劉立玲,周光益,黨 鵬,陳 潔,尚 海,邱麗瓊,朱寧華1, ,*

1 中南林業(yè)科技大學(xué)林學(xué)院,長沙 410004 2 中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所,廣州 510520 3 武陵山石漠化綜合治理國家長期科研基地,吉首 416000

石漠化是我國西南山地突出的環(huán)境問題,巖石裸露率高,生態(tài)系統(tǒng)脆弱,植被退化是石漠化發(fā)展的重要原因和標(biāo)志[1—2],而植被恢復(fù)是控制石漠化發(fā)展的重要途徑。已有學(xué)者對石漠化地區(qū)植被恢復(fù)過程開展了一些研究,如植被恢復(fù)模式[3]、次生林群落特征及林分結(jié)構(gòu)[4]、植物多樣性及分布[5—7]以及土壤養(yǎng)分變化[8—10]等,但有關(guān)石漠化區(qū)不同造林模式下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)尚研究較少。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成成分,與土壤氮、磷等營養(yǎng)元素含量密切相關(guān),進(jìn)而影響地上植被組成及結(jié)構(gòu)[11],而地上植被通過有機(jī)物輸入等調(diào)節(jié)地下微生物群落結(jié)構(gòu),使土壤微生物組成及多樣性存在差異,植被與微生物在不同土壤養(yǎng)分條件下形成反饋調(diào)節(jié)[12—15]。土壤微生物對環(huán)境的變化十分敏感,能提高對抗土壤生態(tài)環(huán)境惡化的緩沖能力[16—17]。土壤真菌作為分解者,廣泛參與森林生態(tài)系統(tǒng)中有機(jī)質(zhì)和大分子物質(zhì)的分解,尤其是酸性森林土壤,能有效改善土壤質(zhì)地和結(jié)構(gòu),參與營養(yǎng)元素的生物化學(xué)循環(huán),同時也會影響植物根際微生物的結(jié)構(gòu)[18],與細(xì)菌相比,土壤真菌更能有效利用碳源,對干旱環(huán)境更具有適應(yīng)性優(yōu)勢。研究表明,土壤真菌可以作為森林干擾中土壤健康的指標(biāo)[19],真菌群落結(jié)構(gòu)主要受到植被類型[20]或土地管理措施[21]的影響,不同林型土壤真菌群落組成和多樣性存在明顯差異。

目前有關(guān)石漠化地區(qū)森林土壤真菌群落特征及其影響機(jī)制的研究相對匱乏,探究石漠化區(qū)不同造林模式對真菌群落組成特征及多樣性對揭示石漠化區(qū)不同植被恢復(fù)模式下土壤質(zhì)量的演變及其驅(qū)動因子具有重要意義。本研究以湘西自治州森林生態(tài)研究實驗站石漠化區(qū)的植被恢復(fù)地作為研究對象,利用高通量測序技術(shù)對不同造林模式林地的土壤真菌群落進(jìn)行測定,研究不同造林模式對土壤真菌群落的影響,旨在揭示不同造林模式下土壤真菌多樣性和群落組成的差異及其主要土壤環(huán)境影響因子,研究結(jié)果可進(jìn)一步增強(qiáng)對石漠化生態(tài)系統(tǒng)中土壤微生物群落組成的認(rèn)識,為預(yù)測生態(tài)系統(tǒng)對環(huán)境變化的響應(yīng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗區(qū)位于湖南省湘西自治州森林生態(tài)研究實驗站(109°10′E,27°44.5′N),大陸性季風(fēng)氣候明顯,境內(nèi)年平均降水量1300—1500 mm,年平均溫度16.3 ℃,年無霜期269—292 d,年日照時數(shù)為1340 h。該地的母巖分布主要是石灰?guī)r,土壤以黃棕壤為主。試驗林均1989年以2 m×3 m的株行距營造的人工林,其中,馬尾松(Pinusmassoniana)和光皮樺(Betulaluminifera)混交林是按1∶1的比例進(jìn)行株間混交造林,并根據(jù)間密留疏的原則對中幼齡林進(jìn)行撫育管理,之后人為干擾較小。所選樣地初植密度均為1650株/hm2。各樣地自然概況見表1。

