蘭 雪,陳曾妮,周旭美,3,4,韓敏珍,唐富山,3,4

(1.遵義醫(yī)科大學 藥學院臨床藥學教研室，貴州 遵義 563099；2.貴州醫(yī)科大學 第二附屬醫(yī)院藥劑科，貴州 凱里 556000；3.遵義醫(yī)科大學 基礎藥理教育部重點實驗室、特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099；4.遵義市臨床藥學重點實驗室，貴州 遵義 563006)

藥物-藥物、藥物-食物相互作用導致藥物血藥濃度異常波動時，就可能誘發(fā)不良事件的發(fā)生，這不僅與合理用藥的宗旨相違背，甚至可能危及患者的生命安全[1-2]。大部分的藥物相互作用主要發(fā)生在藥物代謝環(huán)節(jié)，而藥物對細胞色素P450(CYP)酶的影響是藥物相互作用最主要和常見的原因。藥物對CYP酶的影響可通過探針藥物法等多種方式進行評價，尋求可用于評估藥物相互作用的探針藥物研究方法至關(guān)重要[3-4]。在CYP酶系中，50%的藥物經(jīng)CYP3A酶代謝，硝苯地平是CYP3A酶的特異性底物，可在人體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化為氧化硝苯地平[5]。以硝苯地平作為探針藥物，通過研究硝苯地平及其代謝物氧化硝苯地平的藥動學可以評估有關(guān)藥物對CYP3A酶活性的影響，從而預測可能的藥物相互作用[6]。雖然已有文獻報道關(guān)于測定硝苯地平及其代謝物氧化硝苯地平血藥濃度的方法，但在血漿樣品處理、取材的方式方法、色譜條件選擇等方面仍有待優(yōu)化。因此，本實驗建立并優(yōu)化了測定大鼠血漿中硝苯地平及其代謝產(chǎn)物氧化硝苯地平的血藥濃度的LC-MS方法，并進行了初步的藥動學研究驗證。

1 材料

1.1 儀器 液相色譜儀購自島津公司(型號：20XR AD)，質(zhì)譜儀購自ABSCIEX公司(型號：API4000 Qtrap)，配置有電噴霧離子源。高速冷凍離心機Thermo Fisher購自德國(型號：D-3570Osterode),純水儀購自瑞飛樂生物科技有限公司(型號：S5PXC0501)。

1.2 藥品與試劑 硝苯地平原料藥(購自廣州優(yōu)瓦儀器有限公司，批號：100338201404，純度：99.0 %)。硝苯地平對照品(購自中國食品藥品檢定研究院，批號：100338，純度：99.9%)。氧化硝苯地平對照品(購自西格瑪集團有限公司，批號：043M3903V，純度：99.5%)。尼群地平對照品(購自中國食品藥品檢定研究院，批號：100585-201104，純度：99.0%)。乙醚、乙酸乙酯、正己烷等試劑為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。流動相甲醇為色譜純，購自國藥集團化學試劑有限公司。水為純水儀自制去離子水。

1.3 實驗動物 健康成年SD大鼠6只，雄性，SPF級，體重(220±20)g，購自重慶第三軍醫(yī)大學實驗動物中心，動物許可證號為SCXK(渝)2017-0005。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.1.1 對照品儲備液 分別精密稱定硝苯地平、氧化硝苯地平、尼群地平對照品，用甲醇溶解后定容，分別配制成質(zhì)量濃度為390.00、90.00、10.00 μg/mL的儲備液，密封于棕色容量瓶中，置于-20 ℃冰箱中保存。用于配制標準曲線的儲備液均由濃度為390.00、90.00、10.00 μg/mL的硝苯地平、氧化硝苯地平、尼群地平溶液逐步稀釋，質(zhì)控樣品(溶液)獨立稱取，配制。

2.1.2 硝苯地平的淀粉漿混懸液的配制 取60 mL蒸餾水水浴加熱至85 ℃，加入檸檬酸0.6 g，攪拌使之溶解，加入可溶性淀粉1.2 g，持續(xù)攪拌，加入硝苯地平原料藥，攪拌均勻，待冷卻，供大鼠灌胃給藥用。

