謝曉明，何美鳳

（上海理工大學(xué) 材料與化學(xué)學(xué)院，上海 200093）

純Ti 作為生物醫(yī)用金屬材料，具有優(yōu)異的生物相容性與良好的機(jī)械加工性能，已被廣泛應(yīng)用于牙科、骨科與整形植入物領(lǐng)域，且在心臟支架與外置型電子裝置，例如刺激骨生長的電子裝置方面有著較多的應(yīng)用。然而純Ti 的彈性模量高于人體骨骼的，易引起應(yīng)力屏蔽，導(dǎo)致骨密度降低、骨組織吸收及引起進(jìn)一步的并發(fā)癥。Ti 在自然界中極易氧化，表面生成的氧化層以TiO為主，其結(jié)構(gòu)松散，耐蝕性不夠理想，且與植入組織的細(xì)胞反應(yīng)活性低。有學(xué)者認(rèn)為，表面氧化層的存在，使得純Ti 與骨之間難以直接接觸，從而未能達(dá)到理想的骨整合效果。已有研究證明，鈦種植材料的表面參數(shù)，如表面粗糙度、形貌與元素等能夠影響鈦種植材料周圍組織的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞粘附與基因表達(dá)，從而影響骨愈合的進(jìn)程。為了提高相關(guān)性能，對(duì)鈦種植材料進(jìn)行表面改性是很有必要的，能有效提高鈦種植體的植入成功率。

針對(duì)純Ti 的應(yīng)力屏蔽問題，目前已有提高負(fù)重延緩骨吸收、改進(jìn)固定板對(duì)應(yīng)力進(jìn)行重分布、施加電流模擬壓電效應(yīng)以及從根本上降低材料的彈性模量等方法。由于純Ti 彈性模量較高，α 型鈦合金耐蝕性較差，人們通過在Ti 中添加Ni、Mo、Nb 等元素形成β 型鈦合金，其中以Ti–Nb 和Ti–Mo 兩種鈦合金體系為主。合金元素的添加能有效降低鈦及鈦合金的彈性模量，從而避免應(yīng)力屏蔽帶來的影響，但合金元素的添加也會(huì)導(dǎo)致合金元素釋出、引發(fā)人體炎癥。因此，如何在兼顧強(qiáng)度與彈性模量的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)出生物相容性、細(xì)胞毒性等生物安全性指標(biāo)達(dá)標(biāo)的鈦及鈦合金，已成為了如今種植體的一個(gè)重要的研究方向。相關(guān)研究表明，對(duì)Ti–Ni 合金進(jìn)行表面氧化、電解拋光、表面涂層、接枝活性分子等有助于提高其耐蝕性及生物相容性。相關(guān)領(lǐng)域研究者也越來越關(guān)注對(duì)純Ti 進(jìn)行表面改性，從而提高相關(guān)性能。

近年來，已有多家科研機(jī)構(gòu)對(duì)此進(jìn)行了探索。李俊等運(yùn)用噴丸降低了純Ti 表面的彈性模量。瑞士的Straumann 公司開發(fā)了噴砂酸蝕法（sand blasting and acid-etching method,SLA），運(yùn)用大顆粒噴丸與HCl/HSO雙酸酸蝕結(jié)合來對(duì)Ti 進(jìn)行表面改性，已成功運(yùn)用于臨床醫(yī)用且取得較好效果，此后該公司開發(fā)的SLActive（活性親水SLA）工藝進(jìn)一步提高了純Ti 植入體的生物相容性并縮短了整體治療周期。

