董袁袁，徐 恒，張 華，張 恒，王伏林，顧娜娜，朱 英，*

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021)

種子萌發(fā)是植物生命周期的第一個(gè)關(guān)鍵步驟，種子萌發(fā)從種子吸脹開始，到種皮出現(xiàn)胚根時(shí)結(jié)束。穗發(fā)芽(pre-harvest sprouting，PHS)是水稻、玉米、小麥等農(nóng)作物在種子成熟后期遇到連續(xù)陰雨天氣，導(dǎo)致種子在穗子上萌發(fā)的現(xiàn)象。由于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上栽培的水稻品種休眠較短或者不明顯，如果在灌漿后期遇到高溫多雨天氣，更易出現(xiàn)穗發(fā)芽的現(xiàn)象。穗發(fā)芽使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)遭受了嚴(yán)重?fù)p失，全球每年因穗發(fā)芽造成的損失超過10億美元。在我國南方地區(qū)，因?yàn)橄募具B續(xù)的高溫陰雨天氣較多，穗發(fā)芽更是水稻生產(chǎn)上的一個(gè)非常嚴(yán)重的問題。另外，雜交稻在制種過程為解決不育系包頸問題，大量使用赤霉素，穗發(fā)芽現(xiàn)象就更為嚴(yán)重。其次，穗發(fā)芽的谷物具有較高的氧化還原酶和水解酶活性，導(dǎo)致種子中的儲(chǔ)藏物質(zhì)提前分解，非常容易造成水稻品質(zhì)變劣。穗發(fā)芽不但影響水稻產(chǎn)量，還嚴(yán)重危害稻米品質(zhì)。因此，穗發(fā)芽問題迫切需要加以遏制。

穗發(fā)芽的調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，受到多種遺傳因素和環(huán)境因素控制。遺傳因素主要包括種子成熟度、α-淀粉水解酶活性、內(nèi)源激素平衡、可溶性糖含量等，環(huán)境因素主要有溫度、濕度和光照等。種子休眠受多種植物激素的調(diào)控，脫落酸(abscisic acid，ABA)和赤霉素(gibberellin，GA)是其中最重要的2個(gè)激素。ABA和GA在種子成熟、休眠和萌發(fā)過程中存在相互拮抗作用，ABA可以抑制種子萌發(fā)，誘導(dǎo)種子進(jìn)入休眠狀態(tài)；而GA則通過打破種子休眠，進(jìn)而促進(jìn)種子萌發(fā)。除了ABA和GA外，近年來，人們發(fā)現(xiàn)其他植物激素，例如乙烯(ethylene，ETH)、油菜素內(nèi)酯(epibrassinolide，BR)、細(xì)胞分裂素(cytokinin，CTK)和生長素(Auxin，IAA)等也參與調(diào)控種子休眠。α-淀粉酶活性和后熟時(shí)間也可以反映穗發(fā)芽的水平。穗發(fā)芽谷物的籽粒中α-淀粉酶活性通常較高，且后熟時(shí)間較早。當(dāng)α-淀粉酶活性提高時(shí)，籽粒內(nèi)部的淀粉會(huì)提前分解，進(jìn)而使種子內(nèi)可溶性糖等物質(zhì)的含量增加，促進(jìn)種子萌發(fā)。光照、溫度和濕度等環(huán)境因素也是控制種子休眠與萌發(fā)的重要因素。紅光通過光受體光敏色素可促進(jìn)擬南芥種子萌發(fā)，而藍(lán)光通過光受體隱花色素抑制大麥種子的萌發(fā)，綠光可以通過隱色素抑制大麥種子萌發(fā)。種子發(fā)育期間溫度的變化強(qiáng)烈影響種子成熟時(shí)休眠的深度。溫度主要在谷類作物的成熟階段和萌發(fā)階段影響穗發(fā)芽。近年來，極端天氣的頻繁發(fā)生，導(dǎo)致水稻在成熟季節(jié)經(jīng)常出現(xiàn)間歇性的高溫或者低溫。一般來說，籽粒成熟后期溫度越高，休眠期就越短，高溫下(>26 ℃)發(fā)育的小麥籽粒休眠程度低或者無休眠；而低溫則會(huì)導(dǎo)致谷物休眠加劇。濕度對(duì)種子休眠也有一定的影響，在成熟期低休眠或者無休眠的種子，如果空氣濕度較大(相對(duì)濕度70%以上)，籽粒就會(huì)在穗上長出胚根胚芽，從而形成穗發(fā)芽。

