肝衰竭是多種因素引起肝臟合成、解毒、代謝和生物轉化功能嚴重障礙或失代償的一類嚴重癥候群，病死率極高，28 d死亡率為30%～40%。其中慢加急性肝衰竭(ACLF)是我國最常見的肝衰竭類型

。目前肝衰竭的內科治療缺乏有效藥物及手段，經積極內科綜合治療和/或人工肝治療病情無法好轉或恢復者，肝移植成為最后的治療手段，但肝移植費用高，供肝緊缺，尚難廣泛開展。中醫(yī)學在我國歷史悠久且沿襲至今，中藥在肝衰竭的治療中具有一定優(yōu)勢。茵陳四逆湯治療ACLF確有療效，但目前的研究大多局限于某一通路或作用靶點進行研究，無法體現中藥多途徑、多靶點的特點。網絡藥理學結合了層次網絡構建與分析、生物信息學、計算生物學、多向藥理學分析等多學科的研究方法和內容，將單一靶標、單一途徑的研究形式轉變?yōu)檎w、系統(tǒng)的形式，以探索藥物、靶點、疾病之間的關聯(lián)，與中醫(yī)的整體觀一致

。因此本文通過網絡藥理學較全面研究了茵陳四逆湯治療ACLF的作用機制，以期為后續(xù)研究提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 茵陳四逆湯活性成分及相關靶點篩選 從TCMSP數據庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索茵陳四逆湯中各藥物的化學成分，借助該數據庫ADME(absorption and distribution and metabolism and excretion)的功能以篩選出各藥物的活性成分

，設定口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18篩選活性成分,得到藥物活性成分后，利用TCMSP數據庫檢索中“Related Targets”這一功能查找各活性成分對應作用的靶蛋白，運用Uniprot蛋白質數據庫(https://www.uniprot.org)將蛋白質的名稱進行標準化處理，并將靶蛋白轉化為genesymbol，限定物種為“Homo Sapiens”，從而得到藥物靶點。

1.2 ACLF相關靶點篩選 分別通過GeneCards數據庫(https://www. genecards.org)、OMIM數據庫(http://www.omim.org)、TTD 數據庫(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)，以“acute-on-chronic liver failure”為關鍵詞檢索ACLF相關靶點，在Genecards數據庫中，Score 值越高代表該靶點與疾病聯(lián)系密切,選取Relevance score≥5的靶點為ACLF的潛在靶點，將3個數據庫的結果進行合并，刪除重復靶點，從而得到ACLF相關靶點。

1.3 茵陳四逆湯與ACLF共同靶點的獲取并進行網絡構建 將篩選得到的藥物靶點與疾病靶點導入Draw Venn Diagram平臺(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制韋恩圖，并得到交集靶點，預測其可能為茵陳四逆湯治療ACLF的靶點；將治療靶點提交給STRING 11.0數據庫(https://string-db.org)構建蛋白互作網絡(PPI)

，將生物種類設定為“Homo sapiens”，設置highest confidence=0.9，并隱藏游離節(jié)點，其余設置均為默認設置，得到PPI網絡。利用Cytoscape3.7.2軟件進行可視化分析， 運用CytoHubba得到關鍵子網絡，采用MCC算法計算基因核心度，選取MCC評分前10 的基因，認為其可能是茵陳四逆湯治療ACLF的關鍵基因；同時利用Cytoscape3.7.2軟件構建藥物活性成分-靶點-疾病網絡圖，使用Network Analyzer功能計算出各個節(jié)點(node)的網絡拓撲參數初步評估其重要性，包括連接度(Degree)、介度(Betweenness)及緊密度(Closenesss)等，每個節(jié)點的大小根據連接度大小而調節(jié)，連接度值越大，節(jié)點越大，從而得到主要藥物活性成分。

1.4 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 借助Metascape數據庫對134個治療靶點進行基因本體(GO)富集分析以及基因組百科全書(KEGG)通路分析，設定閾值