2.1.3 標準曲線所需樣品溶液的配制 取硝苯地平對照品儲備液適量，用甲醇稀釋，配制成硝苯地平質(zhì)量濃度分別為5.27、4.40、3.30、1.65、8.25×10-1、8.25×10-2、8.25×10-3μg/mL的標準曲線樣品。另取一份硝苯地平對照品儲備液適量，用甲醇稀釋配制成濃度為8.25×10-3μg/mL的定量下限(Lower limit of quantitation，LLOQ)樣品。取氧化硝苯地平對照品儲備液適量，用甲醇稀釋，配制成氧化硝苯地平質(zhì)量濃度分別為66.67、33.33、6.67、3.33、6.67×10-1、6.67×10-2、6.67×10-3ng/mL的標準曲線樣品。另取一份氧化硝苯地平對照品儲備液適量，用甲醇稀釋配制成濃度為6.67×10-3ng/mL的LLOQ樣品。

2.1.4 質(zhì)控溶液的配制 取硝苯地平對照品儲備液適量，分別用甲醇稀釋，配制成硝苯地平質(zhì)量濃度分別為4.40、3.30、1.65×10-2μg/mL的QC溶液。取氧化硝苯地平對照品儲備液適量，分別用甲醇稀釋，配制成氧化硝苯地平質(zhì)量濃度分別為46.67、4.67×10-1、2.00×10-2ng/mL的質(zhì)控溶液。

2.2 血漿樣品的處理

2.2.1 對照品樣品處理方法 取空白血漿100 μL，加入硝苯地平對照品溶液25 μL，加入氧化硝苯地平對照品溶液10 μL，加入10.00 μg/mL尼群地平10 μL，1 mol/L氫氧化鈉100 μL，渦旋20 s，加入乙酸乙酯-正己烷(3∶1)混合液1 000 μL，渦旋30 s，5 000 r/min離心5 min，取800 μL上清液，55 ℃水浴氮吹，吹干后用色譜甲醇150 μL復溶，渦旋20 s，14 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液進樣100 μL。

中職學校的晚自習時間，很少能看到學生在教室里學習。其原因很多，除了學生缺乏學習動機、學習習慣未養(yǎng)成外，很可能與其學習風格有關(guān)。在中職生群體中，獨立型學習風格屬于被忽略的學習風格，可見中職生不喜歡獨立、自主的學習方式，而喜歡合作與體驗。

2.2.2 血漿樣品處理方法 取大鼠血漿樣品100 μL，加入10.00 μg/mL尼群地平10 μL、1 mol/L氫氧化鈉100 μL，渦旋20 s，加入乙酸乙酯-正己烷(3∶1)混合液1 000 μL，渦旋30 s，5 000 r/min離心5 min，取800 μL上清液，55 ℃水浴氮吹，吹干后用色譜甲醇150 μL復溶，渦旋20 s，14 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液100 μL進樣。

2.3 分析測定條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱Gemini 3 μm C18 110A(New Column 50×2.0 mm)，保護柱Security Guard Cartridges(GeminiC18 4×2.0 mm ID)，色譜柱與保護柱均購自phenomenex公司。柱溫(40 ℃)，流動相A：甲醇；流動相B：水，采用梯度洗脫，洗脫程序如表1所示，流速(0.6 mL/min)，取1 μL樣品進樣分析。

表1 梯度洗脫條件

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源(ESI)；離子噴射電壓：-5 000 V；溫度：550 ℃；源內(nèi)氣體1(GS1，N2)壓力：55 psi；氣體2(GS2，N2)壓力：55 psi；氣簾氣體(CUR、N2)壓力：40 psi；正離子模式檢測；掃描模式為多重反應監(jiān)測(MRM)；定量離子對等質(zhì)譜條件如表2所示，硝苯地平、氧化硝苯地平、尼群地平對照品質(zhì)譜圖分別如圖1～3所示。

圖1 硝苯地平對照品質(zhì)譜

表2 質(zhì)譜條件

2.4 分析方法驗證

2.4.1 專屬性 分別取6個來源不同的空白血漿100 μL，用等體積的甲醇代替內(nèi)標溶液，按照“血漿樣品處理”項的方法操作，得色譜圖4A，取空白血漿，分別加入QC溶液，按“血漿樣品處理”項方法操作，得色譜圖4B～D，采集一只用藥1 h后的大鼠血漿樣品，按“血漿樣品處理”項操作，得色譜圖4E。圖4所示結(jié)果表明，氧化硝苯地平、硝苯地平和尼群地平的保留時間分別為2.35、2.52和3.02 min?？瞻籽獫{中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾硝苯地平、氧化硝苯地平和內(nèi)標化合物的測定。

