中國是全球肝細胞癌(HCC)發(fā)病率最高的國家，年發(fā)病人數占全世界的55%，死亡人數占全世界的45%；最新統(tǒng)計資料顯示，2015年肝癌發(fā)病率占我國腫瘤總發(fā)病率的第4 位、死亡率占第2位

。目前，化療仍是肝癌常用治療方法。不過化療藥物通常毒性大，缺乏肝部位選擇性，給藥后往往出現全身嚴重不良反應。因此，應用低或無毒的中藥活性成分、開發(fā)新的藥物成為肝癌防治的熱點。蛇床子素是中藥蛇床子的主要活性成分。研究表明，蛇床子素具有良好的安全性，并具有抗肝癌、膽管癌、肺癌、前列腺癌等作用

，但其難溶于水、生物利用度低、體內分布廣泛、缺乏肝腫瘤部位選擇性，限制了其臨床應用

。

肝實質細胞等表面高表達去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)，又稱半乳糖受體。該受體能特異地識別半乳糖殘基，當其與半乳糖基結合后，即發(fā)生受體介導的胞吞作用。因此，可將藥物或載體等經半乳糖基修飾制成以ASGPR受體為介導的肝靶向制劑

。丁瑞華等

研究結果表明，半乳糖基修飾的脂質體有更好的肝靶向能力和區(qū)分肝癌細胞與正常細胞的能力。在燕麥、稻草等植物葉綠體膜中含有大量半乳糖基的植物半乳糖脂，其中雙半乳糖基二酰甘油酯(DGDG)是其主要組成成分之一。DGDG與卵磷脂(PC)的幾何結構非常相似，均具有明顯的表面活性。李新剛等

報道雙半乳糖基二酰甘油酯(DGDG)可以制備穩(wěn)定的脂質體和亞微乳液。半乳糖脂可以作為膜材制備納米制劑，同時因其含大量半乳糖基，能與ASGPR受體結合，可以作為肝靶向配體，將省去半乳糖基配體的化學合成制備過程，無疑將大為簡化肝靶向脂質體制備過程，提高肝靶向納米制劑研制效率和成藥性。為此，本研究將蛇床子素制備成蛇床子素半乳糖脂肝靶向脂質體制劑，并研究其體外抗人肝癌HepG-2細胞的作用，為下一步體內研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 原料及試劑 蛇床子素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110822-200409);蛇床子素原料藥(源葉生物，批號T08M8836，質量分數>98%)；燕麥中半乳糖脂參照文獻方法

制備。聚氧乙烯基氫化蓖麻油(上海源葉生物，Y27A8S34920)；1640培養(yǎng)基(北京海克隆生物化學制品有限公司)；四季青無支原體胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；CCK-8試劑盒(Beyotime，批號C0037)；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物，批號KGA1026)；細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物，批號KGA512)。小鼠單抗β-actin(武漢博士德生物工程有限公司，批號BM0627)；兔多抗P53(53KD)(武漢三鷹生物技術有限公司，批號10442-1-AP)。

綜上所述，更昔洛韋聯(lián)合利巴韋林霧化吸入治療可明顯提高小兒皰疹性咽峽炎治療效果，改善患兒臨床癥狀體征，提高血清IgG、IgA、IgM水平。但本研究納入病例數目有限，觀察指標較少，未能全面評價其效果，有待作進一步研究探討。

1.2 主要儀器 Agilent1290 HPLC儀(美國)；Beckman超高速離心機(美國)；HF90細胞培養(yǎng)箱(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)；5424離心機(艾本德中國有限公司)；Cytoflex流式細胞儀(中國貝克曼庫爾特商貿有限公司)；F50酶標儀(上海帝肯貿易有限公司)。