表1 樣地概況

1.2 樣地設(shè)置與樣品采集

于2019年7月在對照樣地及3種造林地分別設(shè)置3個20 m×20 m的標(biāo)準(zhǔn)樣方,并在每個樣方內(nèi)采用“S”形5點采樣法確定采樣點(共計15個),取樣前去除土壤表層的凋落物,在樣點做土壤剖面,采集0—20 cm土層土樣,將每個樣方中5個采樣點所采集的土壤樣品混合均勻。將一部分土樣無菌塑料袋中并編號放于恒溫箱內(nèi)帶回實驗室,用于土壤微生物多樣性的分析(高通量測序,樣品需裝入已滅菌的2 mL凍存管中進(jìn)行-80 ℃保存)。其余部分經(jīng)過風(fēng)干處理后,用于土壤理化性質(zhì)等指標(biāo)的測定。

1.3 土壤理化性質(zhì)測定

分別測定四組樣品的土壤含水率(SWC)、pH值、土壤有機(jī)碳(SOC)、全氮(TN)、全磷(TP)等指標(biāo)。其中,SWC采用烘干法(105℃,8 h)；pH值用水浸提電位法(酸度計FE20K,Mettler)測定;SOC采用重鉻酸鉀-外加熱硫酸氧化法(LY/T 1237—1999)進(jìn)行測定；土壤 N、P 則分別采用半微量凱氏定氮法(LY/T 1228—1999)和鉬銻抗比色法(LY/T 1232—1999)進(jìn)行測定[22]。

1.4 土壤總DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序

1.4.1土壤總DNA 提取、PCR擴(kuò)增

轉(zhuǎn)移 250—500 mg 的新鮮樣品到 2.0 mL進(jìn)口離心管中,將 NucleoSpin Bead Tube中的研磨珠倒入樣品管內(nèi),加入700 μL的SL2；再加150 μL的Enhancer SX,蓋緊離心管,渦旋混勻,將樣品管放入震蕩混勻儀,于70 ℃下以1000—1200 rpm 震蕩10 min,裂解完畢的樣品,經(jīng)過12000 rpm離心2 min,轉(zhuǎn)移大約700 μL上清液到新的2.0 mL進(jìn)口離心管中加入150 μL SL3,顛倒混勻后,4 ℃孵育5 min,12000 rpm 離心2 min；過濾去除抑制劑,進(jìn)行DNA結(jié)合,清洗并且干燥硅基質(zhì)膜,將DNA洗脫后轉(zhuǎn)至新的1.5 mL進(jìn)口離心管中備用。

選用長度約為250 bp的真菌ITS基因的高度可變的ITS1區(qū)為目標(biāo)片段,使用ITS1F: CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA和ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC通用引物組從每個樣本提取的基因組DNA中擴(kuò)增全長ITS rRNA基因。使用KOD One PCR主混合物(TOYOBO Life Science)進(jìn)行為期25個周期的PCR擴(kuò)增。

1.4.2高通量測序及OTU的劃分

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的定量測定、均一化、文庫制備、上機(jī)測序及數(shù)據(jù)質(zhì)量控制等均由百邁客云平臺完成。上機(jī)測序采用Illumina HiSeq測序平臺。利用雙末端測序(Paired-End)的方法,構(gòu)建小片段文庫進(jìn)行測序。通過對原始測序序列進(jìn)行過濾、雙端拼接,得到優(yōu)化序列(Tags),將優(yōu)化序列進(jìn)行聚類,劃分OTU,并根據(jù)OTU的序列組成得到其物種分類,將相似性97%的序列進(jìn)行聚類,基于分類單元進(jìn)行物種注釋,將測序錯誤序列及豐度值低于全體樣本測序總量0.001%的OTU去除,將去除了稀有OTU的豐度矩陣用于后續(xù)的系列分析。

