李 丁，陳豪特，楊小琴，王 忠，甘 辛

(1.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院 泌尿外科，北京 100091；2.國家食品安全風險評估中心，衛(wèi)生部食品安全風險評估重點實驗室，北京 100021)

研究顯示所有到院就醫(yī)的感染類疾病中，泌尿道感染占比較高，感染率高達20%～30%，并于全年齡段和性別可見，在為患者帶來嚴重的軀體癥狀的同時也極大的增加了疾病治療的經(jīng)濟成本[1-2]。除社區(qū)感染外，泌尿道感染作為最常見的院內(nèi)感染之一也是僅次于呼吸道感染的第二大院內(nèi)感染，受到世界各國廣泛關注[3]。美國每年僅兒童泌尿道感染的治療就需要醫(yī)保系統(tǒng)投入1.8億美元的費用，同時每年還需要約150萬名臨床醫(yī)生參與診治[4]。留置導尿管是臨床解決排尿困難的有效技術手段，值得注意的是泌尿道感染與醫(yī)療機構(gòu)使用導尿管密切相關，原因包括無菌操作不當、插管過程中損傷尿道粘膜、留置時尿道口未消毒或消毒不嚴格等。留置導尿管為細菌侵入人體增設了通道，一旦其表面出現(xiàn)細菌定植并生成生物膜將進一步增加患者感染的風險，報道顯示我國因?qū)蚬芤l(fā)的患者泌尿道感染率可達6.68%～23.5%[5-6]。

本研究以16S rRNA測序為手段，該方法通過PCR擴增樣品中16S rRNA片段后對其中的細菌進行目、屬、種水平的鑒定，具有讀長高、精度高、通量高以及無偏性等優(yōu)勢，作為一種成熟可靠的方法被廣泛應用于菌種鑒定和微生物群落多樣性的研究[7]。相較于微生物傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法，該方法不受培養(yǎng)方法的制約，可以更好的發(fā)現(xiàn)樣本中的罕見細菌、難以培養(yǎng)以及不具有典型特征形態(tài)和生化反應的細菌。通過檢測38例北京市西苑醫(yī)院2020年11～12月份間收治的臨床患者短期和長期留置的導尿管微生物群落構(gòu)成，旨在研究導尿管留置可能給患者造成的感染風險，并為下一步指導臨床干預提供可靠的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 本研究以北京市中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院泌尿外科2020年11～12月收治的38例導尿管留置患者為對象開展，并對患者臨床資料進行回顧性分析。38例患者中，男性31例，女性7例，年齡64～99歲，平均年齡為(82.1±7.2)歲，導尿管平均留置時間為(25.50±9.66)d。所有入組病例均排除2周內(nèi)抗生素、激素及免疫抑制劑等可能對細菌感染存在較大影響的藥物應用史。37例患有因前列腺增生或神經(jīng)源性膀胱等造成的尿潴留，占全部病例的97.4%。其中20例留管過程中有過抗生素、中藥等在內(nèi)的藥物干預，占52.6%，其中八寶丹、癃清片、臨床中藥飲片、頭孢西丁、頭孢他啶、哌拉西林鈉他唑巴坦為主要干預用藥。樣品留置時間7～41 d，以14、21、28、35 d為分組節(jié)點(見表1)，每組樣品數(shù)分別為S1(6)，S2(5)，S3(7)，S4(15)，S5(5)。導尿管為一次性使用無菌導尿包-“抗菌超滑行型”(山東百多安醫(yī)療器械有限公司)注冊證號：魯食藥監(jiān)械(準)字2014第2660506號。

表1 38份樣本信息統(tǒng)計

1.2 樣本采集 取樣前先對患者尿道口進行消毒，戴無菌手套取出導尿管，用經(jīng)滅菌處理的剪刀截取導尿管留置于患者體內(nèi)部分即尿管自遠端至水囊部分，放置于(5×5)cm無菌規(guī)格板上。使用滅菌醫(yī)用棉簽拭子于尿管尖端外周表面不同部位緊貼尿管表面擦拭不少于5次，將拭子尖端折斷并置于含有保存液的滅菌Corning管中保存。