1.3 細胞株 HepG-2細胞株(CL-0103)，購自于武漢普賽爾生物公司，凍存保種。

1.4 蛇床子素植物半乳糖脂肝靶向脂質體的制備 在50℃的水浴上，將燕麥半乳糖脂提取物200 mg、聚氧乙烯基氫化蓖麻油200 mg溶于3 ml無水乙醇中，保溫5 min，加入蛇床子素原料藥10 mg，保溫5 min，然后用5 ml注射器以1 ml/min勻速緩慢地將乙醇液滴入到水浴鍋上另一個含20 ml重蒸水的玻璃杯中，同時開啟攪拌機，轉速250 rpm/min,攪拌15 min后再繼續(xù)水浴放置20 min。取出，室溫放置24 h，200 nm微孔濾膜過濾即得500 μg/ml的蛇床子素植物半乳糖脂肝靶向脂質體,產品4℃冰箱保存?？瞻字|體制備方法同上，不加蛇床子素。

1.6 超高速離心法測定包封率 制備3批脂質體，每批取適量樣品分別密封于3支配套軟管中，設置離心溫度10℃、轉速80 000轉/分，離心2 h；取上清液10 μl于離心管中，再加入190 μl無水乙醇，50℃水浴保溫5 min，即制得離心檢測樣品。取樣品10 μl，用高效液相儀測定離心樣品中蛇床子素含量(A)。另直接取蛇床子素植物半乳糖脂脂質體10 μl于另一離心管中，加入190 μl無水乙醇，50℃水浴5 min，制備脂質體檢測樣品，取10 μl用高效液相色譜儀測定蛇床子素含量(B)。

適量脂質體樣品雙蒸水稀釋，用Nano ZS90納米粒度儀測定脂質體粒徑與電位。

2.1 制備脂質體的形態(tài)及粒徑電位 電鏡觀察脂質體形態(tài)結果見圖1，結果表明脂質體形態(tài)圓整，大小均一。脂質體粒徑為145.9±10.53 nm(

=3)，PdI 0.29±0.14(

=3)；電位為-25.7±0.21mv(

=3)。

1.5 脂質體形態(tài)及粒徑電位 采用透射電鏡觀察脂質體形態(tài)：取少量脂質體液體滴于電鏡配套銅網表面，濾紙吸去多余溶液，再滴入1滴3%磷鎢酸溶液，染色3 min， 吸去多余液體，晾干，透射電鏡觀察。

1.7 CCK-8法檢測HepG-2細胞增殖抑制 取對數期生長的人肝癌HepG-2細胞5×10

/ml，加入96孔板中，每孔100 μl，培養(yǎng)過夜。用1640培養(yǎng)基將藥物倍比稀釋：蛇床子素組濃度為40、20、10、5 μg/ml；蛇床子素脂質體含蛇床子素也為40、20、10、5 μg/ml的脂質體稀釋溶液；空白脂質體為與蛇床子素脂質體相同稀釋倍數的空白脂質體溶液；聚氧乙烯基氫化蓖麻油組稀釋方法同空白脂質體組；正常對照組為不進行任何處理的細胞。吸棄板中的培養(yǎng)基，加入100 μl含藥培養(yǎng)基；每個濃度設5個復孔。分別處理24 h、48 h后，按CCK-8試劑盒要求操作，檢測吸光度值(A)，計算細胞增殖抑制率。

增殖抑制率=1-A

/A

新零售要求店家利用互聯(lián)網和人工智能等新技術，通過線上+線下的雙重引流消費者到店，然后以產品為中心，為客戶提供高用戶體驗和高性價比的購物體驗，并整合運營管理的各個環(huán)節(jié)，創(chuàng)造更大價值，提升運營效率。

而業(yè)務人員的績效工資掛靠于各個市場業(yè)績任務達成，城市經理、區(qū)域經理等管理人員的績效工資掛靠于整體市場業(yè)績任務達成，都沒有考慮到經銷商撤銷等異常情況，導致一旦某個市場經銷商存在空缺，各級人員薪資水平均會受到較大影響，這催促著無論是領導層還是業(yè)務人員，都需要盡快尋找經銷商來進行銷量的補缺。但在較短的時間內，業(yè)務人員勢必無法對當地市場的備選經銷商做出詳細了解和調研，多是走訪幾個經銷商后，就倉促確定。此外，前期調研不充分也導致部分客戶資質剛剛滿足公司要求便設立為經銷商，后期運營乏力，不利于產品在當地市場的拓展。