圖2 氧化硝苯地平對照品質(zhì)譜

圖3 尼群地平對照品質(zhì)譜

A：空白血漿；B：空白血漿+氧化硝苯地平對照品；C：空白血漿+硝苯地平對照品；D：空白血漿+尼群地平對照品；E：給藥大鼠生物樣品。

2.4.2 線性范圍 按“2.2.1 對照品樣品處理方法”項的方法處理標準曲線樣品。以血漿中分析物的理論濃度為橫坐標，以分析物與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標，用最小二乘法進行回歸運算，求得的直線回歸方程為標準曲線。硝苯地平典型線性方程為：硝苯地平的回歸方程Y=133.58×10-2X+0.08×10-2，R2=0.9 917。氧化硝苯地平典型線性方程為：Y=1.89×10-2X+0.09×10-2，R2=0.999。標準曲線各濃度點的測定濃度和理論濃度的相對誤差(RE)均不超過±15%，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99。結(jié)果表明，標準曲線線性良好，測定血漿中硝苯地平的線性范圍為8.25 ng/mL～5.27 μg/mL。氧化硝苯地平的線性范圍為6.67 pg/mL～66.67 ng/mL。

2.4.3 定量下限 按“2.2.1 對照品樣品處理方法”項方法處理LLOQ樣品，每個分析批共6個樣品，連續(xù)3個分析批。分別根據(jù)同批標準曲線計算LLOQ樣品的濃度，并計算其RE、批內(nèi)相對標準偏差(RSD)、批間RSD，結(jié)果見表3、表4。所有LLOQ樣品所測定的濃度與理論濃度的RE在±20%之內(nèi)，且批內(nèi)、批間RSD不超過20%[7]。結(jié)果表明，本法測定血漿中硝苯地平的定量下限為8.25 ng/mL，氧化硝苯地平的定量下限為6.67 pg/mL。

表3 硝苯地平精密度與準確度結(jié)果

表4 氧化硝苯地平精密度與準確度結(jié)果

2.4.5 提取回收率 按“2.2.1 對照品樣品處理方法”項方法處理低、中、高3個濃度的QC血漿樣品，每個濃度6個樣品，進樣所得峰面積分別除以空白血漿經(jīng)處理后再加入低、中、高6個濃度的QC溶液及內(nèi)標溶液后進樣所得峰面積，即為血漿中硝苯地平和氧化硝苯地平的提取回收率。硝苯地平在低、中、高3個濃度血漿樣品中的提取回收率分別為(103.22±10.71)%、(105.84±8.24)%、(104.34±5.72)%，硝苯地平的相對回收率在103.22%～105.84%。氧化硝苯地平在低、中、高3個濃度血漿樣品中的提取回收率分別為(91.00±3.41)%、(101.27±9.31)%、(100.95±4.10)%，硝苯地平的相對回收率在103.22%～105.84%。

2.4.6 基質(zhì)效應 按“2.2.1 對照品樣品處理方法”項處理6個不同來源的空白血漿，分別加入低、中、高3個濃度的QC溶液及內(nèi)標溶液，每個濃度有6個樣品，進樣所得峰面積記為A。以相應濃度的QC溶液及內(nèi)標溶液直接進樣所得峰面積記為B。以不同來源樣品的面積A除以相應濃度面積B的平均值，即為血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對硝苯地平、氧化硝苯地平和內(nèi)標尼群地平的基質(zhì)效應因子(Matrix factor，MF)。以硝苯地平、氧化硝苯地平與尼群地平MF的比值計算內(nèi)標歸一化基質(zhì)效應因子，同時以多個樣品獲得的內(nèi)標歸一化基質(zhì)效應因子計算變異系數(shù)RSD。結(jié)果見表5，不同濃度測定結(jié)果的RSD均不超過15%，表明本方法可以忽略基質(zhì)對于樣品測定結(jié)果的影響[7]。

表5 硝苯地平及氧化硝苯地平基質(zhì)效應結(jié)果

2.4.7 穩(wěn)定性 取硝苯地平23.75 μg/mL、89.06 ng/mL質(zhì)量濃度的QC樣品，每個濃度3個樣品。氧化硝苯地平630.00、0.27 ng/mL質(zhì)量濃度的QC樣品，每個濃度有3個樣品。分別考察含藥血漿室溫放置6 h，進樣器下放置8 h，-80 ℃反復凍融3次，-80 ℃放置10 d的穩(wěn)定性。結(jié)果如表6、表7所示。

表6 硝苯地平樣品穩(wěn)定性結(jié)果

2.5 藥動學研究應用

2.5.1 動物試驗方案 將6只大鼠禁食不禁水12 h，次日灌胃給予硝苯地平的淀粉漿混懸液(給藥劑量為25 mg/kg)，分別于給藥后0.17、0.5、1、2、4、6、8、10、14、24、28、32、36 h于眼底靜脈叢取血0.3 mL，置于肝素涂壁的1.5 mL離心管中，3 500 r/min離心5 min，取上清液(血漿)于另一個離心管中，存放于-80 ℃保存。

