.05），且CYP3A5 siRNA-1轉(zhuǎn)染效率高于CYP3A5 siRNA-2，證明CYP3A5 基因在OSCC 細胞系中被成功敲降， 因而選用CYP3A5 siRNA-1 于后續(xù)實驗，后續(xù)實驗均用CYP3A5 siRNA敲降成功的細胞系。

圖2 CYP3A5 siRNA 的轉(zhuǎn)染效率及細胞株篩選Figure 2 Transfection efficiency of CYP3A5 siRNA and cell line screening

2.3 抑制CYP3A5 基因表達對OSCC 細胞增殖的影響

CCK8 結(jié)果顯示， 轉(zhuǎn)染CYP3A5 siRNA 48、72 h后，SCC-9 （48 h: 0.73±0.05；72 h: 0.97±0.06）、SCC-25（48 h: 0.73±0.05；72 h: 1.09±0.13）、CAL-27（48 h:0.79±0.06；72 h: 1.05±0.16）細胞增殖得到明顯促進（圖3，P<0.05）。 因 此， 在OSCC 細 胞 系 中 抑 制CYP3A5 的表達能夠明顯促進細胞增殖。

圖3 抑制CYP3A5 基因表達對OSCC 細胞系增殖的影響Figure 3 Effect of inhibiting of the expression of CYP3A5 gene on the proliferation of OSCC cell lines

2.4 抑制CYP3A5 基因表達對OSCC 細胞侵襲及遷移的影響

Transwell 細胞侵襲結(jié)果顯示， 與對照組相比，轉(zhuǎn)染CYP3A5 siRNA 的SCC-9 （1 051.33±99.14）、SCC-25（1 051.67±145.75）、CAL-27（973.33±181.36）細胞穿過人工基底膜的細胞數(shù)明顯增多，細胞侵襲能力明顯增強（圖4，P＜0.05）。 同樣，Transwell 細胞遷移結(jié)果顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染CYP3A5 siRNA的SCC-9（10 522±91.43）、SCC-25（1 070.33±116.63）、CAL-27（1 007±103.12）細胞穿過人工基底膜的細胞數(shù)顯著增多，細胞遷移能力明顯增強（圖5，P＜0.05）。 因此，在OSCC 細胞系中抑制CYP3A5 基因的表達能夠明顯促進細胞侵襲及遷移能力。

圖4 抑制CYP3A5 基因的表達促進OSCC 細胞侵襲(×40)Figure 4 Inhibition of the expression of CYP3A5 gene promoted the invasion of OSCC cell lines（×40）

圖5 抑制CYP3A5 的表達促進OSCC 細胞遷移(×40)Figure 5 Inhibiting of the expression of CYP3A5 gene promoted the migration of OSCC cell lines（×40）

2.5 CYP3A5 在OSCC 組織中的表達水平

應(yīng)用免疫組織化學(xué)法分析OSCC 組織中CYP3A5 的表達水平，結(jié)果顯示CYP3A5 在OSCC 癌組織（0.007±0.002）中呈顯著低水平（圖6，P＜0.01）。

圖6 免疫組織化學(xué)法分析CYP3A5 在OSCC 組織中的表達水平(×40)Figure 6 IHC analysis of CYP3A5 staining expression level in OSCC tissues（×40）

3 討論

經(jīng)過不斷的實踐研究，人們逐漸提高了對癌癥相關(guān)基因的認(rèn)知，但是某些癌癥的確切分子機制及致病機理仍然不清楚，如OSCC 的發(fā)生是多因素、多步驟、逐漸發(fā)展的結(jié)果[8]。 OSCC 是世界上最常見的惡性腫瘤之一。與其他惡性腫瘤類似，OSCC 的形成是多種因素導(dǎo)致基因突變的結(jié)果。 淋巴結(jié)局部轉(zhuǎn)移是OSCC 主要的、對治療預(yù)后影響最大的生物學(xué)行為[9]。 雖然近年來口腔癌患者的治療效果有所改善，但近5 年的生存率沒有得到明顯改善，約為50%[10]。因此，深入了解OSCC 的發(fā)病機制和鑒定新的基因治療方案是近年來的重點。

CYP3A5 是細胞色素P450 CYP3A 亞家族的主要成員之一， 它在以前的研究中側(cè)重于藥物代謝、CYP3A5 多態(tài)性與癌癥風(fēng)險之間的關(guān)系[11-15]。近年來， 許多研究表明，CYP3A5 在多種腫瘤中異常表達，而其異常表達與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在早期的研究中， 發(fā)現(xiàn)CYP3A5 在骨肉瘤患者中高表達，并與轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)，這可能會使其成為骨肉瘤的生物標(biāo)志物[16]。 此外，CYP3A5 的表達水平在肝細胞癌中顯著降低，并通過TORC2/Akt 信號通路抑制肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[42]。 與上述研究結(jié)果一致，本研究的結(jié)果表明，人OSCC 中CYP3A5 的表達降低。

綜上所述， 在本研究中，CYP3A5 基因在OSCC癌組織和細胞系中均呈現(xiàn)低表達， 并促進OSCC 細胞系的增殖、侵襲及遷移。 本研究表明，通過抑制CYP3A5 基因表達能促進OSCC 細胞的細胞增殖、侵襲和遷移，CYP3A5 可能成為未來OSCC 潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點， 為OSCC 的治療和預(yù)后提供了新靶點，但其在臨床中作為靶向治療分子和生物學(xué)標(biāo)志物的作用，還有待進一步的研究。