取對數期生長的人肝癌HepG-2細胞5×10

/ml，接種到6孔板中，每孔1 ml，于37℃、5% CO

條件下培養(yǎng)過夜，移去培養(yǎng)基，PBS洗2次。正常組：加入1640完全培養(yǎng)基；姜黃素組：加入含姜黃素10 μg/ml的1640完全培養(yǎng)基；姜黃素脂質體組：加入姜黃素脂質體10 μg/ml(含姜黃素)的1640完全培養(yǎng)基；空白脂質體組：加入與姜黃素脂質體相同稀釋倍數的空白脂質體；每個樣品平行3孔，分別培養(yǎng)1 h、2 h、4 h；移去培養(yǎng)基，用PBS潤洗2次。用0.25%胰酶(不含EDTA)消化細胞，消化后，1 500 rpm離心5 min，去上清，加PBS重懸；用PBS潤洗2次，1 500 rpm離心5 min；去上清，加500 μl PBS重懸；激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm處，流式細胞儀檢測細胞攝取。

近年來，一些研究表明，索氏的“語言”實際上是科學主義的產物[20-21]。所謂科學主義，是指主張把自然科學的方法應用于人文社會科學在內的一切研究領域的觀點。科學研究往往需要去除各種“雜質”的影響，索緒爾的語言學理論中含有科學主義的因素，他提出的變革方法就是要開展一場“同質化”運動”[22]364。這里我們有必要深究兩個問題：(1)社會科學為什么要去除雜質，開展同質化運動？(2)社會科學是如何去除雜質，達到同質化這一目的的？

目前Ce3+摻雜釔鋁石榴石(Ce3+：YAG)在白光LED領域已經有著廣泛的應用[5]。常用的制備WLED的方法就是利用黃光和藍光混合產生白光，其中藍光由LED藍光芯片產生，黃色的產生則是將Ce3+：YAG熒光粉與膠體的混合物涂在芯片上[6]。目前對于Ce3+離子摻雜材料的應用，主要是基于可見光尤其是藍光波段的激發(fā)照射，使其發(fā)出黃綠色的可見光，利用短波長激發(fā)出長波長光的現象稱為下轉換熒光。而如果能夠利用波長更長的光源去激發(fā)Ce3+的離子的5d-4f躍遷，則可以更加擴展這種材料的應用范圍。

1.9 細胞凋亡檢測 采用Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡 取對數期生長的HepG-2細胞5×10

個/ml，于6孔板中，每孔加2 ml，培養(yǎng)過夜；用1640培養(yǎng)基稀釋藥物：蛇床子素組濃度10 μg/ml；蛇床子素脂質體(換算后含蛇床子素)10 μg/ml；對照組為不加藥處理的正常細胞。以上每個樣品平行3孔，然后按試劑盒說明書操作，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.10 細胞周期檢測 細胞消化后PBS洗2次，離心，沉淀用250 μl PBS重懸，再加入750 μl無水乙醇，4℃固定2 h；3 000 rpm離心5 min，除去上清液，加1 ml PBS重懸，再3 000 rpm離心5 min，收集細胞；吸棄PBS，加500 μl碘化丙啶染色液，37℃孵育30 min；采用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.11 Western Blot檢測p53表達 收集細胞，加入細胞裂解液，裂解30 min；期間每隔10 min重懸細胞一次；采用超聲波裂解細胞5 s后， 12 000 rpm離心15 min，取上清，按照BCA定量試劑盒測樣品蛋白濃度；經電泳，電轉移，免疫印跡顯色，晾干膠片，掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。

色譜條件Agilent1290 HPLC儀；色譜柱：C18柱Cosmosil(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相：甲醇-水(75∶25)；流速：1.0 ml/min；柱溫：25℃；檢測波長：322 nm。檢測后，計算包封率C，公式為C=(B-A)/B。

