王紹良，張雯宇，高志民，周明兵，楊克彬，宋新章

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實驗室，浙江 杭州 311300；2. 國際竹藤中心 竹藤資源基因科學(xué)與基因產(chǎn)業(yè)化研究所 國家林業(yè)和草原局竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)開放實驗室，北京 100102）

磷(phosphorus，P)是植物中脂質(zhì)、核酸、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)和糖類的重要組成元素，是含量僅次于氮的第二大限制性養(yǎng)分[1]，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著不可替代的作用。植物吸收磷素主要以可溶性的磷酸根離子形式為主[2]，雖然土壤中磷素含量很高，但是可供利用的無機(jī)磷素含量較少，是導(dǎo)致植物缺磷的主要原因之一[3]。植物磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(phosphate transporter，PHT)是植物從土壤中吸收無機(jī)磷酸鹽并在體內(nèi)進(jìn)行再分配利用的載體。磷吸收動力學(xué)研究表明：植物在進(jìn)化過程中形成了2類不同的磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[4]，分別為高親和力磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(highaffinity P uptake system)和低親和力磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng) (low-affinity P uptake system)[5]。研究者最早在擬南芥Arabidopsis thaliana中克隆出了磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtPHT1.1，隨后通過基因組測序、同源序列分析等方法陸續(xù)在大豆Glycine max[6]、玉米Zea mays[7]、大麥Triticum aestivum[8]和番茄Lycopersicon esculentum[9]等植物中克隆出了磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。植物磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬于MFS超級家族(major facilitator superfamily)[10]，有12個疏水的跨膜區(qū)域，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)高度相似，在氨基酸序列中存在保守特征序列GGDYPLSATIMSE，以及保守的磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)。磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為4個亞家族，分別為PHTⅠ、PHTⅡ、PHTⅢ、PHTⅣ[11]。擬南芥中，AtPHT1.1、AtPHT1.2和AtPHT1.3對擬南芥吸收磷的貢獻(xiàn)非常大，而且AtPHT1.1在長距離運(yùn)轉(zhuǎn)磷的過程中具有重要作用[12]。研究表明：高磷環(huán)境中OsPHT1是水稻Oryza sativa吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)磷素的關(guān)鍵PHTⅠ成員[13]。缺磷顯著誘導(dǎo)OsPHT2、OsPHT4、OsPHT8、OsPHT9 和OsPHT10等的表達(dá)。OsPHT8幾乎在水稻的各個器官中都強(qiáng)烈表達(dá)，是組成型磷轉(zhuǎn)運(yùn)子；OsPHT8下調(diào)會使新葉磷含量下降，老葉磷含量上升，處于灌漿期的胚乳和胚中的磷含量顯著下降，說明水稻OsPHT8對磷素從源到庫的再分配起到至關(guān)重要的作用[14]。大豆中，GmPHT7在根際成熟叢枝菌Arbuscular mycorrhiza(AM)根的根冠小柱細(xì)胞、皮層細(xì)胞和無菌根的側(cè)根原基細(xì)胞中表達(dá)，在衰老葉片的維管束末端少數(shù)管胞中也有表達(dá)，主要負(fù)責(zé)向種子轉(zhuǎn)運(yùn)再活化的磷素[15]。此外，GmPHT10和GmPHT11也會受AM誘導(dǎo)表達(dá)[16]，即磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因廣泛存在于各種植物中。

毛竹Phyllostachys edulis屬于禾本科Gramineae剛竹屬Phyllostachys，具有經(jīng)濟(jì)價值高、用途廣泛、栽培面積大等特點(diǎn)[17]。影響毛竹生長發(fā)育的因素有很多，如林地養(yǎng)分、水分不足[18]，粗放的撫育管理和病蟲害防治不及時等[19]，其中，磷元素是限制毛竹林生長的重要營養(yǎng)元素之一。因此，研究毛竹磷素轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收的相關(guān)基因的表達(dá)具有重要意義[20]。由于土壤對磷素的化學(xué)固定作用，磷素利用率普遍較低[21]。磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是植物吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)磷素的重要參與者。本研究利用生物信息學(xué)方法鑒定毛竹PHTⅠ家族成員，分析其基因啟動子、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、氨基酸保守基序、基因在染色體的位置以及基因的組織表達(dá)特異性等，以期為深入研究毛竹PHT基因功能，探索毛竹磷素利用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 毛竹 PHTⅠ家族序列的獲取和確定