2.5.2 未知樣品測定 按“血漿樣品的處理”項方法處理未知血漿樣品，每個分析批均隨行一條標準曲線，均勻分布QC樣品。各分析批標準曲線中各濃度點和所有隨行的QC樣品的測定濃度與理論濃度之間的RE均在±15%之內(nèi)，并且直線回歸方程的相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99。

2.5.3 藥動學參數(shù)計算及血藥濃度時間曲線 經(jīng)bapp 2.0軟件計算，藥動學參數(shù)見表8。6只大鼠分別灌胃給予硝苯地平及代謝產(chǎn)物氧化硝苯地平的平均濃度時間-曲線見圖5、6。

表8 藥動學參數(shù)結(jié)果

圖5 硝苯地平平均血藥濃度-時間曲線

圖6 氧化硝苯地平平均血藥濃度—時間曲線

3 討論

文獻報道[8-11]，硝苯地平血漿樣品可通過加入乙腈、甲醇、乙醚、二氯甲烷-正己烷(3∶7)、乙酸乙酯等進行前處理。由于生物樣品的血藥濃度較低，內(nèi)源性物質(zhì)易殘留，使用沉淀蛋白的方法不僅升高基質(zhì)效應，還會縮短色譜柱的壽命[12]。本文通過按不同配比乙醚、乙酸乙酯、正己烷液液萃取法進行血漿樣品前處理，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯-正己烷(3∶1)時，提取回收率高，對主峰無干擾，血漿雜質(zhì)少，重現(xiàn)性好。因此，本實驗選擇了乙酸乙酯-正己烷(3∶1)進行液液萃取來提取目標物質(zhì)。通過液液萃取的方法，使檢測下限進一步降低，提高了檢測方法對生物樣品的定量的適用性和精確性。另外由于目標物為弱堿性[13-14]，故在液液萃取前堿化血樣，使藥物較多以非解離型存在，可增大提取物在有機相中的溶解度，從而提高回收率。由于生物樣品中內(nèi)源性物質(zhì)較多，故采用梯度洗脫的方法，通過梯度變換流動相(甲醇-水)的比例，保證在每次進樣過程中，均可實現(xiàn)高比例水相和有機相的洗脫，從而改善峰型，減少拖尾，延長色譜柱壽命[15]。同時，在色譜柱前連接保護柱，可提高柱效，使測定結(jié)果更加穩(wěn)定、準確。

本實驗通過對大鼠不同時間點取血進行藥物代謝動力學檢測，對比發(fā)現(xiàn)，眼眶取血法比心臟取血法在本實驗中更具優(yōu)勢。心臟取血時，使用水合氯醛對大鼠進行麻醉，試驗中存在弊端，如：大鼠需要5～10 min才能進入麻醉狀態(tài)，在未麻醉狀態(tài)下取血困難，容易錯過最佳取血時間；麻醉劑量不易掌握，致死率較高；大鼠在麻醉后約0.5～1 h 蘇醒，嚴重影響大鼠的正常生理狀態(tài)，從而影響藥物代謝，難以獲得準確、完整實驗數(shù)據(jù)。因此本實驗采取眼眶取血法，取血前用乙醚進行麻醉，麻醉時間快，方法簡單，容易操作。用毛細管取血完成后，大鼠立即醒來，恢復正常活動、飲水、飲食，且死亡率低，并且能夠準確掌控取血時間點，有利于獲取完整、準確的血藥濃度數(shù)據(jù)。

文獻報道了CYP3A酶系是重要的藥物代謝酶，通過測定硝苯地平及其代謝產(chǎn)物氧化硝苯地平的血藥濃度，預測可能的藥物-藥物、藥物-食物相互作用[16-18]。本文建立的測定大鼠血漿中硝苯地平及氧化硝苯地平血藥濃度的LC-MS方法具有專屬性強，靈敏度高，分析速度快的特點，可用于硝苯地平大鼠藥物代謝動力學研究。相對于其他研究[19-21]，硝苯地平的定量下限進一步降低，可滿足生物樣本中血藥濃度測定的要求。同時，本研究建立了硝苯地平代謝產(chǎn)物氧化硝苯地平的血藥濃度測定方法，可更好地適應以硝苯地平為探針研究藥物對肝藥酶活性影響及藥物相互作用研究的需要。