二十世紀(jì)九十年代，盧柯等提出了表面機(jī)械研磨處理（surface mechanical attrition treatment，SMAT）。相較于傳統(tǒng)噴丸處理，SMAT 能處理形狀復(fù)雜的試件，且對(duì)材料表面損傷較小，并使材料的微觀組織發(fā)生顯著改變。對(duì)待處理材料表面進(jìn)行的無規(guī)律高速撞擊，使材料表面的晶粒細(xì)化至納米級(jí)，而材料內(nèi)部的晶粒保持原始大小，如此形成的梯度納米層提高了材料表面與基體的結(jié)合程度。張保華等發(fā)現(xiàn)純Ti 經(jīng)SMAT 處理后，整體轉(zhuǎn)變?yōu)樘荻炔牧?，彈性模量大幅度下降、?dòng)態(tài)彈性模量下降、強(qiáng)度和表面硬度提高、塑性下降。近年來，已有研究證明，對(duì)材料表面進(jìn)行酸蝕能夠促進(jìn)材料表面細(xì)胞的粘附，并通過增加材料表面的親水性來引導(dǎo)成骨細(xì)胞在表面的遷徙，從而促進(jìn)新生骨的形成。目前已有研究者利用酸蝕工藝對(duì)SMAT 純Ti 表面進(jìn)行改性。駱雪等通過在36%～38%的HCl 環(huán)境中對(duì)SMAT 純Ti 進(jìn)行超聲震蕩15 min 并清洗，從而促進(jìn)了MG63 細(xì)胞在SMAT 純Ti 表面的增殖、粘附。朱珊珊等通過延長SMAT 純Ti 在HCl 中超聲震蕩的時(shí)間，使SMAT 純Ti 能夠更好地促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在其表面的成骨分化。高飛等通過動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)一步探索了HCl 酸蝕后的SMAT 純Ti 在生物體內(nèi)對(duì)細(xì)胞成骨分化的促進(jìn)作用，發(fā)現(xiàn)SMAT 純Ti 可提高其表面新生骨的數(shù)量，并使得骨組織形態(tài)更為規(guī)則與致密。研究表明，純Ti 表面在100 ℃的HCl 與HSO雙酸酸蝕環(huán)境下能夠形成增強(qiáng)骨引導(dǎo)的微米級(jí)粗糙結(jié)構(gòu)，顯著提高骨整合的速度與成功率，并降低骨吸收。然而，目前尚無針對(duì)SMAT 純Ti 的酸蝕工藝，例如酸蝕液的濃度、酸蝕時(shí)間與酸蝕溫度的具體探究。

正交試驗(yàn)分析方法作為基于正交性原理的試驗(yàn)方法，可大幅度減少多因素多水平試驗(yàn)的次數(shù)，并通過分析相應(yīng)的K、k 值與R 值，從而對(duì)試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。本文以SMAT 純Ti 作為分析對(duì)象，通過正交試驗(yàn)分析雙酸液的酸蝕濃度、酸蝕時(shí)間與酸蝕溫度對(duì)SMAT 純Ti 表面形貌與生物性能的影響規(guī)律。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試樣制備

試驗(yàn)采用南昌國材科技有限公司生產(chǎn)的厚度為5 mm 的Ti 板為研究對(duì)象，其中雜質(zhì)元素Fe、C、N、H、O的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2×10%、1×10%、5×10%、2×10%、3×10%，其余皆為Ti。Ti 板通過如圖1 所示的SMAT 裝置進(jìn)行處理。SMAT 參數(shù)如下：在液氮環(huán)境下，以50 Hz 的頻率驅(qū)動(dòng)直徑8 mm 的不銹鋼小球?qū)僒i 表面進(jìn)行60 min 的無序撞擊。SMAT 后的Ti 板命名為SMAT 純Ti，經(jīng)過線切割制成5 mm×5 mm×1.5 mm 的SMAT 純Ti 片。SMAT 純Ti 片先后經(jīng)過丙酮與無水乙醇超聲清洗并干燥，去除表面油污與雜質(zhì)。隨后將SMAT 純Ti 片浸入HCl 與HSO混合后的雙酸酸蝕液中，在70～90 ℃的水浴環(huán)境下保溫20～40 min，取出后再先后經(jīng)過丙酮與無水乙醇超聲清洗并干燥，經(jīng)紫外滅菌后密封備用。

圖1 SMAT 裝置Fig.1 Device of SMAT

本試驗(yàn)采用三因素三水平的正交分析方法，所選的3 個(gè)因素分別為HCl 與HSO的濃度、酸蝕時(shí)間與酸蝕溫度，通過控制水平的變化從而對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素與水平如表1 所示。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平編碼Tab.1 Orthogonal test factors and level codes

1.2 性能表征

采用接觸角測量儀測試試樣的親疏水性；采用Cell Counting Kit-8 (CCK-8)細(xì)胞試驗(yàn)測試試樣的細(xì)胞毒性，所用的細(xì)胞為MC3T3-E1 細(xì)胞，采用多功能酶標(biāo)儀測450 nm 波長處96 孔板內(nèi)溶液的吸光度值，并與空白對(duì)照樣進(jìn)行比較，從而獲得相應(yīng)的相對(duì)吸光度值，評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)為相對(duì)吸光度越高則試樣的細(xì)胞毒性越低，即生物相容性越好；采用FEI Quanta 45掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察試樣的微觀組織；利用能量色散X 射線光譜儀表征試樣表面所含元素。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)參數(shù)對(duì)SMAT 純Ti 接觸角的影響

由于親疏水性能夠影響細(xì)胞粘附進(jìn)而影響細(xì)胞分化，在生物試驗(yàn)中常作為細(xì)胞相容性的一個(gè)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。較低的接觸角通常與良好的細(xì)胞粘附與分化相聯(lián)系。通過改變相關(guān)參數(shù)，獲得具有更低接觸角的試樣表面，有助于對(duì)試樣進(jìn)行初步篩選，從而選出具備更好生物相容性的參數(shù)組合。