擬南芥和水稻PHT基因的CDS序列、基因序列以及氨基酸序列分別下載于Tair (https://www.arabidopsis.org)和 Rice Genome Annotation Project (http://rice.plantbiology.mus.edu)。在毛竹基因組數(shù)據(jù)庫Bamboo GDB (http://bamboo.bamboogdb.org/)進(jìn)行 BlastP、BlastN (e-value=1e-10) 比對，獲取毛竹 PHTⅠ同源基因的候選序列。通過SMART數(shù)據(jù)庫(http://smart.embl-heidelberg.de)和PFAM數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org)確定獲取的候選序列的保守結(jié)構(gòu)域的準(zhǔn)確性和完整性，保留具有編碼完整保守結(jié)構(gòu)域的候選序列，并進(jìn)行基因命名(PePHTs)。

1.2 毛竹 PHTⅠ的生物信息學(xué)分析

利用ProtParam (http://web.expasy.org/prot-param/)獲取毛竹PHTⅠ基因編碼蛋白質(zhì)的基本理化特性，使用 Gene Structure Display Server 2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在線工具分析 PePHTs 的基因結(jié)構(gòu)，通過MEME Version 5.3.2 (http://meme-suite.org/tools/meme)獲取毛竹PHTⅠ的保守基序，利用 PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線分析平臺對PePHTs所含作用元件進(jìn)行分析，在Excel軟件中整理Tab結(jié)果文件， 用TBtools軟件的Basic BioSequence View工具展示順式作用元件的分布[22]，使用Plant-mPLoc算法(http://www.csbio.sjtu.edu.cn)預(yù)測毛竹PHTⅠ的亞細(xì)胞位置。

1.3 毛竹 PHT Ⅰ基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用Clustal X 1.8軟件對毛竹、擬南芥、水稻等PHT基因的CDS序列進(jìn)行多重比對，比對結(jié)果在MEGA 7.0軟件中使用鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap試驗重復(fù)1 000次[23]，其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。利用在線工具Evolview (https://www.evolgenius.info/evolview/)進(jìn)行樹圖編輯[24]。

1.4 毛竹PHTⅠ基因的染色體分布及適應(yīng)性進(jìn)化分析

利用在線軟件 MEME Version 5.3.2 (http://meme-suite.org/tools/meme)對毛竹 PHTⅠ的 motif進(jìn)行預(yù)測和分析，motif數(shù)量設(shè)置為 10。使用 TBtools軟件的 Gene Location Visualize from GTF/GFF 工具展示基因在染色體上的位置。使用KaKs_Calculator軟件計算毛竹PHTⅠ基因的CDS序列的選擇壓力值(ω)[25]。

1.5 毛竹 PHTⅠ基因組織表達(dá)特異性分析

根據(jù)毛竹和竹筍不同 組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[26]，用 PePHTs 的 RPKM (reads per kilo-bases per million reads)值表示基因的表達(dá)豐度，利用TBtools制作熱圖展示基因的表達(dá)豐度。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛竹PHTⅠ家族基因鑒定及基本理化特征

通過比對分析毛竹基因組，鑒定并確定編碼完整MFs_1的候選基因共20個。植物PHT一般都含有MFs_1保守結(jié)構(gòu)域，候選基因編碼的蛋白質(zhì)都含有保守的跨膜結(jié)構(gòu)域，與MFS超家族的PHT家族特征相同。根據(jù)PHT候選基因在毛竹Scaffold中的位置以及同源基因的名稱依次命名為：PePHT1～PePHT20。

對20個PHTⅠ家族基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，其理化性質(zhì)結(jié)果(表1)顯示：PePHTs編碼的氨基酸序列長度，最長為696 個氨基酸 (PePHT1)，最短為432 個氨基酸(PePHT17)，理論等電點(diǎn)為6.84～9.30，除PePHT15外，其他均為堿性蛋白質(zhì)，分子量為48.61～76.37 kDa。疏水性測試顯示：所有蛋白質(zhì)疏水性值(grand average hydropathicity，GRAVY)＞0，說明該家族蛋白質(zhì)均為疏水性蛋白質(zhì)。脂肪族氨基酸指數(shù)顯示：PHTⅠ家族的蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性為 83.79～105.07，熱穩(wěn)定性差異較大。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示：PePHTs均定位于細(xì)胞膜中。

表1 毛竹 PHTⅠ家族基因編碼蛋白序列的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of proteins encoded by PHTⅠ gene family in Ph. edulis

2.2 毛竹PHTⅠ家族基因結(jié)構(gòu)及保守基序特征分析

由圖1可知：毛竹PHTⅠ家族基因多數(shù)含1～2個內(nèi)含子(intron)，在所有PePHTs中，PePHT14內(nèi)含子區(qū)域最長，PePHT8和PePHT11內(nèi)含子區(qū)域最短。保守基序分析顯示：PePHTs含有7～10個保守基序，分別命名為motif1～motif10。其中有6個基序高度保守，分別是motif2、motif3、motif4、motif5、motif6、motif8，其他基序在部分序列中缺失。9個PePHTs中含有10個motif，其他11個PePHTs缺失1～3個motif，PePHT1、PePHT10都缺少motif7，PePHT11缺少motif1，PePHT12缺少motif9、motif10，PePHT14、PePHT15、PePHT16、PePHT18、PePHT19、PePHT20都缺少motif10，PePHT17則缺少motif7、motif9、motif10。PePHTs高度保守基序的氨基酸數(shù)目也不盡相同，最長的motif由50個氨基酸組成，最短的motif由29個氨基酸組成。