<0.01,從而探討治療靶點參與的生物學功能以及靶點涉及的信號通路，根據

值評估蛋白列表注釋功能的顯著性，篩選排名靠前的生物過程或通路，并通過微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)進行可視化及對KEGG結果中重要通路進行分析。

2 結果

通過PPI網絡分析發(fā)現JUN、TNF、IL1B、IL6、STAT3、IL4、CXCL8、CCL2、MAPK3、RELA為網絡的關鍵靶蛋白。JUN可被c-Jun N-末端激酶(JNK)激活，上調凋亡蛋白Bim表達而誘發(fā)線粒體途徑介導的細胞凋亡

。TNF、IL1B、IL6、IL4為重要的炎癥因子。STAT3是一種潛在的轉錄因子，Kim等

研究發(fā)現IL-6通過mTOR/STAT3信號途徑刺激CD4

T淋巴細胞內的STAT3磷酸化及表達增加，促進Th17細胞產生IL-17增加，加重ACLF患者的炎癥反應。

利用Cytoscape3.7.2軟件構建藥物-活性成分-靶點網絡圖，見圖3。通過Cytoscape3.7.2內置的Network Analyzer分析茵陳四逆湯治療ACLF的網絡拓撲學參數，得到核心藥物成分。由圖可看出藥物、靶點、疾病構成了復雜的網絡關系，體現了茵陳四逆湯治療ACLF不是通過單一的成分或靶點，而是通過多成分、多靶點來發(fā)揮作用。每種活性成分均能與多個靶點相互作用，每個靶點也能與多個活性成分相互作用，其中按連接度值排名前4位藥物活性成分依次為槲皮素(quercetin)(DC=211,BC=0.213 842 18,CC=0.588 235 29)、異鼠李素(isorhamnetin)(DC=41,BC= 0.006 953 58,CC=0.416 666 67)、山奈酚(kaempferol)(DC=40,BC=0.035 956 1,CC= 0.444 444 44)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)(DC=36,BC= 0.010 343 94,CC= 0.409 556 31)，見表1。

7.Wish you a very special Thanksgiving Day for you and your family.

2.2 ACLF相關靶點 通過GeneCards數據庫以“acute-on-chronic liver failure”檢索疾病靶點，得到1 929個目標靶點，選取Relevance score≥5的靶點，得到1 116個靶點。結合OMIM數據庫、TTD數據庫檢索“acute-on-chronic liver failure”以補充潛在靶點，將3個數據庫的疾病靶點進行合并，刪除重復值，得到疾病靶點1 448個。

本研究分析顯示槲皮素、異鼠李素、山奈酚等為茵陳四逆湯治療ACLF的主要活性成分。槲皮素可通過下調NF-kB、MAPK信號通路抑制IL1、IL6、IL8、TNF-α等炎癥因子的表達，并參與Bcl-2/Bax信號通路防止肝細胞凋亡

；還可調節(jié)Th17/Treg細胞的平衡向Treg優(yōu)勢轉變，減輕細胞免疫損傷，并顯著降低Th17相關促炎細胞因子IL-17和IL-6的水平

。異鼠李素能通過抑制c-Jun N-末端激酶(JNK)減少細胞凋亡

。宋金玥等

發(fā)現在山奈酚干預下肝衰竭小鼠的肝組織中，IκB-α表達明顯升高，磷酸化型NF-κB p65表達明顯降低，小鼠肝細胞凋亡數量明顯減少，猜測山奈酚通過抑制NF-κB途徑，下調炎癥因子，減輕肝細胞凋亡。

KEGG分析提示治療靶點涉及169條通路，其中與ACLF相關的通路有49條，根據

值由小到大排名，將與ACLF相關的信號通路前20個繪制氣泡圖，其中AGEs-RAGE信號通路、Hepatitis B、IL-17信號通路、TNF信號通路、Hepatitis C、PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路均居于前位，且通路中均富集較多靶點，提示這些通路可能是茵陳四逆湯治療ACLF的重要通路。同時NF-kB信號通路、Th17細胞分化通路、Toll樣受體信號通路在肝衰竭疾病發(fā)展中也起重要作用，見圖4(B)。因此據圖中結果提示茵陳四逆湯可能是通過抑制炎癥、減少細胞凋亡、調節(jié)免疫等多途徑來治療ACLF。