目前，大部分的研究都是關(guān)于高溫多雨的環(huán)境導(dǎo)致穗發(fā)芽，而關(guān)于多雨潮濕影響穗發(fā)芽的分子機(jī)制卻很少有研究。本研究在水稻成熟后期，通過高濕處理模擬持續(xù)陰雨條件，研究高濕條件下種子休眠相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控，為后續(xù)研究水稻穗發(fā)芽提供標(biāo)記基因，為研究水稻種子休眠和萌發(fā)的分子調(diào)控機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以粳稻(L.)DongJin(DJ)為材料。水稻材料種植在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田。

1.2 處理方法

在孕穗期選取60株長勢一致的植株，帶泥挖取，避免傷根，移入方桶中，每桶栽2株，在人工氣候室中培養(yǎng)。生長條件：12 h光照/28 ℃，12 h黑暗/22 ℃，相對(duì)濕度為60%，光量子通量密度為600 μmol·m·s。將開花后水稻進(jìn)行標(biāo)記，并分別選取開花后26、28、30、32 d(分別標(biāo)記為DAP26、DAP28、DAP30、DAP32)的水稻植株，用透氣不透水的無紡布袋包裹水稻植株防止水分揮發(fā)，每3 h噴水1次，每桶水稻噴水500 mL，共處理5 d。觀察穗發(fā)芽情況。

1.3 RNA提取與cDNA獲得

選取開花后30 d的水稻種子進(jìn)行高濕處理，分別在處理后1、6、12、24、48、72、96、120 h取材，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取標(biāo)記好的籽粒30粒，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。

水稻種子總RNA的提取使用通用植物RNA提取試劑盒(BioTeke，China)，提取的總RNA用TURBO DNA-free kit(Invitrogen，USA)消化殘留的基因組DNA。采用Beckman DU730分光光度計(jì)(Beckman，USA)測定RNA質(zhì)量和濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。第一鏈cDNA合成使用Goscript Reverse Transcription system反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega，USA)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

qRT-PCR使用FastStart通用SYBR Green Master(Roc he Switzerland)在QuantStudio 12k Flex RealTime PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，USA)上進(jìn)行。qRT-PCR反應(yīng)體系：0.5 μL cDNA，4 μL RNase-free water，5 μL 2×FastStart Universal SYBR Green Master mix，上下游引物(10 μmol·L)各0.25 μL，總體系共10 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。qRT-PCR均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。以水稻10為內(nèi)參基因，基因相對(duì)表達(dá)量采用2法計(jì)算。qRT-PCR使用引物信息見表1。

表1 qRT-PCR所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 高濕環(huán)境中種子穗發(fā)芽表型

為了研究水稻種子成熟度與穗發(fā)芽的關(guān)系，對(duì)開花后不同時(shí)間(DAP26、DAP28、DAP30、DAP32)的粳稻(Dongjin以下簡稱DJ)種子進(jìn)行人工高濕處理(圖1-A)。從圖1-B可以看出，對(duì)于DJ種子來說，雖然胚在開花后20 d左右已經(jīng)成熟，但是最早在開花后28 d進(jìn)行高濕處理種子才能有少量萌發(fā)，開花后30 d及以上的種子經(jīng)過高濕處理才能誘發(fā)明顯的穗發(fā)芽，而開花后26 d的種子即使在高濕處理下也基本不萌發(fā)，說明種子的成熟度是誘發(fā)種子穗上發(fā)芽的一個(gè)關(guān)鍵因素。

