劉曉輝 秦璇 杜靜 郝明 高志達(dá) 潘鑠 胡亞寧 田智廣

0 引言

目前骨質(zhì)疏松癥治療中最常應(yīng)用的抗骨吸收藥物為伊班膦酸鈉等雙膦酸鹽類(lèi)藥物，但由于其依從性、耐受性較差,加之不良反應(yīng)的影響,會(huì)限制其從抗骨吸收治療中的獲益[1]。伊班膦酸鈉聯(lián)合其他藥物治療骨質(zhì)疏松癥是一種重要的治療方法。學(xué)者們對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells ，BMSCs)聯(lián)合其他藥物等干預(yù)治療骨質(zhì)疏松癥進(jìn)行了大量的研究[2-8]。Piao等[9]分別以阿侖膦酸鈉、BMSCs干預(yù)治療骨質(zhì)疏松大鼠后對(duì)大鼠股骨的黏彈性力學(xué)特性進(jìn)行研究，得出BMSCs具有恢復(fù)骨質(zhì)疏松動(dòng)物的代謝功能、骨量以及應(yīng)力松弛、蠕變力學(xué)特性的結(jié)論。

越來(lái)越多的研究者希望通過(guò)干細(xì)胞聯(lián)合其他藥物達(dá)到提升骨骼的生物力學(xué)性能進(jìn)而實(shí)現(xiàn)治療骨質(zhì)疏松癥的目的。目前以伊班膦酸鈉聯(lián)合BMSCs干預(yù)治療動(dòng)物骨質(zhì)疏松的生物力學(xué)機(jī)制尚不明確，骨質(zhì)疏松癥的表現(xiàn)形式主要是骨量丟失、好發(fā)骨折。骨折多由于骨骼的彎曲、壓縮等力學(xué)性能降低所致。伊班膦酸鈉對(duì)治療骨質(zhì)疏松具有一定的效果。對(duì)于以BMSCs聯(lián)合伊班膦酸鈉干預(yù)治療骨質(zhì)疏松后的壓縮、彎曲強(qiáng)度等生物力學(xué)研究是臨床關(guān)注的熱點(diǎn)之一。目前以BMSCs、伊班膦酸鈉干預(yù)治療動(dòng)物骨質(zhì)疏松后，研究其壓縮、彎曲力學(xué)性能的報(bào)道較少。為此本文擬采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法，對(duì)以伊班膦酸鈉聯(lián)合BMSCs干預(yù)治療后的大鼠股骨進(jìn)行彎曲、壓縮力學(xué)性能實(shí)驗(yàn)，以骨的壓縮、彎曲力學(xué)性能指標(biāo)研判伊班膦酸鈉聯(lián)合BMSCs進(jìn)行干預(yù)治療骨質(zhì)疏松后大鼠骨的力學(xué)機(jī)制恢復(fù)效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)分組

雌性5月齡SD大鼠60只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組12只，骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型組12只，骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型以伊班膦酸鈉干預(yù)組12只，骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)組12只，骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型以伊班膦酸鈉聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)組12只。

1.2 骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型復(fù)制與藥物干預(yù)

將大鼠放在動(dòng)物手術(shù)床上，將2%的戊巴比妥鈉注射液2 mL/kg 注射到大鼠尾靜脈使大鼠麻醉，然后切開(kāi)大鼠腹部，切除雙側(cè)卵巢。建模7 d后，對(duì)以伊班膦酸鈉聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)組大鼠通過(guò)尾靜脈一次性注射大鼠BMSCs 3 × 106個(gè)(美國(guó)Sciencell公司)；按陳朝祥等[10]的方法通過(guò)尾靜脈注射伊班膦酸鈉10 μg/kg,南京恒生制藥有限公司)，之后每隔7 d注射1次,90 d后取材。