2 結果

最大功率(PS/rpm) ...............................................75/8500

2.3 細胞攝取實驗結果 1 h時點內，姜黃素組攝取姜黃素與對照組比較沒有明顯差異；2 h和4 h時點，攝取姜黃素則明顯增強(

<0.01)；與對照組比較，姜黃素脂質體的攝取率在1、2和4小時內均明顯增加(

<0.01)；而且，在不同時間點，姜黃素脂質體組細胞攝取量均比游離姜黃素組顯著升高(

<0.01)。見表1。

1.8 人肝癌HepG-2細胞藥物攝取 由于蛇床子素沒有熒光，不能用流式細胞儀檢測細胞吸收狀況。姜黃素溶解特性與蛇床子素相似，而且有熒光，可以用流式細胞儀檢測細胞吸收狀況，因此，選用姜黃素代替蛇床子素進行體外細胞攝取實驗。姜黃素脂質體制備方法同1.4項下方法，只是用10 mg的姜黃素代替蛇床子素。

20世紀90年代末到21世紀初，寬甸縣的年日照時間呈先降低后增長的變化趨勢。年最長日照時間出現在1991年（2 561 h），年最短日照時間出現在1998年（2 069.5 h），兩者相差491.5 h，如圖5所示。

2.2 蛇床子素脂質體包封率結果 蛇床子素HPLC法經方法學考察，在本文測定條件下,各種輔料對蛇床子素的測定無干擾。日內精密度表明峰面積RSD值為1.07%。平均回收率為98.23%, RSD值為1.35%。蛇床子素的峰面積(X)與藥物濃度(Y)的回歸方程為：Y=0.0 257 X-0.6 758,r=0.9 997，線性關系良好。脂質體包封率=93.47±1.34%(

=3)。

2.4 細胞增殖抑制實驗結果 隨蛇床子素、蛇床子素脂質體濃度的增加，細胞增殖抑制效果增強，呈劑量依賴性；48 h與24 h相比，隨時間延長，蛇床子素、蛇床子素脂質體相應濃度組對HepG-2細胞的增殖抑制作用增強(

<0.01)，呈時間相關性；蛇床子素脂質體組較相對應濃度的蛇床子素組，對HepG-2細胞的增殖抑制作用均呈現顯著增強效應(

<0.01)?？瞻字|體在實驗中的高濃度顯示出了一定的腫瘤抑制活性，說明植物半乳糖酯有一定的抑制HepG-2細胞的作用。因聚氧乙烯基氫化蓖麻油作為對照進行實驗時沒有任何抑制作用，表中未列出。見表2。

2.5 細胞凋亡實驗結果 蛇床子素、蛇床子素脂質體對HepG-2細胞的凋亡作用見圖2、表3。與對照組比較，蛇床子素、蛇床子素脂質體組，早期、晚期及總凋亡率均明顯增強(

<0.01)；脂質體組較蛇床子素組早期、晚期及總凋亡率均明顯增強(

<0.01)?？瞻字|體顯示出誘導細胞晚期凋亡的活性，說明植物半乳糖酯有誘導HepG-2細胞晚期凋亡的作用。

2.6 蛇床子素及蛇床子素脂質體對HepG-2細胞周期的影響蛇床子素、蛇床子素脂質體作用HepG-2細胞24 h后，對HepG-2細胞周期的影響見表4、圖3。與對照組比較，蛇床子素、蛇床子素脂質體組對HepG-2細胞G1期占比明顯升高(

<0.01)，G2期占比明顯下降(

<0.01)。與蛇床子素組比較，蛇床子素脂質體組G1期占比升高明顯(

<0.05)。說明蛇床子素、蛇床子素脂質體均具有G1期阻滯作用，蛇床子素脂質體對細胞G1期阻滯作用較蛇床子素更強?？瞻字|體顯示出細胞G1期阻滯作用，說明植物半乳糖脂對HepG-2細胞有G1期阻滯作用。

2.7 p53表達水平 蛇床子素、蛇床子素脂質體對HepG-2細胞的p53表達水平結果如圖4，表5。蛇床子素、蛇床子素脂質體組與對照組比較，p53表達水平均明顯上調(