A，高濕處理的水稻；B，高濕處理后種子萌發(fā)情況。

2.2 高濕處理對(duì)ABA合成代謝基因的影響

從圖2可以看出，對(duì)于ABA合成過程中的限速酶基因來說，高濕處理1 h，1、2和3開始受到明顯抑制，抑制作用一直持續(xù)到72 h；而4基因的表達(dá)在高濕處理早期沒有明顯規(guī)律；4個(gè)基因在高濕處理后期(72 h或96 h以后)表達(dá)量都開始快速上升。高濕處理能迅速并持續(xù)誘導(dǎo)ABA降解基因的表達(dá)，尤其是81和83基因，它們?cè)诟邼裉幚? h開始誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)量分別是對(duì)照組的4.3倍和2.2倍，到96 h這2個(gè)基因的表達(dá)量是對(duì)照組的89倍和30倍。82基因表達(dá)與其他2個(gè)8基因相比，沒有明顯的變化規(guī)律，推測其受高濕環(huán)境影響較小。以上結(jié)果表明，高濕處理早期能迅速誘導(dǎo)ABA降解途徑基因(81和83)的表達(dá)，并抑制ABA合成基因(1、2和3)的表達(dá)。

CK，對(duì)照組；HH，高濕處理。采用非配對(duì)t檢驗(yàn)確定差異顯著性，*表示P<0.05，**表示P<0.01。下同。

2.3 高濕處理對(duì)GA合成基因表達(dá)的影響

對(duì)于20基因來說，201基因表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，201基因表達(dá)在高濕處理1 h就受到誘導(dǎo)，在96 h表達(dá)量達(dá)到最高，是對(duì)照組的30倍以上(圖3-A)。202基因的表達(dá)在高濕處理早期沒有明顯變化，直到處理72 h才上升(圖3-B)。32基因在高濕處理12 h開始上升，并在96 h達(dá)到最高值，為對(duì)照組的800倍左右；而31基因表達(dá)在整個(gè)處理過程與其他GA合成基因的表達(dá)相比，變化相對(duì)較小，僅為對(duì)照組2倍左右(圖3-C、D)。以上結(jié)果表明，高濕處理能明顯誘導(dǎo)GA合成相關(guān)基因的表達(dá)，并且不同GA合成基因的響應(yīng)速度和響應(yīng)強(qiáng)度有差異，201和32能快速響應(yīng)高濕環(huán)境，且其表達(dá)量受到強(qiáng)烈誘導(dǎo)。

圖3 高濕處理水稻種子中GA合成基因的相對(duì)表達(dá)量

2.4 ABA和GA前體合成基因在高濕處理下的表達(dá)模式

由圖4可知，ABA前體合成基因、和的表達(dá)量在高濕處理前期變化較小，在高濕處理72 h后表達(dá)量才明顯上升。2和1是GA前體合成基因，2與ABA前體合成基因具有相同的表達(dá)模式，即在高濕處理前期表達(dá)量變化不大，在高濕處理72 h明顯上升。而1基因則在高濕處理前期受到抑制，在高濕處理96 h明顯上升。因此，高濕處理前期對(duì)GA和ABA前體合成基因的表達(dá)影響較少，主要是在處理后期(72 h后)影響這些基因表達(dá)。而高濕處理72 h這一時(shí)間點(diǎn)，種子的萌發(fā)已基本完成，幼苗的生長即將開始，推測激素前體合成基因的表達(dá)與這些激素開始重新合成有關(guān)。

圖4 高濕處理水稻種子中ABA和GA前體合成基因的相對(duì)表達(dá)量

2.5 ABA和GA響應(yīng)基因在高濕處理下的表達(dá)模式

3、4和5基因的表達(dá)量在高濕處理前期變化不大，在高濕處理48 h開始緩慢上升，到96～120 h上升為對(duì)照組的4～7倍(圖5)。ABA響應(yīng)基因3和16的表達(dá)量在高濕處理早期(1 h和6 h)沒有明顯變化，12 h后開始明顯下降，96 h后又開始上升，到120 h上升至對(duì)照組的5倍左右。GA信號(hào)響應(yīng)基因和1的表達(dá)在高濕處理前期變化較小，處理24 h后表達(dá)量開始上升，96～120 h表達(dá)量可達(dá)到對(duì)照組的10倍以上。