1.3 標(biāo)本采集與大鼠骨試樣幾何尺寸測(cè)量

于術(shù)后90 d分別對(duì)每只大鼠剪尾采血25 mL,將采集的各組血樣在空氣中靜置15 min后用濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司TD-6M型低速離心機(jī)2000 r/min離心20 min，取血清放置在-20 ℃冰箱內(nèi)。然后將大鼠麻醉以斷頭法處死,取雙側(cè)股骨待做壓縮、彎曲實(shí)驗(yàn)，取雙側(cè)脛骨待做骨密度測(cè)試。大鼠骨試樣存放24 h后，以上海永科光學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的15JE型測(cè)量顯微鏡測(cè)量各組骨標(biāo)本的長(zhǎng)度和直徑。股骨試樣長(zhǎng)31.6～32.2 mm，直徑2.71～2.73 mm。脛骨試樣長(zhǎng)31.1～32.0 mm，直徑2.24～2.31 mm。

1.4 評(píng)估指標(biāo)

1.4.1 生化指標(biāo)

生化指標(biāo)為血清骨特異性堿性磷酸酶( bone alkaline phosphotase，BALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase-5b ，TRACP-5b)。

分別取各組大鼠血清樣本，以深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司生產(chǎn)的MR-96A酶標(biāo)儀、上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒，采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法檢測(cè)血清中 BALP、TRACP-5b含量。

1.4.2 脛骨骨密度(bone mineral density，BMD)

以明維思Mindways QCT骨密度測(cè)量系統(tǒng)(美國(guó)得克薩斯州奧斯汀)測(cè)定大鼠脛骨骨密度。

1.4.3 股骨彎曲、壓縮性能

使用濟(jì)南中路昌試驗(yàn)機(jī)制造有限公司W(wǎng)DS-20電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行測(cè)試。按文獻(xiàn)[11-13]中的方法對(duì)試樣預(yù)調(diào)處理后進(jìn)行彎曲實(shí)驗(yàn)。分別將每組大鼠右側(cè)股骨試樣各12個(gè)置于試驗(yàn)機(jī)的彎曲實(shí)驗(yàn)支座上，支座跨距20 mm。試驗(yàn)機(jī)的彎曲實(shí)驗(yàn)壓頭接觸股骨標(biāo)本中間，以2 mm/min的速度對(duì)試樣施加彎曲載荷，測(cè)試樣本的彎曲最大應(yīng)力、彎曲最大應(yīng)變、彎曲彈性應(yīng)力、彎曲彈性模量。按文獻(xiàn)[13-15]中的方法對(duì)試樣預(yù)調(diào)處理后進(jìn)行壓縮實(shí)驗(yàn)。取正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠左股骨各12個(gè)試樣，將標(biāo)本置于試驗(yàn)機(jī)壓縮實(shí)驗(yàn)工作臺(tái)上，以2 mm/min的速度對(duì)試樣施加壓縮載荷，直至試樣破壞，測(cè)試樣本的壓縮最大應(yīng)力、壓縮最大應(yīng)變、壓縮彈性模量。

1.4.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料以Mean±SD表示，用SPSS16.0 軟件包(SPSS,Chicago,IL,USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。組間數(shù)據(jù)差異采用單因素方差分析法和Sceffe法，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果及分析

2.1 BMD、BALP、TRACP-5b

各組大鼠的BMD、 BALP、TRACP-5bK檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠的BMD、 BALP、TRACP-5bK(n=12)Table 1 BMD,BALP and TRACP-5b of rats in each group (n=12)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組BMD、BALP值小于正常對(duì)照組、伊班膦酸鈉干預(yù)組、BMSCs干預(yù)組、伊班膦酸鈉聯(lián)合BMSCs干預(yù)組。其TRACP -5b大于正常對(duì)照組、伊班膦酸鈉干預(yù)組、BMSCs干預(yù)組、伊班膦酸鈉聯(lián)合BMSCs干預(yù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。伊班膦酸鈉聯(lián)合BMSCs干預(yù)組BMD、BALP大于模型組、伊班膦酸鈉干預(yù)組、BMSCs干預(yù)組，其TRACP-5b值小于模型組、伊班膦酸鈉干預(yù)組、BMSCs干預(yù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明以伊班膦酸鈉聯(lián)合BMSCs干預(yù)后，具有提高骨質(zhì)疏松動(dòng)物BMD、BALP值，降低TRACP -5b的作用，說(shuō)明骨質(zhì)疏松動(dòng)物骨功能活性與骨吸收的恢復(fù)效果明顯。

