陳敏，殷高方，趙南京，甘婷婷，谷夢園，亓培龍，丁志超，王璐，馮春，張小玲

（1 中國科學院合肥物質(zhì)科學研究院安徽光學精密機械研究所，中國科學院環(huán)境光學與技術(shù)重點實驗室，合肥 230031）

（2 中國科學技術(shù)大學，合肥 230026）

（3 安徽省環(huán)境光學監(jiān)測技術(shù)重點實驗室，合肥 230031）

（4 安徽大學，合肥 230039）

0 引言

微藻作為水生環(huán)境的初級生產(chǎn)者，個體小、繁殖快，對毒性反應(yīng)敏感，是評價污染化學品生物毒性極其重要的工具［1-2］。但廣泛使用的藻類生物測試指南，“淡水藻類和藍細菌，生長抑制試驗”（OECD 201）規(guī)定的指數(shù)生長測試至少需要72 h［3］，無法滿足水質(zhì)安全預(yù)警和污染物應(yīng)急監(jiān)測的需求。

熒光動力學方法作為一種非破壞性、非侵入性的技術(shù)，可在幾分鐘內(nèi)獲悉光合系統(tǒng)狀態(tài)［4］，在實時檢測和水安全應(yīng)用方面具有潛在應(yīng)用價值［5］。該技術(shù)提供了藻類光合活性的直接信息，早期在除草劑（光合抑制劑）上進行了大量的研究［6］，現(xiàn)在也被用于測試其他化學品的毒性，如重金屬［7-8］、多環(huán)芳烴［9］等。

通過監(jiān)測藻類熒光動力學變化過程可獲取與光合系統(tǒng)密切相關(guān)的一系列光合熒光參數(shù)。這些參數(shù)對應(yīng)著光合作用電子輸運流的不同過程，快速反映有毒物質(zhì)對光合系統(tǒng)的影響，是理想的生物毒性測試終點。目前基于這些參數(shù)的毒性數(shù)據(jù)也非常多，但由于毒性測試方案的不同，導(dǎo)致產(chǎn)生的毒性數(shù)據(jù)有較大差異［10］。因此，有必要進行相關(guān)測試條件的分析，減少實驗室間的可變性［11-12］。在生長抑制試驗中，因為需要生物量的積累，每個細胞的毒物可用性取決于毒物的初始濃度和細胞密度，初始生物量會顯著影響藻類毒性試驗的結(jié)果，所以“淡水藻類和藍細菌，生長抑制試驗”（OECD 201）中對初始微藻生物量有明確要求。SINGH P K 等也推薦使用較低生物量的藻樣來進行藻類生長抑制毒性測試［13］。然而，這一結(jié)論在以光合熒光參數(shù)作為毒性測試終點時是否適用，至今無相關(guān)研究或可靠數(shù)據(jù)可證明。熒光動力學技術(shù)本質(zhì)上是采用光學探測器來監(jiān)測微藻體內(nèi)的葉綠素熒光信號變化，所以本文以葉綠素濃度作為生物量的衡量，以蛋白核小球藻作為受試對象，分析在敵草隆短期暴露下，作為毒性測試終點的光合熒光參數(shù)與初始生物量的關(guān)系，為基于光合熒光參數(shù)的生物毒性快速檢測方法建立提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種培養(yǎng)與溶液配制

蛋白核小球藻（C.pyrenoidosa，F(xiàn)ACHB-5）為中國淡水水域的一種常見綠藻，具有分散均勻、不易粘壁的特性。因此本研究以蛋白核小球藻為受試藻種，采購于中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫。該藻種培養(yǎng)在恒溫搖床（MQD-S3R）中進行，光源為白色冷熒光燈管，培養(yǎng)條件為：溫度25±1 ℃、轉(zhuǎn)速120 r·min-1、光照強度120 μmol·m-2·s-1、光暗比12 h∶12 h。待藻液培養(yǎng)2～3 天，達到對數(shù)生長期，以其開展實驗研究。