然而，事實上，他們卻都是沒有理想、沒有信仰，也沒有完整的傳統(tǒng)文化思想體系的人，到一起也不過就談一些如何掙錢、如何享受以及卿卿我我的性愛話語。他們的一舉一動，都還是為了吃好、穿好，以及感覺器官的享受而去追求、去奔波。在未來的生活長河中，何時遇急流險灘，何時遇風雨交加，他們卻從來沒有想過。

3 討論

肝衰竭是一組終末期肝病癥候群，在西醫(yī)治療的基礎上加用中藥治療在改善其癥狀、生化指標，降低死亡率方面療效確切

。雖然中醫(yī)學中并無肝衰竭的病名，根據其臨床表現，可歸屬于“急黃”“瘟黃”等范疇?！督饏T要略》言“黃家之所得，從濕得之。”濕邪致病在黃疸的發(fā)病過程中早已不鮮，而陽虛在ACLF的發(fā)病過程中的作用逐漸被醫(yī)家所認識。清代黃元卿認為黃疸為脾陽虛，脾土濕邪過盛所致；毛德文教授亦以扶陽培土法為原則治療ACLF，取得顯著療效。茵陳四逆湯始載于宋·《傷寒微旨論》，由茵陳、制附子、干姜、炙甘草組成，具有溫陽散寒、利濕退黃的功效，現代藥理示茵陳四逆湯具有保肝利膽退黃、抗炎、增強免疫的作用

，可降低ACLF患者ALT、AST、TBil等肝功能指標、改善凝血功能及MELD評分，延長存活時間

。

2.3 網絡構建及可視化分析 通過韋恩圖繪制平臺，將篩選后的藥物靶點與疾病靶點繪制韋恩圖，得到茵陳四逆湯治療肝衰竭的靶點134個；進而將134個治療靶點導入STRING11.0數據庫，將節(jié)點之間的關聯(lián)分值(Combine score)設置highest confidence=0.9，設置隱藏游離節(jié)點，其余設置均為默認設置，得到PPI網絡。運用Cytoscape 3.7.2軟件進行PPI可視化，其中有134個節(jié)點，138條邊，平均節(jié)點度8.88(見圖1)。運用CytoHubba得到關鍵子網絡，采用MCC算法計算基因核心度，選取MCC評分前10 的基因，分別為JUN、TNF、IL1B、IL6、STAT3、IL4、CXCL8、CCL2、MAPK3、RELA，這些靶點可能為茵陳四逆湯治療ACLF關鍵靶點，見圖2。

2.4 GO功能及KEGG通路富集分析 利用Metascape數據庫，分別從生物過程(BP)、分子功能(MF)和細胞組分(CC)3個不同的靶點功能水平對134個靶點進行GO富集分析。由圖4(A)可知，按照

<0.01的閾值過濾，茵陳四逆湯參與的生物過程主要為對脂多糖的應答、對有毒物質的反應、細胞因子介導的信號通路、對細胞外刺激的反應等；由細胞組分分析可知膜筏、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物、囊腔、細胞外基質占主要；而分子功能主要包括轉錄因子結合、細胞因子受體結合、蛋白激酶結合等。

2.1 茵陳四逆湯活性成分及靶點 經過檢索獲得236個靶點基因與經TCMSP數據庫鑒定茵陳四逆湯中的131個活性成分相關聯(lián)。其中茵陳中13種活性成分共作用于322個靶點，附子中65種活性成分共作用于28個靶點，干姜中148種活性成分共作用于51個靶點，甘草中92種活性成分共作用于1 488個靶點。結果表明，相同的活性成分可以作用于不同的靶點，不同的活性成分也可以作用于同一靶點。