圖5 高濕處理水稻種子中ABA和GA響應(yīng)基因的相對(duì)表達(dá)量

2.6 淀粉水解酶基因在高濕處理下的表達(dá)模式

為了進(jìn)一步研究高濕處理如何影響α-淀粉水解酶基因表達(dá)，檢測了α-淀粉水解酶基因1、2、3、3、3、3和3在高濕處理下的表達(dá)模式。結(jié)果(圖6)顯示，1、3、3和3基因的表達(dá)量在高濕處理前期(1、6、12、24 h)沒有明顯的變化規(guī)律，在高濕處理中后期(72 h后)表達(dá)量急劇升高，為對(duì)照組的30倍以上。有意思的是，3是整個(gè)種子發(fā)育時(shí)期表達(dá)豐度最高的α-淀粉水解酶基因，但它在高濕處理前期的表達(dá)量先上升后下降，到72 h后表達(dá)量再次開始上升，是對(duì)照組的2倍左右，相對(duì)來說受高濕處理的影響較小。2基因表達(dá)量與上述1等4個(gè)淀粉水解酶基因相比，受高濕處理影響較小。3在高濕條件下的表達(dá)模式與其他α-淀粉水解酶基因均不同，它的表達(dá)受到高濕處理的抑制。

圖6 高濕處理水稻種子中淀粉水解酶基因的相對(duì)表達(dá)量

α-淀粉水解酶基因在高濕處理下的表達(dá)模式可以大致分為3種模式，一種是高濕處理前期沒有明顯變化，而在高濕處理中后期(高濕處理48 h或72 h)表達(dá)量急速上升，例如1、3、3和3；一種是總體上高濕處理對(duì)其表達(dá)影響較小，例如2、3；最后一種是高濕處理下表達(dá)受到持續(xù)抑制，例如3。以上結(jié)果表明，1、3、3和3基因能快速相響應(yīng)高濕處理，可能是在水稻種子穗發(fā)芽中起主要作用的α-淀粉水解酶基因。

3 討論

水稻穗發(fā)芽一直是研究的熱點(diǎn)話題。水稻穗發(fā)芽具有作物種子萌發(fā)的特征，但又區(qū)別于種子萌發(fā)，其過程更為復(fù)雜。ABA和GA在調(diào)控種子休眠過程中存在相互拮抗作用，并且種子中ABA和GA的比例是決定種子休眠還是萌發(fā)的關(guān)鍵因素，而ABA和GA比例的變化可以歸因于關(guān)鍵激素代謝基因的差異表達(dá)。NCED是ABA生物合成過程中的限速酶，ABA8ox是ABA失活過程中的關(guān)鍵酶。本研究結(jié)果顯示，高濕處理可以迅速促進(jìn)ABA代謝基因8表達(dá)，并抑制ABA合成過程限速酶基因的表達(dá)。高濕處理能迅速并持續(xù)誘導(dǎo)ABA降解酶基因(81和83)的表達(dá)，相對(duì)來說，82基因表達(dá)量變化不大。另外1、2和3在高濕處理的早期和中期都受到明顯抑制，而4的表達(dá)沒有明顯規(guī)律。這表明ABA降解途徑基因(81、83)和ABA合成途徑基因(1、2、3)能夠快速響應(yīng)高濕環(huán)境并參與調(diào)控穗發(fā)芽。

前人研究表明，水稻種子在吸脹萌發(fā)過程中，ABA降解途徑基因8和ABA合成基因均快速上升，6 h達(dá)到最大，隨后迅速下降；擬南芥中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象；但本研究中ABA降解途徑基因81和83基因能夠快速并持續(xù)響應(yīng)高濕處理，在高濕處理后期它們表達(dá)量也沒有下降。另外，高濕條件下ABA合成基因表達(dá)受到快速抑制，72 h后才開始迅速上升，這與種子吸脹過程中表達(dá)模式也明顯不同。這表明ABA合成代謝基因在持續(xù)陰雨導(dǎo)致的穗發(fā)芽與種子吸脹萌發(fā)過程中表達(dá)模式具有明顯差異。因此，以往針對(duì)種子萌發(fā)過程中相關(guān)基因表達(dá)模式的研究并不適用于穗發(fā)芽過程。

對(duì)于ABA響應(yīng)的下游基因3和16來說，其對(duì)高濕處理的響應(yīng)慢于ABA合成代謝基因，高濕處理12 h它們表達(dá)量才迅速下降。因此，高濕處理能夠迅速促進(jìn)ABA降解途徑基因并抑制ABA合成基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致ABA含量迅速下降，然后抑制ABA響應(yīng)基因的表達(dá)。ABA合成、代謝與響應(yīng)基因在高濕處理后期(72 h或96 h后)表達(dá)量迅速上升可能是由于這個(gè)時(shí)期種子已經(jīng)萌發(fā)進(jìn)入幼苗生長階段，開始重新合成ABA。