采用藻類分析儀（FluoroProbe，德國BBE公司）對培養(yǎng)至對數(shù)生長期的蛋白核小球藻進行葉綠素濃度（生物量）測量，并根據(jù)實驗需要以滅菌后的BGII培養(yǎng)基對藻液進行稀釋，獲取一系列不同生物量的藻液，以開展不同生物量蛋白核小球藻對敵草?。?-（3，4-dichlorophenyl）-1，1-dimethylurea，DCMU）響應(yīng)研究。由于脅迫物質(zhì)敵草隆（DCMU，阿拉?。ㄖ袊虾＃?，純度99%）在水中溶解度很低，因此使用二甲基亞砜（DMSO，阿拉丁（中國上海），純度＞99%）作為溶劑配制DCMU 脅迫下蛋白核小球藻的待測樣品，最終單個樣品體積為50 mL，DCMU的濃度分別為0、1、2、5、10、20、40 μg·L-1（樣品中DMSO 含量小于0.1%），所有樣品以同樣方式制得3份。

1.2 光合熒光參數(shù)獲取

采用ACT2＆FastOcean FRR 藻類熒光系統(tǒng)（英國CTG 公司）對DCMU 脅迫下不同蛋白核小球藻的待測樣品進行光合熒光參數(shù)測量，以分析DCMU 對不同初始生物量蛋白核小球藻光合熒光參數(shù)的影響。該系統(tǒng)由FastOcean 快速重復(fù)率熒光儀和ACT2 實驗室系統(tǒng)組成。測量過程中，激發(fā)光源選擇450 nm 的LED，光化光設(shè)置從0 到800 μmol·m-2·s-1共8 個光強值，獲取待測樣品的快速光曲線（Fast Light Curve，F(xiàn)LC），并得到如表1 所示的11 個光合熒光參數(shù)，單個樣品測量周期約為3 min。

表1 由FRRf 獲取的光合熒光參數(shù)［14］Table 1 Photosynthetic fluorescence parameters obtained from FRRf［14］

2 結(jié)果與討論

2.1 初始生物量變化時不同光合熒光參數(shù)毒性響應(yīng)分析

圖1（a）和圖1（b）為10 μg·L-1DCMU 短期脅迫下（1 h 和3 h），不同初始生物量樣品對應(yīng)光合熒光參數(shù)的毒性響應(yīng)情況，以處理組與空白組的比值（球型）表示。其中灰色實線（100%）表示空白組，球型分布于實線上方，表明該參數(shù)受到促進作用；球型分布于實線下方，表明該參數(shù)受到抑制作用。柱形指示的是不同光合熒光參數(shù)在初始生物量變化情況下獲得毒性測試數(shù)據(jù)的相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。

圖1 短期脅迫下，不同初始葉綠素濃度對應(yīng)的11 個光合熒光參數(shù)對10 μg·L-1 DCMU 的毒性響應(yīng)情況Fig.1 Under short-term stress，the toxic response of 11 photosynthetic fluorescence parameters corresponding to different initial chlorophyll concentrations to 10 ug·L-1 DCMU

由圖1 可知，參數(shù)Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ以及τes的毒性測試結(jié)果基本不隨蛋白核小球藻初始生物量的變化而變化，當葉綠素濃度在20～1 000 μg·L-1的區(qū)間內(nèi)變化時，10 μg·L-1DCMU 脅迫1 h 與3 h 時該六個參數(shù)測試結(jié)果對應(yīng)相對標準偏差RSD 均低于5%，對應(yīng)平均值分別為2.74%與3.12%；而參數(shù)Ek、F0、Fm、Fv和JVPⅡ，其測試結(jié)果則明顯受到初始生物量的影響，當葉綠素濃度在20～1 000 μg·L-1區(qū)間內(nèi)變化時，DCMU 脅迫1 h 與3 h 時五個參數(shù)測試結(jié)果對應(yīng)相對標準偏差RSD 均高于10%，對應(yīng)平均值分別為14.66%與17.27%。以上結(jié)果表明，當葉綠素濃度在20～1 000 μg·L-1的區(qū)間內(nèi)變化時，短期脅迫下，光合熒光參數(shù)Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ以及τes對DCMU 的毒性測試結(jié)果更為穩(wěn)定，不受測試樣品初始生物量的影響。