1.5 重要值計算方法

物種重要值是描述植物多樣性的重要指標(biāo)[23],其計算公式如下：

重要值(%)=(相對密度+相對優(yōu)勢度+相對頻度)/3×100%

(1)

相對密度(%)=(某種植物的個體數(shù)/全部植物的個體數(shù))×100%

(2)

相對優(yōu)勢度(%)=(樣方中該種個體總面積/樣方中全部個體總面積)×100%

(3)

相對頻度(%)=(某種在全部樣方中的頻度/所有種頻度之和)×100%

(4)

1.6 土壤微生物菌群穩(wěn)定性計算方法

對于所取的土壤樣本,引入特異性測量(Specific measurement,SPM)算法[24]來量化菌群的豐度變化情況,依據(jù)群落豐度的變化(SPM值),采用參數(shù)分散法(DPM)評價微生物群落的穩(wěn)定性[25]。計算過程如下：

首先將某微生物種群豐度(X)轉(zhuǎn)換為對應(yīng)的向量X：

X= (X1,X2,…,Xi,…,Xn-l,Xn)

(5)

Xi= (0, 0,…,Xi,…, 0, 0)

(6)

(7)

式中,n代表微生物種群的數(shù)量,Xi代表第i個微生物種群的豐度,向量Xi代表該菌群在第i個樣本的豐度；φ為樣品中的微生物菌群豐度。

將某微生物種群豐度(X)轉(zhuǎn)換為對應(yīng)的SPM值(XSPM)：

XSPM=(SPM1,SPM2,…,SPMi,…SPMn-1,SPMn)

(8)

(9)

1.7 數(shù)據(jù)處理及分析

對樣品α多樣性(Alpha diversity)指數(shù)的分析采用Mothur軟件進(jìn)行,計算ACE、Chao1、Shannon和Simpson等物種多樣性指數(shù)。采用SPSS 25.0對不同造林模式下土壤理化性質(zhì)及真菌群落多樣性差異進(jìn)行單因素方差分析,比較不同造林模式下的差異顯著性校驗采用多元方差分析(PERMANOVA)。通過Mantel檢驗和冗余度分析(RDA)分析了真菌與土壤環(huán)境因子的關(guān)系。所有的統(tǒng)計分析都是在R 3.5.1中用“vegan”包進(jìn)行的。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同造林模式下優(yōu)勢植物種及重要值

重要值是確定某種植物在群落中相對重要性的一個綜合性指標(biāo),能有效反映不同植被類型中各種植物在群落中的功能地位及分布格局[26]。不同造林模式下主要植物組成及重要值見表2。表2顯示：圓葉鼠李(Rhamnusglobosa)在光皮樺純林和混交林中重要值最大,分別為6.56、7.58,寒莓(Rubusbuergeri)和灰白毛莓(Rubustephrodes)分別是馬尾松純林和未造林灌草地中重要值最大的灌木種。草本層中,馬蘭(Kalimerisindica)在光皮樺純林中和混交林中重要值均最大,分別為16.12、17.78,而在馬尾松純林中是毛蕨(Cyclosorusinterruptus)的重要值最大,為15.12,而過路黃(Lysimachiachristiniae)在未造林灌草地中的重要值最大,值為17.75。未造林灌草地由于沒有高大喬木,光照充足,灌草種類要多于人工林。

表2 不同造林模式下主要植物組成及重要值

2.2 不同造林模式下的土壤理化性質(zhì)

表3 不同造林模式下土壤理化性質(zhì)的變化(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)(0—20 cm)