不同試驗(yàn)條件下測得的試樣表面接觸角值如表2 所示。K 可用于表述不同試驗(yàn)中的優(yōu)勢因素，k 可用于表述不同因素的優(yōu)勢水平。R 為所對(duì)應(yīng)k1、k2、k3 的極差，可用于表述不同因素對(duì)試驗(yàn)值的影響，此處試驗(yàn)值為試樣的接觸角值。其中K1 行的3 個(gè)值分別為4.50 mol/L HCl 與6.72 mol/L HSO、酸蝕溫度為70 ℃、酸蝕時(shí)間為20 min 時(shí)，所對(duì)應(yīng)的3 次試驗(yàn)值之和；K2 行的3 個(gè)值分別為5.80 mol/L HCl 與8.96 mol/L HSO、酸蝕溫度為80 ℃、酸蝕時(shí)間為30 min 時(shí)，所對(duì)應(yīng)的3 次試驗(yàn)值之和；K3行的3個(gè)值分別為7.25 mol/L HCl 與11.20 mol/L HSO、酸蝕溫度為90 ℃、酸蝕時(shí)間為40 min 時(shí)，所對(duì)應(yīng)的3 次試驗(yàn)值之和。k1 行的值分別為4.50 mol/L HCl 與6.72 mol/L HSO、酸蝕溫度為70 ℃、酸蝕時(shí)間為20 min 時(shí)，所對(duì)應(yīng)的3 次試驗(yàn)值的平均值；k2 行的值分別為5.80 mol/L HCl 與8.96 mol/L HSO、酸蝕溫度為80 ℃、酸蝕時(shí)間為30 min 時(shí)，所對(duì)應(yīng)的3 次試驗(yàn)值的平均值；k3 行的值分別為7.25 mol/L HCl 與11.20 mol/L HSO、酸蝕溫度為90 ℃、酸蝕時(shí)間為40 min 時(shí)，所對(duì)應(yīng)的3 次試驗(yàn)值的平均值。

表2 正交試驗(yàn)參數(shù)與結(jié)果Tab.2 Parameters and results of the orthogonal test

由表2 中接觸角值可知，8試樣接觸角值最小，親水性最好；4試樣接觸角值最大，親水性最差。由表2 中R 值可見，3 個(gè)因素按極差由大到小排序可得R1＞R3＞R2。由此可知，酸蝕濃度在本次正交試驗(yàn)中對(duì)接觸角的影響最大，酸蝕溫度次之，酸蝕時(shí)間影響程度最低。R1 與R3 相差較少，與R2 相差較大，可以得出酸蝕濃度與酸蝕溫度對(duì)試樣與水的接觸角影響較大，酸蝕時(shí)間對(duì)試樣與水的接觸角影響最小。對(duì)k 值進(jìn)行比較可以發(fā)現(xiàn)，隨著雙酸酸蝕濃度的增大與酸蝕溫度的升高，試樣與水的接觸角呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢；隨著酸蝕時(shí)間的延長，試樣與水的接觸角則表現(xiàn)為先減小后增大。對(duì)試驗(yàn)中3 個(gè)參數(shù)的變化進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)酸蝕濃度為7.25 mol/L HCl 與11.20 mol/L HSO、酸蝕溫度為90 ℃、酸蝕時(shí)間為30 min 時(shí)，為本次正交試驗(yàn)中接觸角值最低的組合。

2.2 試驗(yàn)參數(shù)對(duì)SMAT 純Ti 表面狀態(tài)的影響

圖2 為試樣的SEM 圖。由圖2 可見，隨著酸蝕時(shí)間的增加，試樣表面的孔洞數(shù)量逐漸增多，整體起伏程度降低。由圖2 中(a)、(f)、(h)可見，當(dāng)酸蝕溫度較低時(shí)，試樣表面的孔洞深度較淺；由圖2(b)、(d)、(i)與圖2(c)、(e)、(g)可見，當(dāng)酸蝕溫度逐漸升高時(shí)，試樣表面的孔洞深度逐漸加深。由圖2(c)、(f)、(i)可見，當(dāng)酸蝕時(shí)間為40 min 時(shí)，隨著酸蝕濃度的增大、酸蝕溫度先降低后升高時(shí)，試樣表面的孔洞大小呈現(xiàn)先增大后縮小的趨勢。通過對(duì)不同參數(shù)的比較與分析可以發(fā)現(xiàn)，酸蝕濃度對(duì)試樣形貌的影響要比酸蝕時(shí)間與酸蝕溫度的影響要大。

圖2 不同試驗(yàn)參數(shù)下SMAT 純Ti 酸蝕后的表面形貌Fig.2 Surface morphologies of the SMAT pure Ti after acid etching under different test parameters