GA通過拮抗ABA促進(jìn)種子萌發(fā)。GA合成基因(201、202和32)也能響應(yīng)高濕處理，但是它們響應(yīng)速度有所差別。201基因響應(yīng)高濕處理速度最快，高濕處理1 h它的表達(dá)量就上升；其次是32，在高濕處理48 h時(shí)其表達(dá)量明顯上升；最后是202基因，其表達(dá)量直到處理72 h才明顯上升。與其他幾個(gè)GA合成基因相比，31基因受高濕處理影響較小。本研究中，201除了能最快響應(yīng)高濕處理，其表達(dá)豐度也最高，所以201可能是參與調(diào)控水稻穗發(fā)芽的最主要的GA合成基因。

f-胡蘿卜素去飽和酶()、番茄紅素去飽和酶()和類胡蘿卜素異構(gòu)酶()是ABA前體合成類胡蘿卜素的關(guān)鍵基因。水稻中分離的與穗發(fā)芽有關(guān)的基因大多也是參與ABA前體合成類胡蘿卜素生物合成途徑的基因。內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶()、內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶()是GA前體合成關(guān)鍵基因，催化GA合成的關(guān)鍵步驟。本研究中，對(duì)GA和ABA前體合成基因來說，在高濕處理早期，他們的表達(dá)模式比較類似，即在高濕處理前期相對(duì)于GA和ABA合成代謝基因的表達(dá)變化來說，它們表達(dá)變化相對(duì)較小，而在中后期才明顯上升，這表明高濕處理首先是直接影響ABA和GA合成代謝基因的表達(dá)而不是它們的前體合成基因，這樣才能迅速改變ABA和GA的含量，從而促進(jìn)萌發(fā)。GA和ABA前體合成基因中后期才明顯上升可能是由于高濕處理后期種子已經(jīng)萌發(fā)，處于幼苗開始生長階段，這些激素開始重新合成代謝。

在禾本科作物種子中，GA可以誘導(dǎo)α-淀粉水解酶基因的表達(dá)，ABA可能通過拮抗GA的作用從而抑制α-淀粉酶基因的表達(dá)。水稻中，α-淀粉水解酶將胚乳中淀粉水解為可溶性糖，為幼苗生長提供物質(zhì)和能量。本研究中1、3、3和3基因在中后期(48 h或72 h)響應(yīng)高濕處理，并且它們表達(dá)量迅速上升，因此，這4個(gè)α-淀粉水解酶基因可能是調(diào)控水稻穗發(fā)芽的重要基因。而2、3和3這3個(gè)α-淀粉水解酶基因與其他4個(gè)α-淀粉水解酶基因相比，受高濕影響較小或受高濕抑制，推測它們可能不參與穗發(fā)芽過程。另外，淀粉水解酶基因響應(yīng)高濕處理要晚于ABA和GA合成代謝基因，ABA和GA合成代謝基因的表達(dá)量在處理1 h就迅速上調(diào)，而α-淀粉水解酶基因的表達(dá)量在處理48 h后才迅速上調(diào)，推測高濕處理首先迅速影響ABA和GA合成代謝基因表達(dá)，改變ABA和GA含量，隨后通過提高GA/ABA比例，促進(jìn)α-淀粉水解酶基因表達(dá)，最終水解淀粉，為種子萌發(fā)提供能量。

綜上所述，高濕處理后，首先ABA降解途徑基因(81和83)和GA合成基因(201和32)表達(dá)量迅速升高，同時(shí)ABA合成途徑中關(guān)鍵基因(1、2和3)的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致種子中ABA含量大幅度降低，GA含量增加，ABA/GA下降，進(jìn)而促進(jìn)α-淀粉水解酶基因(1、3、3和3)的表達(dá)，從而促進(jìn)種子萌發(fā)。本研究為環(huán)境因子(高濕)誘導(dǎo)的水稻穗發(fā)芽機(jī)制研究提供了一定的理論基礎(chǔ)，挖掘的這些高濕響應(yīng)基因可以作為水稻穗發(fā)芽研究的標(biāo)記基因。