2.3 不同造林模式下土壤真菌組成

圖1 不同造林模式土壤真菌群落相對豐度 Fig.1 The relative abundance of soil fungal communities in different afforestation modesPM,馬尾松純林Pinus massoniana；BL,光皮樺純林Betula luminifera；MF,馬尾松-光皮樺混交林Mixed Forest；CK,未造林灌草地Control check。Ascomycota：子囊菌門；Basidiomycota：擔(dān)子菌門； Mortierellomycota：被孢霉門；GS01：芽孢桿菌門；Rozellomycota：羅茲菌門；Glomeromycota：球囊菌門；Chytridiomycota： 壺菌門； Zoopagomycota：捕蟲霉門； Olpidiomycota：油壺菌門；Kickxellomycota：梳霉門 ；others：其他；Unclassified：未分類

圖2 基于binary_jaccard距離土壤真菌群落beta多樣性分析 Fig.2 The beta diversity analysis of soil fungal community based on binary_jaccard distanceR2表示不同分組對樣品差異的解釋度,即分組方差與總方差的比值,R2越大表示分組對差異的解釋度越高,表示分組差異越大,P 值小于0.05時說明檢驗的可信度高

不同造林模式下土壤真菌組成如圖1所示。馬尾松林地土壤樣品中,門級水平除了未確定的真菌類群,擔(dān)子菌門(Basidiomycota)為優(yōu)勢類群,其相對豐度為57.93%,其次為被孢霉門(Mortierellomycota)相對豐度為9.96%、子囊菌門(Ascomycota)相對豐度為9.50%,羅茲菌門 (Rozellomycota)相對豐度為1.38%。光皮樺林地土壤樣品中,未確定的真菌類群相對豐度較大,后依次為子囊菌門(Ascomycota)相對豐度為35.0%,擔(dān)子菌門(Basidiomycota)相對豐度為1.68%,被孢霉門(Mortierellomycota)相對豐度為0.87%?；旖涣滞寥罉悠分?未確定的真菌類群相對豐度所占比例較大為30.98%,子囊菌門(Ascomycota)為優(yōu)勢類群,相對豐度為28.00%,其次為擔(dān)子菌門(Basidiomycota)相對豐度為27.94%、被孢霉門(Mortierellomycota)相對豐度為6.49%。而石漠化灌草地土壤樣品中,子囊菌門(Ascomycota)相對豐度為64.00%為優(yōu)勢類群,其次為擔(dān)子菌門(Basidiomycota)相對豐度為8.64%、被孢霉門(Mortierellomycota)相對豐度為2.48%,未確定的真菌類群相對豐度為23.98%。由圖2可知,基于binary_jaccard距離分析土壤真菌群落beta多樣性, 組間存在差異,但檢驗的可信度不高(P>0.05)。

利用DPM分析石漠化區(qū)不同造林模式下土壤真菌各個門種群的變化(表4),結(jié)果發(fā)現(xiàn)：相對豐度高于1%的核心菌門中,子囊菌門(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)豐度變化值DPM>0.4,因此我們認(rèn)為石漠化區(qū)不同造林模式土壤中子囊菌門和擔(dān)子菌門菌群為活躍菌群。

2.4 土壤真菌多樣性分析

Alpha多樣性分析結(jié)果表明,3種不同造林模式下的土壤真菌多樣性指數(shù)存在顯著差異(P<0.05)(表5)。3種不同造林模式中,混交林土壤真菌物種總數(shù)高于其他造林模式,混交林土壤真菌Shannon指數(shù)顯著高于馬尾松和光皮樺林地,而馬尾松和光皮樺純林之間差異不顯著,整體上真菌群落多樣性表現(xiàn)為：混交林>馬尾松林>光皮樺林。石漠化區(qū)土壤中存在大量未知的真菌菌群,與未造林灌草地相比,造林后土壤真菌物種總數(shù)明顯增加,己知注釋出的土壤真菌種的數(shù)量要高于未造林灌草地。