圖1 毛竹 PHTⅠ家族基因的結(jié)構(gòu)Figure 1 Structures analysis of PHTⅠ gene family in Ph. edulis

為探究PePHTs受內(nèi)在調(diào)控因子調(diào)節(jié)的情況和對外界環(huán)境的響應(yīng)，選取PePHTs距離起始密碼子上游2 000 bp的序列，對其所含順式作用元件和應(yīng)答元件進(jìn)行分析。如圖2所示：所有啟動子的順式作用元件種類比較相似，包括MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的順式作用元件，生長素、赤霉素、水楊酸、脫落酸等激素響應(yīng)元件以及低溫、干旱、缺氧、光等非生物脅迫響應(yīng)元件。由此表明：PePHTs的轉(zhuǎn)錄表達(dá)可能會受到非生物脅迫和激素的影響。

圖2 毛竹PHTⅠ家族基因啟動子區(qū)順式作用元件位置信息Figure 2 Location information of cis-acting regulatory elements identified in the promoter region of PHTⅠ gene family in Ph. edulis

2.3 毛竹 PHTⅠ家族基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了解PePHTs的進(jìn)化關(guān)系，預(yù)測基因潛在功能，本研究提取20個毛竹、18個擬南芥和25個水稻的PHT基因的CDS序列進(jìn)行多重序列比對，并利用MEGA 7.0軟件根據(jù)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖3顯示：毛竹、擬南芥和水稻的PHT基因被聚類到4個亞家族中，來自毛竹的20個PePHTs均分布在第Ⅰ亞家族的5個分支上，1個分支中只有PePHTs基因，另4個分支和水稻聚類在一起。此外，第Ⅰ亞家族中還包含9個擬南芥和12個水稻的PHT基因。PHT亞家族中的基因在功能上存在一定差異，如大多數(shù)第Ⅰ亞家族成員主要在直接接觸根際環(huán)境的根毛和表皮細(xì)胞中表達(dá)，參與根系對環(huán)境中磷元素的吸收過程[27-28]，定位在細(xì)胞膜上。相比擬南芥，毛竹PHT基因均優(yōu)先與水稻PHT基因聚類，推測PePHTs在功能上可能與水稻同源基因更為相似。

圖3 毛竹、擬南芥和水稻 PHT 家族基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 3 Phylogentic tree of PHT gene family from Ph. edulis， A.thaliana and O. sativa

2.4 毛竹PHTⅠ家族基因在染色體上的位置及適應(yīng)性進(jìn)化分析

染色體定位顯示：20個毛竹PHT基因位于10條染色體上，其中23號染色體上最多，有6個，分別是PePHT14、PePHT15、PePHT16、PePHT17、PePHT18、PePHT19；其次是24號染色體，有3個，分別是PePHT10、PePHT11、PePHT20，推測這2個基因簇中的基因可能分別編碼催化2種新陳代謝途徑中不同步驟的磷轉(zhuǎn)運(yùn)酶[29]。5號、14號以及15號染色體上各有2個基因，其余染色體各有1個(圖4)。除數(shù)量分布不均勻外，各基因在染色體上的分布位置也不均勻，大多數(shù)基因位于染色體的中部，少量則位于頂部和底部。適應(yīng)性分析結(jié)果表明：PePHT7的ω＞0，其他基因的ω＜0，表明PePHT7受到正選擇壓力，其他基因受到負(fù)選擇壓力[30]。

圖4 毛竹 PHTⅠ基因在染色體上的位置Figure 4 Chromosomal location of PHTⅠ genes from Ph. edulis

2.5 毛竹 PHTⅠ家族基因組織表達(dá)模式分析

根據(jù)毛竹6個不同部位的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜數(shù)據(jù)[26]，對毛竹PHTⅠ家族基因進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析。由圖5可知：毛竹不同組織中的PePHTs表達(dá)豐度差異較大，其中PePHT5、PePHT7、PePHT8、PePHT12、PePHT14、PePHT19在籜鞘中大量表達(dá)；PePHT2、PePHT3、PePHT6、PePHT13、PePHT15在根中表達(dá)豐度較高；PePHT18在葉中大量表達(dá)，PePHT10、PePHT20在葉鞘中大量表達(dá)，PePHT16、PePHT17在葉和葉鞘中也有少量表達(dá)。