表3 為不同試驗(yàn)參數(shù)下SMAT 純Ti 酸蝕后的試樣在能量色散X 射線光譜儀下測量得到的表面元素含量，測試范圍為圖2 表示的區(qū)域。由表3 可知，試樣表面主要檢測出作為基體的Ti 元素與在液氮環(huán)境下進(jìn)行SMAT 處理后引入的少量N 元素，以及與空氣接觸形成氧化物后帶入的微量O 元素，且無論試樣處于何種酸蝕處理環(huán)境下，表面均未檢出S、Cl 等有害元素。

表3 正交試驗(yàn)后試樣表面元素含量Tab.3 Element contents of the sample surfaces after orthogonal test

2.3 試驗(yàn)參數(shù)對(duì)SMAT 純Ti 生物相容性的影響

表4 為不同試驗(yàn)條件下試樣的相對(duì)吸光度。由表4 可知，7試樣的相對(duì)吸光度最高，表明7試樣在本試驗(yàn)中具有最好的生物相容性，其次是9試樣。分析k 值可以發(fā)現(xiàn)：隨著酸蝕濃度的增加，試樣的生物相容性也隨之上升；酸蝕時(shí)間對(duì)試樣的生物相容性的影響表現(xiàn)為，隨著酸蝕時(shí)間的延長，試樣的生物相容性先降低后緩慢上升；酸蝕溫度對(duì)試樣的生物相容性的影響表現(xiàn)為，隨著酸蝕溫度的升高，試樣的生物相容性上升。通過比較k 值可知，當(dāng)酸蝕濃度為7.25 mol/L HCl 與11.20 mol/L HSO、酸蝕時(shí)間為20 min、酸蝕溫度為90 ℃，試樣的生物相容性應(yīng)為理論最優(yōu)值。將該組參數(shù)與正交試驗(yàn)表進(jìn)行對(duì)比可知，理論最優(yōu)值對(duì)應(yīng)的參數(shù)剛好可制得7試樣。通過比較R 值的大小，可以發(fā)現(xiàn)R1＞R2＞R3，且R2與R3相差不大，R1相對(duì)R2 與R3 而言相差較大。由此可以推出酸蝕濃度對(duì)試樣的生物相容性影響最大，酸蝕時(shí)間次之，酸蝕溫度影響最小。

圖3 為對(duì)表4 中的相對(duì)吸光度作圖所得，其中0試樣為未經(jīng)SMAT 與酸蝕處理的純Ti 試樣，用于評(píng)價(jià)不同試驗(yàn)參數(shù)處理后SMAT 純Ti 的生物相容性并進(jìn)行比較。圖3 中橫線為0試樣相對(duì)吸光度的75%，該值通常作為評(píng)價(jià)生物相容性是否合格的分界線。若材料經(jīng)過處理后，其相對(duì)吸光度值高于對(duì)照樣相對(duì)吸光度值的75%，即可認(rèn)為該材料生物相容性合格，且相對(duì)吸光度值越大，材料的生物相容性越好。由圖3 可得，與對(duì)照組相比，不同試驗(yàn)參數(shù)處理后SMAT 純Ti 的生物相容性均有不同程度的提高，且均高于對(duì)照樣相對(duì)吸光度的75%。這表明不同試驗(yàn)參數(shù)處理后SMAT 純Ti 的生物相容性全部合格，且7試樣的生物相容性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他試樣。

圖3 試驗(yàn)參數(shù)對(duì)酸蝕后SMAT 純Ti 生物相容性的影響Fig.3 Effect of test parameter on the biocompatibility of SMAT pure Ti after acid etching

表4 正交試驗(yàn)參數(shù)與結(jié)果Tab.4 Parameters and results of the orthogonal test

3 結(jié) 論

（1）試驗(yàn)選用的酸蝕參數(shù)中，酸蝕濃度對(duì)試樣的表面形貌、親水性與生物相容性影響最大。剩余兩個(gè)參數(shù)中，酸蝕溫度對(duì)接觸角的影響更大，酸蝕時(shí)間對(duì)生物相容性的影響更大。

（2）隨著酸蝕濃度的增大與酸蝕溫度的升高，試樣的生物相容性都表現(xiàn)為一直提高；而隨著酸蝕時(shí)間的延長，試樣的生物相容性呈現(xiàn)先降低后提高的趨勢。酸蝕濃度的增大，使試樣表面的孔洞尺寸呈現(xiàn)出了先增大后減小的變化，而酸蝕溫度的升高則使得試樣表面孔洞的深度不斷增加。

（3）本試驗(yàn)中的最佳試驗(yàn)參數(shù)即酸蝕濃度為7.25 mol/L HCl 與11.20 mol/L HSO、酸蝕時(shí)間為20 min、酸蝕溫度為90 ℃，此時(shí)試樣與水的接觸角為63.5，相對(duì)吸光度為5.243。