1.3 文庫構(gòu)建和測序 DNA提取采用Qiagen微生物DNA純化試劑盒(NO:50214)。16s rRNA測序采用V4+V5特異性引物515FB：5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′，926R:5′-CCGYCAATTYMTTTRAGTTT-3′。PCR條件為預變性95℃，180 s，變性98℃，20 s，退火55℃，15 s，延伸72℃，15 s，循環(huán)25次，終延伸72℃，60 s，反應體系為KAPA 熱啟動高保真酶(NO:KK2602)50 μL體系。獲得的PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA無降解后切膠回收，膠回收條件依照Omega D2500-02膠回收試劑盒。文庫經(jīng)AglientBioanalyzer和Qubit檢測定量合格后上機測序。測序平臺選擇Hiseq 2500，由北京博奧匯玖生物科技有限公司采用PE250模式進行，對樣本16s rRNA基因 V4-V5區(qū)進行測序分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析 序列下機后經(jīng)skewer軟件進行數(shù)據(jù)過濾，并使用FLASH軟件對paired-end reads進行拼接[8-9]。拼接后的序列經(jīng)CD-HIT生成OTU并進行OTUs的聚類分析，在OTUs聚類的基礎上使用SILVA數(shù)據(jù)庫對每個OTU的代表序列進行物種注釋，從而獲得樣本的物種注釋信息及基于物種的豐度分布情況[10-11]。對OTUs同時進行Alpha多樣性、豐度等在內(nèi)的相關分析，獲取樣品內(nèi)物種豐富度、均勻度信息和不同樣品間OUTs的共性和特性信息等。此外，對OTUs進行多序列比較構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，基于進化樹信息和豐度信息進行Beta多樣性分析，獲得不同樣品和分組的群落構(gòu)成差異的信息，以PCA、NMDS和PCoA及距離矩陣熱圖等方式進行展示。

2 結(jié)果

2.1 DNA提取和文庫構(gòu)建及序列檢測 樣品經(jīng)提取后DNA總含量經(jīng)Qubit雙鏈試劑盒定量在57～3 850 ng，說明不同樣品的微生物總量有較大差異。1%瓊脂糖電泳進行快速檢測，結(jié)果顯示DNA 無降解。擴增后產(chǎn)物使用Qubit進行建庫前DNA 濃度測定，前一步得到的DNA 濃度的Qubit測定值最低為3.34 ng/μL，使用55.5 μL 體系建庫計算，有0.185 μg 總量，滿足最低0.1 μg 的建庫需求。文庫構(gòu)建后經(jīng)AglientBioanalyzer2100進行檢測，其中樣品的主峰長度574 bp/573 bp/576 bp，除去126 bp 的接頭序列和24 bp 的分子標記序列后，剩余期望長度為424 bp/423 bp/426 bp，與16S rRNA基因V4～V5區(qū)的期望長度412 bp 接近，考慮到GC 含量等因素的影響以及毛細管電泳本身的誤差，可以認為所擴增片段的長度與期望值基本相符。

2.2序列檢測 樣品混合后定量至12pm進行上機測序。根據(jù)樣品提取有效測序，序列中含有特異性擴增引物序列，長度大于可供分析標準的序列稱為有效序列。共獲得1 609 398條序列，其中有效序列1 603 007條，說明整體測序質(zhì)量優(yōu)良。單個樣品平均總序列42 353條，平均有效序列42 184條，平均有效率達到99.61%。最少樣品有效序列有35 390條，最多樣品有44 991條，說明樣品均一度較好。

本研究樣品的目標區(qū)域16S rRNA基因V4～V5區(qū)的平均期望長度為412 bp。雙端測序正反向讀取的序列總長為500 bp，扣除分子標記24 bp，共有476 bp。有效序列長度在382 bp至442 bp之間。測序所得序列中占比最多的5種長度及其百分比分別為：412(50.44%)，413(24.46%)，411(8.35%)，414(6.13%)，408(5.59%)，其余長度占比為5.03%，與期望占比長度相符。

2.3 OTU序列聚類分析 根據(jù)序列相似性，按97%的相似度，與Silva v132數(shù)據(jù)庫進行比對，將序列歸為多個 OTU(操作分類單元)進行分析，共得到11 350個OTUs和1，668，076個優(yōu)質(zhì)序列。

2.4 Alpha多樣性分析 當序列達到2 000左右時香濃曲線進入拐點達到平臺期(見圖1)，表明本次測序已經(jīng)覆蓋樣品物種序列，測序量飽和能夠展現(xiàn)樣本細菌的多樣性和分布，即使增加深度也不會對樣品多樣性產(chǎn)生影響。相較于腸道細菌、皮膚細菌、土壤細菌等自然測序群體，本實驗樣品多樣性達到飽和所需序列較少，說明導尿管為相對封閉環(huán)境，微生物群落具有特定性。Rank Abundance曲線在水平方向上有較大跨度，垂直方向也具有分離，說明樣本具有多樣性。