<0.05,

<0.01)；蛇床子素脂質體較蛇床子素更明顯上調p53的表達(

<0.01)，但空白脂質體對p53表達水平影響不明顯。

4 討論

納米肝靶向給藥系統(tǒng)能將抗肝癌藥物運送到肝腫瘤部位，增加肝腫瘤部位藥物濃度，同時減少藥物對其它臟器的細胞毒性，降低藥物的全身毒副作用。因此，肝靶向研究成為臨床和臨床前藥物研究的核心問題。

有砟軌道床在時速350 km/h的條件下容易發(fā)生道砟飛濺現象，此次“高速鐵路固化道床防飛濺高分子材料涂層”的研發(fā)與應用，通過將防飛濺涂層噴灑至道床表面區(qū)域，促使表面道砟顆粒發(fā)生固化，從而防止列車風荷載作用下發(fā)生道砟飛濺的現象，對保障線路的行車安全具有重要意義。

本研究結果表明，蛇床子素及其脂質體對HepG-2細胞增殖抑制效應呈劑量依賴性和時間依賴性，劑量越大，抑制作用越強；相同藥物濃度下，藥物處理時間越長，細胞增殖抑制效應越強。相同條件下，蛇床子素脂質體對HepG-2細胞增殖抑制較游離蛇床子素作用更強。由于蛇床子素沒有熒光，不能用流式細胞儀直接檢測細胞吸收狀況。對沒有熒光的化合物不能直接進行腫瘤細胞攝取研究時，往往會采用6-香豆素等具有熒光的化合物代替進行

。姜黃素物理特性與蛇床子素相似，而且有熒光，因此實驗中選用姜黃素代替蛇床子素進行游離藥物和脂質體體外細胞攝取比較實驗。結果表明，脂質體在不同時間點的吸收明顯大于游離藥物。文獻報道，細胞攝取是藥物遞送應用的重要參數之一，而且納米制劑的穩(wěn)定性也可以通過細胞攝取來確定

。此外， 腫瘤細胞吸收的藥物越多，靶向腫瘤細胞的作用就越強

。因此，本研究細胞攝取研究結果表明，所制備脂質體具有良好的穩(wěn)定性，也具有良好的肝腫瘤HepG-2細胞靶向性。對HepG-2細胞的凋亡誘導作用結果表明，蛇床子素及其脂質體與對照組比較，早期、晚期及總凋亡率均明顯增強。與游離蛇床子素相比，蛇床子素脂質體處理后，細胞早期、晚期及總凋亡率均明顯增強。細胞周期影響結果表明，蛇床子素組及其脂質體組均具有G1期阻滯作用，但蛇床子素脂質體較蛇床子素G1期阻滯作用更強。肝癌的治療，除了早期手術治療，目前并無其它有效的辦法，因此，尋找新的抗腫瘤分子靶位的研究越來越受到關注。p53是研究最多的抑癌基因之一，其與細胞周期的調控、DNA 修復、細胞分化及細胞凋亡等密切相關

。實驗表明，蛇床子素及其脂質體均能明顯上調p53的表達，而蛇床子脂質體較蛇床子素上調p53作用更強。

以上研究結果提示蛇床子素可能是通過上調 p53 的表達抑制HepG-2細胞的異常增殖和誘導凋亡，從而發(fā)揮抗肝癌的作用。

本文研究表明，將蛇床子素制備成蛇床子素半乳糖脂肝靶向脂質體后，顯著增強了對HepG-2細胞的抑制作用, 也顯示出了良好的人肝癌HepG-2細胞靶向性。實驗結果也表明，半乳糖脂在較高濃度顯示出了一定的抗HepG-2細胞的作用,具有抑制HepG-2細胞的增殖、誘導晚期凋亡、及細胞G1期阻滯等作用。因此，植物半乳糖脂含有半乳糖基，可作為肝靶向配體，其還具有一定的抗人肝癌HepG-2細胞活性，這些特性對采用半乳糖脂作為膜材制備半乳糖脂肝靶向脂質體具有明顯優(yōu)勢。蛇床子素植物半乳糖脂肝靶向脂質體體內抗肝癌作用如何，有待進一步研究。

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