2.5 不同造林模式下土壤真菌結(jié)構(gòu)和土壤理化性質(zhì)的RDA分析

表4 不同真菌門豐度的DPM值

表5 不同造林模式下土壤真菌群落多樣性分析

表6 基于Mantel test分析真菌群落與土壤之間的關(guān)系

圖3 不同造林模式下土壤真菌群落樣地-環(huán)境RDA排序Fig.3 The soil fungi community RDA sort of sample area and environment in different afforestation patterns RDA: 冗余分析 Redundancy analysis；SOC：有機(jī)碳Soil Organic Carbon ；TP：全磷Total Phosphorus ；TN:全氮 Total 銨態(tài)氮 Ammonium；NO3--N：硝態(tài)氮 Nitrate Nitrogen；AP：有效磷Available Phosphorus ；SWC：土壤含水率Soil Water Content；pH: pH值；相同圓點代表重復(fù)樣品

3 討論

3.1 不同造林模式下土壤理化性質(zhì)的差異

不同類型人工林在0—20 cm土層土壤中SOC、TN、TP、AP含量不同,其中馬尾松林土壤中土壤養(yǎng)分含量最低,可能是因為馬尾松林為針葉林,枯枝落葉保水能力較弱,且針葉分解速度較慢,從而導(dǎo)致土壤肥沃度下降。其次,有機(jī)質(zhì)能夠在一定程度上改善土壤的結(jié)構(gòu),較高的有機(jī)質(zhì)和全氮含量能提高土壤的疏松度和保水能力。土壤肥力同時也取決于當(dāng)?shù)貧夂?、土壤形成條件、環(huán)境以及不同地區(qū)的人為影響[27]。有研究表明,不同石漠化等級土壤養(yǎng)分含量差異顯著,N、P、K是影響石漠化地區(qū)物種組成的主要因子,其分布特征可以部分解釋草本和灌木分布的不均勻性[28]。

石漠化地區(qū)不同植被恢復(fù)模式下土壤理化性質(zhì)存在明顯差異,有研究顯示,相同土層條件下,針闊混交林中土壤有機(jī)質(zhì)、有效氮和土壤持水量均顯著高于純林,其土壤生物學(xué)性質(zhì)更加完善[29]。與本研究結(jié)果相似,混交林土壤的SOC、TP、TN含量要高于純林,可能是因為混交林中土壤真菌物種總數(shù)較多,真菌群落進(jìn)行的生理生化活動利于土壤有機(jī)質(zhì)礦化和養(yǎng)分庫的積累[30—31]。馬尾松為針葉樹種,其凋落物以及根系分泌物中含有多種酸性物質(zhì),更易使土壤酸化[32],所以其土壤pH值顯著低于其他造林模式。林隙土壤含水量出現(xiàn)差異的主要原因在于有機(jī)質(zhì)含量差異[33],本研究中混交林的SWC顯著低于純林,可能是林下植物種類不同,混交林凋落物種類更豐富,菌根和腐生真菌協(xié)同競爭相同的有機(jī)底物[34],凋落物分解較慢導(dǎo)致有機(jī)質(zhì)含量增加,但不利于土壤水分的積累,但為土壤微生物提供的營養(yǎng)生態(tài)位更全面(這與混交林真菌Shannon多樣性較高結(jié)果一致)。因此,推測混交林凋落物和有機(jī)質(zhì)分解速率大于兩種純林,進(jìn)而導(dǎo)致土壤有機(jī)質(zhì)累計較慢,土壤蓄水能力較差。