圖5 PePHTs在毛竹 6 個部位的表達(dá)Figure 5 Expression analysis of PePHTs in 6 parts of Ph. edulis

3 討論

植物從環(huán)境中吸收磷元素的過程中，磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白起著至關(guān)重要的載體作用。植物PHTⅠ磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為膜蛋白，大多數(shù)屬于高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，并且具有相似的蛋白質(zhì)序列和化學(xué)結(jié)構(gòu)。在雙子葉植物擬南芥和單子葉植物水稻中分別發(fā)現(xiàn)了9個[31-32]和12個PHTⅠ家族成員[6]。VERSAW等[33]證實擬南芥AtPHT2.1除了參與植物對磷元素的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，還可能參與莖部對磷的轉(zhuǎn)運(yùn)，其蛋白質(zhì)定位于葉綠體內(nèi)膜上。PHTⅡ磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也在擬南芥[34]、馬鈴薯Solanum tuberosum[35]、茄Solanum melongena[36]、菠菜 Spinacia oleracea[37]、煙草 Nicotiana tabacum[38]和小麥 Triticum aestivum[39]等多種植物中被發(fā)現(xiàn)。PHTⅢ磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白最初在擬南芥中被克隆得到的。研究表明：PHTⅢ 磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)家族與 PHTⅠ家族一樣，通過 P/H+同向轉(zhuǎn)運(yùn)和P/OH-反向轉(zhuǎn)運(yùn)方式參與細(xì)胞質(zhì)間磷的交換[39-40]。隨后水稻、玉米和大豆等其他植物也克隆得到了該蛋白[41]。但是PHTⅣ 磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白只在少數(shù)幾種植物中發(fā)現(xiàn)[42]，研究報道很少。

植物磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是眾多轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的一類重要蛋白家族，它們在植物的根、莖、葉、花等器官都有分布，是磷元素吸收和運(yùn)轉(zhuǎn)的主要載體[1]。物種中均存在PHT基因，說明該基因具有重復(fù)性和多樣性，這也是基因組重新排列和擴(kuò)展的結(jié)果。本研究從毛竹基因組中鑒定出20個PHTⅠ家族基因，每個成員都含有Sugar_tr和MFs_1保守結(jié)構(gòu)域，這是它們具有相似功能的基礎(chǔ)。理化性質(zhì)分析顯示：PHT長度、理論等電點(diǎn)以及分子量區(qū)間跨度較大，這有可能是因為基因進(jìn)行多次復(fù)制轉(zhuǎn)錄后進(jìn)化的結(jié)果。本研究預(yù)測了毛竹PHTⅠ基因在細(xì)胞中的位置，發(fā)現(xiàn)毛竹PHTⅠ基因都分布在細(xì)胞膜上，與已有研究一致[3]，說明鑒定出的毛竹PHTⅠ亞家族中的基因符合磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的特性。在植物進(jìn)化過程中，選擇壓力能很好地體現(xiàn)發(fā)揮重要功能的蛋白的變化。基因適應(yīng)性進(jìn)化分析顯示：大多數(shù)PePHTs基因受到較強(qiáng)烈的負(fù)選擇壓力，說明毛竹磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相對趨于穩(wěn)定，是其保持原有重要功能的原因；同時PePHT7基因受到正選擇壓力，提示該基因編碼的蛋白可能會延伸出一些新的功能[30]。植物基因組織特異性表達(dá)與基因的功能關(guān)系密切，毛竹磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在籜鞘、根、葉和葉鞘都有1個及以上的基因大量表達(dá)，PePHT4、PePHT9、PePHT11等3個基因在任何組織中都沒有檢測到，還需深入研究；PePHT1在根和鞭芽中明顯下調(diào)，說明基因在不同組織中表達(dá)豐度不一樣且發(fā)揮著不同的作用。

系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)：毛竹PHTⅠ基因聚類在第Ⅰ亞家族的5個分支上，同一支中的基因可能具有相似的功能。擬南芥的PHTⅠ亞家族中有9個成員，其中AtPHT1.6在花粉中表達(dá)，其余8個在根中表達(dá)[43]；當(dāng)擬南芥缺磷時，AtPHT1.1和AtPHT1.4會大量表達(dá)，這2個磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提供了70%的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)活性[44]。水稻PHTⅠ亞家族中有12個成員[6]，其中OsPHT1主要功能是吸收磷素和體內(nèi)磷酸鹽的再分配[13]，OsPHT2主要在地上部分表達(dá)，也是水稻PHTⅠ亞家族中唯一一個低親和力磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[45]。PHTⅠ家族在水稻和擬南芥吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)磷的過程中具有重要作用[32，45]，推測在毛竹對磷的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過程中也可能具有重要作用，但需要進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行驗證。