2.2 壓縮性能

各組大鼠股骨壓縮實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠股骨壓縮實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=12)Table 2 Results of femoral compression test of rats in each group (n=12)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，股骨在壓縮載荷作用下，股骨破壞后破壞斷口多數(shù)為斜斷口，部分試樣破壞斷口為橫斷口。模型組最大應(yīng)力、最大應(yīng)變、彈性應(yīng)力、彈性應(yīng)變、彈性模量小于正常對(duì)照組、伊班膦酸鈉干預(yù)組、BMSCs干預(yù)組、伊班膦酸鈉聯(lián)合BMSCs干預(yù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。伊班膦酸鈉聯(lián)合BMSCs干預(yù)組最大應(yīng)力、最大應(yīng)變、彈性應(yīng)力、彈性應(yīng)變、彈性模量大于模型組、伊班膦酸鈉干預(yù)組、BMSCs干預(yù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 彎曲性能

各組大鼠股骨三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠股骨三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=12)Table 3 Results of three point bending test of femur of rats in each group (n=12)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，股骨在彎曲應(yīng)力作用下，股骨破壞后受拉側(cè)面多為橫斷口，受壓側(cè)面多為斜斷口，部分試樣破壞斷口為螺旋斷口。模型組最大應(yīng)力、最大應(yīng)變、彈性應(yīng)力、彈性應(yīng)變、彈性模量小于正常對(duì)照組、伊班膦酸鈉干預(yù)組、BMSCs干預(yù)組、伊班膦酸鈉聯(lián)合BMSCs干預(yù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。伊班膦酸鈉聯(lián)合BMSCs干預(yù)組最大應(yīng)力、最大應(yīng)變、彈性應(yīng)力、彈性應(yīng)變、彈性模量大于模型組、伊班膦酸鈉干預(yù)組、BMSCs干預(yù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明BMSCs干預(yù)后，具有提高骨質(zhì)疏松動(dòng)物股骨彎曲強(qiáng)度的作用。

3 討論

決定骨的抗壓縮、抗彎曲等強(qiáng)度的關(guān)鍵因素是骨密度與骨質(zhì)量[14]。各組大鼠脛骨骨密度測(cè)量結(jié)果顯示，骨質(zhì)疏松模型大鼠通過(guò)伊班膦酸鈉聯(lián)合BMSCs干預(yù)、BMSCs干預(yù)、伊班膦酸鈉干預(yù)后骨密度都有一定的恢復(fù)，以伊班膦酸鈉聯(lián)合BMSCs干預(yù)骨密度恢復(fù)的效果最好。

TRACP-5b是骨的功能活性與破骨細(xì)胞數(shù)量有效的標(biāo)志物[15]。骨在吸收的過(guò)程中，TRACP-5b被破骨細(xì)胞大量地釋放出來(lái)， 血清TRACP-5b含量間接體現(xiàn)破骨細(xì)胞活性與骨吸收狀態(tài)。TRACP-5b測(cè)試結(jié)果表明，骨質(zhì)疏松模型大鼠通過(guò)伊班膦酸鈉聯(lián)合BMSCs干預(yù)、BMSCs干預(yù)后大鼠血清TRACP-5b比之前降低，說(shuō)明伊班膦酸鈉聯(lián)合BMSCs對(duì)恢復(fù)骨的功能活性與骨吸收效果明顯。

BALP反映成骨細(xì)胞的功能，來(lái)源于成骨細(xì)胞， 是評(píng)價(jià)骨形成與骨轉(zhuǎn)換的常用代謝指標(biāo)[16]。BALP測(cè)試結(jié)果表明，伊班膦酸鈉聯(lián)合BMSCs有利于恢復(fù)成骨細(xì)胞的功能，有利于骨形成與骨轉(zhuǎn)換。