2.2 光合熒光參數(shù)與生物量的相關(guān)性分析

為充分了解光合熒光參數(shù)與生物量（葉綠素濃度）的關(guān)系，分析參數(shù)與生物量的相關(guān)性是否對毒性響應(yīng)穩(wěn)定性造成影響，進一步測試了當?shù)鞍缀诵∏蛟迦~綠素濃度在20～1 000 μg·L-1的區(qū)間內(nèi)變化時，未受脅迫狀態(tài)下蛋白核小球藻11 個光合熒光參數(shù)數(shù)值隨葉綠素濃度變化的規(guī)律，并分別計算了同一光合熒光參數(shù)在不同藻生物量下的相對標準偏差RSD，結(jié)果如圖2。

由圖2 可知，11 個光合熒光參數(shù)可分為兩類，第一類為Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ和τes，其數(shù)值基本不隨葉綠素濃度的變化而變化，當葉綠素濃度在20～1 000 μg·L-1范圍變動時，F(xiàn)v/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ和τes測得數(shù)值的相對標準偏差RSD 分別為3.00%，3.66%，3.80%，3.67%，0.09%和7.74%，具有很好的一致性，說明這類參數(shù)只表征蛋白核小球藻的光合信息，與藻類生物量變化不相關(guān)。第二類參數(shù)為Ek、F0、Fm、Fv以及JVPⅡ，這些參數(shù)隨葉綠素濃度變化表現(xiàn)出一定的變化趨勢，其數(shù)值受生物量影響，其中Ek 與葉綠素濃度呈負相關(guān)，F(xiàn)0、Fm、Fv以及JVPⅡ與葉綠素濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，說明這些參數(shù)的數(shù)值變化除了包含光合系統(tǒng)信息，也反映了一定的生物量信息。結(jié)合2.1 節(jié)所得結(jié)論，可知當初始生物量發(fā)生變化時，光合熒光參數(shù)與生物量的相關(guān)性會影響毒性測試結(jié)果的穩(wěn)定，與生物量無關(guān)的第一類參數(shù)獲取的毒性測試結(jié)果更穩(wěn)定。

圖2 11 個光合熒光參數(shù)數(shù)值隨葉綠素濃度的變化趨勢Fig.2 The trend of 11 photosynthetic fluorescence parameters with chlorophyll concentration

2.3 不同初始生物量對應(yīng)光合熒光參數(shù)的毒性劑量效應(yīng)分析

穩(wěn)定敏感的毒性劑量效應(yīng)分析是水質(zhì)生物毒性測量的關(guān)鍵。由于涉及參數(shù)眾多，為篩選出能與毒物建立良好劑量效應(yīng)的參數(shù)，并針對該參數(shù)提出最佳的初始生物量區(qū)間，本研究以處理組與空白組的比值作為縱坐標，DCMU 的濃度為橫坐標，利用Logistic 函數(shù)建立了不同初始生物量對應(yīng)光合熒光參數(shù)的劑量效應(yīng)曲線，得到了對應(yīng)曲線的相關(guān)系數(shù)R2以及毒性數(shù)據(jù)EC20（產(chǎn)生20%效應(yīng)對應(yīng)的毒物濃度）、EC50（產(chǎn)生50%效應(yīng)對應(yīng)的毒物濃度），如表2。并以參數(shù)Fv/Fm、Fm為例，展示了DCMU 脅迫下，參數(shù)Fv/Fm、Fm及對應(yīng)的毒性數(shù)據(jù)EC20隨測試樣品初始生物量的變化趨勢，如圖3。

表2 不同初始生物量下光合熒光參數(shù)獲得DCMU 相關(guān)毒性數(shù)據(jù)（μg·L-1）及劑量效應(yīng)曲線擬合相關(guān)系數(shù)R2Table 2 DCMU-related toxicity data（μg·L-1）and dose-effect curve fitting effect（R2）obtained by photosynthetic fluorescence parameters under different initial biomass