3.2 不同造林模式下土壤真菌群落組成和多樣性

植被類型、氣候、土壤及人為活動等多種因素均會影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成[35],在立地條件相近的情況下,土壤微生物群落組成結(jié)構(gòu)產(chǎn)生差異的最主要原因是植被類型的不同[36]。本研究中,混交林的真菌群落豐度最大,其次為馬尾松純林、光皮樺純林。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由于馬尾松屬于針葉樹種,凋落物難分解,土壤中有機(jī)質(zhì)含量低于光皮樺林,加快了真菌的生長速度。在不同的生態(tài)系統(tǒng)中,微生物群落的整體組成可能存在較大差異,但優(yōu)勢菌群基本相似[37]。本研究中,子囊菌門和擔(dān)子菌門在不同造林模式下的土壤真菌中占有絕對優(yōu)勢,子囊菌門在光皮樺林中的豐度(37.99%)高于馬尾松林(9.97%),可能是因為子囊菌主要是腐生菌,腐生菌可以分泌多種酶,以體外方式分解土壤中的有機(jī)質(zhì)及動植物尸體,從而形成二氧化碳、無機(jī)鹽和簡單的有機(jī)物,為植物生長提供養(yǎng)分,是土壤養(yǎng)分循環(huán)過程中的重要真菌,說明在石漠化地區(qū)種植光皮樺林可以提高子囊菌門真菌群落相對豐度,進(jìn)一步改善土壤養(yǎng)分環(huán)境。而馬尾松林中擔(dān)子菌門豐度遠(yuǎn)高于光皮樺林,主要是因為馬尾松林群落土壤土壤含水量較低,通氣性良好,且土壤pH值較低,有利于提高擔(dān)子菌門的豐度[38]。這與沈芳芳等[39]在陸地生態(tài)系統(tǒng)植物和土壤微生物群落多樣性對全球變化的響應(yīng)與適應(yīng)研究進(jìn)展中所得出的結(jié)論一致。

土壤特性是影響土壤真菌多樣性的重要因素[40],本研究中馬尾松-光皮樺混交林Shannon指數(shù)高于馬尾松和光皮樺純林,由Mantel test分析結(jié)果可知SOC是影響不同造林模式下土壤真菌群落的主要因子,其次為TN,可能是因為土壤C主要來源于有機(jī)質(zhì)礦化和凋落物分解,土壤N的來源主要是凋落物的分解[41],真菌需要氮養(yǎng)分來合成分解有機(jī)物的酶,而碳是真菌生物量的主要成分以及能量來源,土壤微生物會根據(jù)地上植物的空間分布變化而發(fā)生變化[42],地上植被演替改變了植物組成及生理特性,從而導(dǎo)致進(jìn)入土壤的有機(jī)碳隨之發(fā)生改變[43],因此不同造林模式下真菌群落存在差異。本研究中石漠化地區(qū)土壤含水量較低,SWC對真菌群落結(jié)構(gòu)影響顯著,這與前人研究結(jié)果相似[44]。有研究顯示宿主植物對土壤中真菌多樣性和種類影響顯著[45],因此,植物種類可影響根際微生物群落的結(jié)構(gòu)和活性,根形態(tài)和根系分泌物可影響根際微生物群落的物種特異性[46],地上植被多樣性可能是影響地下真菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性的原因之一,究竟石漠化區(qū)植物群落喬木層、灌草層植物多樣性與真菌多樣性是否存在顯著的相關(guān)性還需要未來做進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

湘西石漠化治理區(qū)內(nèi),與未造林灌草地相比,3種造林模式均提高了土壤SOC、TP和TN含量,馬尾松-光皮樺混交林和光皮樺純林土壤養(yǎng)分含量高于馬尾松純林。馬尾松-光皮樺混交林真菌可識別數(shù)量及多樣性最高。而土壤SOC、TN是導(dǎo)致土壤真菌群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)差異的最主要的環(huán)境因子。為提高該區(qū)土壤質(zhì)量,實現(xiàn)植被恢復(fù),推薦光皮樺純林作為其治理模式,更有利于石漠化生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的維持和功能的恢復(fù),若選擇馬尾松進(jìn)行石漠化治理,則推薦采用混交林的種植模式。