骨生物力學(xué)性能是判定骨組織質(zhì)量不可或缺的主要指標(biāo)，骨的“ 量” 和“ 質(zhì)”共同決著骨的強(qiáng)度，即抵抗骨折的能力[17]。骨彈性模量是反映骨韌性的力學(xué)參數(shù)，當(dāng)骨彈性模量降低，骨的脆性增高，韌性降低，發(fā)生骨折的概率相應(yīng)增大[18-19]。女性絕經(jīng)后，卵巢功能衰退引起內(nèi)源性雌激素分泌減少與骨細(xì)胞表面的雌激素受體數(shù)量下降，導(dǎo)致骨吸收-骨形成偶聯(lián)失衡， 出現(xiàn)破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)， 成骨細(xì)胞活性相對(duì)減弱，骨形成速度減慢，并出現(xiàn)骨小梁變薄與間隙增寬、骨體積減少、骨小梁連接破壞等病理現(xiàn)象[20]。分析認(rèn)為，由于骨質(zhì)疏松大鼠骨密度發(fā)生了改變，骨小梁的組織形態(tài)發(fā)生了改變，所以其彎曲、壓縮力學(xué)性能發(fā)生了改變。骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型通過(guò)伊班膦酸鈉聯(lián)合BMSCs干預(yù)治療后改善了骨的結(jié)構(gòu)，提高了骨的強(qiáng)度和韌性，說(shuō)明伊班膦酸鈉聯(lián)合BMSCs具有恢復(fù)骨質(zhì)疏松模型動(dòng)物骨密度和骨的壓縮、彎曲力學(xué)特性的作用。伊班膦酸鈉聯(lián)合BMSCs干預(yù)骨質(zhì)疏松模型動(dòng)物股骨骨密度，骨的壓縮、彎曲力學(xué)特性恢復(fù)得最好，與所預(yù)期的結(jié)果相符。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠骨的力學(xué)性能和大鼠骨密度BMD、血清TRACP-5b 、BALP具有一定的關(guān)系，骨密度BMD、血清TRACP-5b 、BALP恢復(fù)得越好，骨的壓縮、彎曲力學(xué)性能標(biāo)恢復(fù)得越好。

李云龍等[21]以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)治療骨質(zhì)疏松癥大鼠后對(duì)大鼠股骨進(jìn)行剪切、沖擊生物力學(xué)等實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)組血清Ca、ALP骨密度，骨剪切和沖擊力學(xué)性能指標(biāo)大于模型組及雷洛昔芬干預(yù)組(P<0. 05)。得出了骨質(zhì)疏松動(dòng)物通過(guò)以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)后，骨密度，血清 Ca、ALP，骨的強(qiáng)度和韌性可以得到一定恢復(fù)的結(jié)論。Uejima等[22]將同種異體的 BMSCs注射到去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型的股骨髓腔中，研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs移植后，顯著提高該區(qū)域的骨密度，增強(qiáng)了骨彎曲生物力學(xué)強(qiáng)度。他們僅以BMSCs或其他單一藥物干預(yù)治療骨質(zhì)疏松動(dòng)物，具有一定的局限性。Wang 等[23]將BMSCs與海藻酸鈣凝膠混合后注射到骨質(zhì)疏松大鼠股骨遠(yuǎn)端，56 d后組織學(xué)觀察表明，BMSCs聯(lián)合海藻酸鈣凝膠干預(yù)組的骨小梁數(shù)明顯增加，骨強(qiáng)度明顯提高。本文支持Wang 等[21]BMSCs聯(lián)合其他藥物干預(yù)骨質(zhì)疏松動(dòng)物骨強(qiáng)度明顯提高的結(jié)論。

4 結(jié)論

骨質(zhì)疏松動(dòng)物通過(guò)以伊班膦酸鈉聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)后，脛骨BMD、血清BALP升高，TRACP-5b水平下降，骨的壓縮、彎曲強(qiáng)度和韌性可以得到一定的恢復(fù)。