圖1 38份樣品香濃曲線

2.5 物種注釋分析 利用SILVA數(shù)據(jù)庫對16s rRNA基因測序數(shù)據(jù)分別在界、門、綱、目、科、屬、種進行注釋根據(jù)樣本中包含的各水平物種間的距離進行水平物種聚類分析(見圖2)。16s rRNA測序結(jié)果顯示，以S1-S5時間段分組，各組樣品中革蘭氏陰性菌所占比例均高于陽性菌。在門水平上，各樣品的優(yōu)勢菌分布隨時間變化具有規(guī)律性。以28 d為分界點，梭桿菌門(Fusobacteria)豐度上升，28 d以上樣本以35 d為分界可發(fā)現(xiàn)厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)豐度發(fā)生規(guī)律性變化。28 d內(nèi)以14 d為分界點可發(fā)現(xiàn)梭桿菌門隨時間增長比例上升，其中14～21 d組合21～28 d組在熱脫球菌(Deinococcus-Thermus)豐度上具有數(shù)值差異。樣本中α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)豐度短期(7～14 d)高于中長期留置患者(見圖3)。其中36個樣品存在含量>50%的優(yōu)勢菌門，占全部樣品的86.8%，其中19個樣品優(yōu)勢菌門為變形菌門，含量63%～100%，占52.8%(19/36)，12個樣品優(yōu)勢菌門為厚壁菌門，含量54%～100%，占33.3%(12/33)，3個樣品優(yōu)勢菌門為放線菌門，含量67%～81%，占8.3%(3/36)，2個樣品優(yōu)勢菌門為梭桿菌門，含量53%～78%，占5.6%(2/36)。S1-S5各時間段分組顯示，S1中變形菌門占62.3%，厚壁菌門占33.8%；S2中變形菌門占46.7%，厚壁菌門占36.3%；S3中變形菌門占46.6%，厚壁菌門占34.2%；S4中變形菌門占42.0%，厚壁菌門占34.0%；S5中變形菌門占73.5%，厚壁菌門占16.0%(見圖4)。樣品測序結(jié)果中包含5種常見的院內(nèi)感染細菌，其中腸球菌是主要檢出菌，陽性率為68.4%，大腸埃希菌陽性率為47.4%，銅綠假單胞菌陽性率為39.5%，金黃色葡萄球菌陽性率為21.1%，肺炎克雷伯菌陽性率為2.6%。5個樣品腸球菌占比>53%，其中3個樣品腸球菌占比>96.0%，留管時間除1例為7 d外其余均≥28 d，5例患者中3例患者服用癃清片2例未使用藥物干預。另有3個樣品銅綠假單胞菌占比>73.7%，留管時間≥21 d，其中2例服用頭孢西丁或哌拉西林1例患者未使用藥物干預。

圖2 導尿管留置時間與微生物群落聚類分析

圖3 38份樣品中α-變形菌綱分布信息

圖4 38份樣品微生物群落結(jié)構(gòu)

2.6 分組分析 Anosim，PCA，PCoA，NMDS，MRPP和Turkey分析均為檢測到組間顯著差異。但是針對各組和菌群的LEfSe檢測發(fā)現(xiàn)，組1與孿生球菌屬(Gemella)，擬甲色球藻屬(Chroococcidiopsis)，寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)有較高關聯(lián)(LDA Score log10>2)，組2與乳球菌屬(Lactococcus)，組5與微單胞菌屬(Parvimonas)有較高關聯(lián)。

3 討論

導尿管是引發(fā)下尿路感染臨床病例的重要因素之一，病情加重時還可以誘發(fā)上尿路感染繼而發(fā)生慢性腎功能衰竭、繼發(fā)性高血壓等嚴重并發(fā)癥，近年來如何控制導尿管引發(fā)的泌尿系感染已成為臨床關注的重點。目前尚未見國內(nèi)外應用16s rRNA高通量測序方法展示患者導尿管表面病原微生物菌群多樣性及分布特點的其他相關報道。該方法由于不受培養(yǎng)方法的制約，可以更加深入全面的發(fā)掘患者潛在的感染風險，為今后指導臨床抗感染治療提供了詳實可靠的數(shù)據(jù)。

留置尿管是一個相對較為封閉的環(huán)境，這在宏基因組研究中是較為特殊的。根據(jù)本研究Alpha多樣性結(jié)果分析顯示，當序列條數(shù)達到2 000左右時上升曲線便出現(xiàn)拐點并進入平臺期，表明檢測在較小的通量時就達到飽和，這相對于腸道、土壤等半開放環(huán)境都是差異較大的。本研究探索的檢測通量也有助于未來相似研究確定通量范圍、降低檢測成本、開發(fā)檢測工具。超高的通量也保證了本研究測序深度和廣度較為全面的覆蓋了樣本的所有物種，檢測也比較均勻。