由表2 可知，在DCMU 脅迫下，第一類參數(shù)Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ、τes均呈現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系（R2＞0.9），第二類參數(shù)中只有F0、Fm以及Fv呈現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系（R2＞0.9）。以EC50、EC20以及R2作為主要的分析參考依據(jù)（R2＞0.9，EC50和EC20數(shù)值較低），給出了當以參數(shù)Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ、τes、F0、Fm以及Fv作為DCMU 毒性測試終點時測試樣品初始生物量的最佳范圍。對第一類參數(shù)Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ、τes，最佳的藻類初始葉綠素濃度（生物量）范圍為10～2 000 μg·L-1，在此范圍內(nèi)所獲取的毒性數(shù)據(jù)EC20、EC50數(shù)值低且穩(wěn)定，符合2.1 節(jié)所述結(jié)論，但是當初始葉綠素濃度為4 μg·L-1時，EC50與EC20明顯偏高，分析原因是由于藻種具有群體依賴性［15］，過低的生物量會影響藻種的光合生理狀態(tài)，本研究中也確實發(fā)現(xiàn)當葉綠素濃度降到4 μg·L-1，藻光合活性Fv/Fm發(fā)生了突降（圖3（a））。對第二類參數(shù)F0、Fm與Fv，最佳的藻類初始葉綠素濃度（生物量）范圍為200～1 000 μg·L-1，在此范圍內(nèi)所獲取的毒性數(shù)據(jù)EC20、EC50數(shù)值低且穩(wěn)定。此外，當初始葉綠素濃度為2 000 μg·L-1，劑量效應(yīng)曲線的擬合效果較差；當初始葉綠素濃度在4～100 μg·L-1范圍內(nèi)時，葉綠素濃度越低，EC50與EC20越高。

圖3 參數(shù)數(shù)值及對應(yīng)DCMU 毒性數(shù)據(jù)EC20隨初始葉綠素濃度的變化趨勢Fig.3 The value of the parameter and the corresponding DCMU toxicity data EC20 change trend with the initial chlorophyll concentration

3 結(jié)論

本文以蛋白核小球藻為受試生物，研究了DCMU 短期脅迫下，作為毒性測試終點的光合熒光參數(shù)（Fv/Fm，Yield，α，rP，σPSⅡ，τes，Ek，F(xiàn)0，F(xiàn)m，F(xiàn)v，JVPⅡ）與初始生物量的關(guān)系。結(jié)果表明，當初始生物量發(fā)生變化時，光合熒光參數(shù)與生物量的相關(guān)性會直接影響到毒性測試結(jié)果的穩(wěn)定性，可將光合熒光參數(shù)分為兩類，第一類為Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ和τes，其數(shù)值與生物量變化不相關(guān)，只表征蛋白核小球藻的光合系統(tǒng)信息，該類參數(shù)獲取的毒性測試結(jié)果不受初始生物量變化的影響，當初始葉綠素濃度在20～1 000 μg·L-1的區(qū)間內(nèi)變化時，10 μg·L-1DCMU 脅迫1 h 與3 h 時該六個參數(shù)測試結(jié)果對應(yīng)相對標準偏差的平均值分別為2.74%與3.12%；第二類參數(shù)為Ek、F0、Fm、Fv以及JVPⅡ，其數(shù)值受生物量影響，包含生物量信息，這類參數(shù)的毒性測試結(jié)果明顯受到生物量波動的影響，穩(wěn)定性變差，當葉綠素濃度在20～1 000 μg·L-1區(qū)間內(nèi)變化時，10 μg·L-1DCMU 脅迫1 h 與3 h 時五個參數(shù)測試結(jié)果對應(yīng)相對標準偏差的平均值分別為14.66%與17.27%。進一步的劑量效應(yīng)分析結(jié)果表明，參數(shù)Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ、τes、F0、Fm以及Fv在DCMU 脅迫下呈現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。另外根據(jù)EC50、EC20以及相關(guān)系數(shù)R2，給出了不同光合熒光參數(shù)作為毒性測試終點時，藻類初始葉綠素濃度的最佳范圍：對參數(shù)Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ、τes，建議范圍為10～2 000 μg·L-1；對于參數(shù)F0、Fm與Fv，建議范圍為200～1 000 μg·L-1。該結(jié)果為基于光合熒光參數(shù)的生物毒性快速檢測方法的建立提供了重要依據(jù)。