這樣崇高的境界，并非人人都能達到，但并不影響我們去做一個有益于社會的人。山東煙臺孤寡老人劉盛蘭，花甲之年拾荒助學，20多年積攢了10萬多元，自己省吃儉用，卻悉數捐給了全國各地100多個貧困學子。云南省原政協(xié)副主席楊維駿，頂著巨大壓力和風險，堅持實名舉報原省委書紀白恩培，為最終擒獲這只惡“虎”立了功。山東老人候井天，離休后以一己之力踏破鐵鞋費數年之功，編著了《聶紺弩舊體詩全編》，功德無量。他們的“夕陽”紅得像朝陽一樣絢麗多彩。

信貸扶貧資金管理方面主要的創(chuàng)新有：第一，借款主體的創(chuàng)新，先后嘗試了直接貸款到戶、扶持經濟實體、支持地方主導產業(yè)和龍頭企業(yè)，以及直接貸款到戶與委托幫扶貸款相結合等方式；第二，貸款方式創(chuàng)新，1986年以來嘗試了政府信用下的經濟實體貸款、依托社會信用的小額貸款、抵押和擔保為基礎的企業(yè)或政府貸款等；第三，貼息方式創(chuàng)新，嘗試了貼息給承貸銀行、貼息給借款人等方式；第四，承貸機構選擇，先后嘗試了商業(yè)銀行承貸、政策銀行承貸、地方政府選擇等方式。

茵陳四逆湯治療ACLF的主要通路為AGEs-RAGE通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路。研究表明AGE與RAGE結合后可激活NF-κB通路，增加IL-1、IL-6和TNF-α的合成和釋放

，并導致活性氧(ROS)的產生和RAGE自身的上調，ROS導致線粒體的通透性改變，誘導促凋亡因子細胞色素C的釋放，促進下游Caspase-3活化，引起細胞凋亡

。同時線粒體作為TNF啟動死亡信號的靶標，可通過刺激釋放ROS，進一步導致細胞凋亡及壞死的發(fā)生

。研究表明，阻斷RAGE可以改善線粒體損傷，減少AGEs誘導的氧化應激，減輕肝臟的炎癥損傷

。HIF-1主要調節(jié)細胞對缺氧或缺血的主要反應

，低氧可引起線粒體功能障礙。慢性HIF-1激活可導致慢性炎癥，并有導致纖維化、肝細胞死亡或癌癥的風險

。研究發(fā)現ACLF患者肝組織中可見缺氧誘導因子HIF的表達，而在慢性乙型肝炎、肝硬化及正常肝組織中均未見其表達

。輔助性T細胞17(Th17)可分泌IL-17、IL-6和TNF-α等多種效應因子，IL-17 可通過誘導趨化因子和多種促炎細胞因子(如IL-6和TNF-α)來介導炎癥反應

。而PI3K-Akt信號通路在細胞存活和抗凋亡中起重要作用的激活，參與肝臟的保護機制

。由此猜測茵陳四逆湯可能通過抑制AGEs-RAGE通路介導的線粒體損傷來發(fā)揮治療ACLF的作用。

雙臥軸混凝土攪拌機，又稱為圓形槽機，是在七十年代的新型機開發(fā)的，可分為單軸和雙軸攪拌機，這種形式的下跌，迫使兩種攪拌功能，刀片的速度比渦速度較慢，所以耐磨性比渦型低很多。

從本研究結果可以看出茵陳四逆湯治療ACLF是通過多靶點、多通路的復雜過程，單個或多個重要靶點即可對整個網絡進行調節(jié)，其可能是通過抑制炎癥反應、調節(jié)免疫、抗氧化應激途徑而發(fā)揮作用，為臨床運用茵陳四逆湯治療ACLF提供依據，為發(fā)掘茵陳四逆湯的潛在機制提供新方向。但本研究存在一定局限性，未將茵陳四逆湯在煎煮后的化學成分及活性成分在體內的代謝物納入研究。其次，本研究主要是以生物信息學與海量數據計算的結果為基礎，后續(xù)將在此基礎上進一步篩選進行動物或細胞實驗驗證，進而明確茵陳四逆湯的主要調控靶點。

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