本研究檢測的38例樣品中包含了包括腸球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌在內(nèi)的臨床上常見的5種院內(nèi)感染細菌，其中腸球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌污染率≥21.1%，表明留置尿管微環(huán)境對于感染風險有影響。這與陸金金等報道的2012—2015年尿路感染病原菌主要為大腸埃希菌(37.1%),糞腸球菌(19.9%),銅綠假單胞菌(8.0%),肺炎克雷伯菌(7.5%),白色念珠菌(5.2%)及顏復生等2009年報道的647株尿路感染分離株主要為大腸埃希菌(40.8%)、念珠菌屬(28.2%)、腸球菌屬(7.9%)、鏈球菌屬(4.9%)、克雷伯菌屬(3.6%)結(jié)果相似[12-13]。38份樣品中68.4%存在腸球菌，其中3份長期留置的樣品中該菌占比>96%。腸球菌廣泛分布于自然環(huán)境中，可寄居于人和動物的腸道內(nèi)，是引起院內(nèi)感染的重要條件致病菌，能引起尿路感染、腦膜炎、心內(nèi)膜炎和膿毒血癥等在內(nèi)的多種感染性疾病。其發(fā)病率近年來呈現(xiàn)上升趨勢。研究表明，院感腸球菌具有耐藥率高，存在多重耐藥等特點，可能成為耐藥基因的儲存庫，因其固有抗生素耐藥性及其迅速獲得額外抗生素耐藥性的能力使感染很難治療，特別是萬古霉素耐藥菌的出現(xiàn)，構(gòu)成了重大的感染控制負擔[14-15]。銅綠假單胞菌也是臨床最常見病原菌之一，本研究中39.5%的樣品存在該菌，其中3份長期留管樣品中含量>73.7%，該菌本身攜帶染色體介導的AmpC β-內(nèi)酰胺酶，可對氨芐西林、阿莫西林、氨芐西林-舒巴坦、阿莫西林-克拉維酸、頭孢噻肟和頭孢曲松產(chǎn)生天然耐藥，同時其外排泵機制可將β-內(nèi)酰胺類、氯霉素、復方新諾明、四環(huán)素類及替加環(huán)素等泵出胞外，從而產(chǎn)生耐藥，該菌多重耐藥發(fā)生率較高[16]。目前大量研究顯示，腸球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌均可以攜帶可傳遞的耐藥質(zhì)粒，一旦發(fā)生質(zhì)粒傳遞導致的多重耐藥將進一步加重病人的負擔和臨床治療的難度，也對其他住院病人的健康產(chǎn)生極大威脅[17]。8例單一細菌占比超過53%的病例中，5人口服中藥或抗生素藥物干預，3例未服用任何藥物未見差別(P>0.05)，結(jié)果顯示口服藥物干預與導尿管菌落構(gòu)成高度單一沒有相關性，可能與藥物在取樣位置難以達到抑菌所需濃度有關。目前研究也指出生物膜與尿路感染具有密切關系，細菌通過多糖蛋白復合物將細菌包裹其中附著在病灶或?qū)Ч鼙砻鎇18]。本研究檢出的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等細菌均具有形成生物膜的能力，長期留置導尿管的患者因為尿道缺少尿液盥洗作用，導致細菌容易黏附在導尿管和尿路上皮形成生物膜，而生物膜可以增強細菌耐藥性和逃避宿主免疫，常規(guī)消毒劑也難以徹底清除生物膜，從而引發(fā)持續(xù)性的感染。

留置尿管封閉環(huán)境的16s rRNA檢測顯示出與開放環(huán)境不一樣的規(guī)律。從個體層面來看個體間差異較大，極端個體較多，在分組層面上，極端個體的出現(xiàn)使得統(tǒng)計上分組特征規(guī)律有限。在門水平上，高于85%的樣品出現(xiàn)主導門超過50%的情況，多個樣品在屬甚至種水平上優(yōu)勢菌超過90%，說明這一現(xiàn)象不是偶然的。這表明在無菌封閉環(huán)境，優(yōu)先定殖菌可獲得巨大的生態(tài)優(yōu)勢，從而導致極端占比的頻繁出現(xiàn)。優(yōu)勢定殖菌具有一定的規(guī)律范圍，但就具體菌種的定殖有一定的隨機性，可能與病人的身體狀況、飲食、用藥具有關聯(lián)。通過對全部樣品的聚類研究發(fā)現(xiàn)，樣品菌群變化規(guī)律總體上與留管時間相關。長留置時間與高度單一菌群結(jié)構(gòu)有伴隨性出現(xiàn)，同時某些短期留置含量較低的細菌隨著時間逐漸升高，說明長時間單一環(huán)境對部分菌群具有篩選并易導致感染風險。本研究結(jié)果顯示，需要進一步增加對尿管留置病人的病例研究，特別是對需較長時間留置尿管病患尿管更換周期的研究應納上日程，同時通過大量樣本收集和數(shù)據(jù)分析對留置尿管中的優(yōu)勢菌種進行識別和檢測，為尿管留置導致感染的早期治療和針對性治療提供詳實可靠的數(shù)據(jù)支持。