謝瑋薇，汪希鵬

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是女性生殖系統(tǒng)的三大惡性腫瘤之一，在婦科腫瘤中病死率最高且預(yù)后最差[1]。因起病隱匿，早期階段缺乏特異性癥狀及體征，導(dǎo)致70%的卵巢癌患者確診時已屬晚期。目前卵巢癌的篩查方案主要是婦科陰道超聲聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）檢測，一直缺乏更新。一項(xiàng)超過29 萬女性的大規(guī)模臨床隊(duì)列研究表明，以此經(jīng)典方案篩查并沒有降低卵巢癌的死亡率[2]。過去的40 年里，大多數(shù)常見癌癥的5 年相對存活率都有所提高，但是卵巢癌的生存率卻變化不大[3]。如能早期確診，卵巢癌患者的5 年生存率可達(dá)到90%。因此，尋找特異性的早期診斷標(biāo)志物，探尋有效干預(yù)靶點(diǎn)，對于改善卵巢癌患者的預(yù)后具有極為重要的臨床意義。

Slit-Robo GTP 酶激活蛋白（Slit-Robo GTPaseactivating protein，SRGAP）家族作為Slit-Robo 信號通路中的主要結(jié)合位點(diǎn)和下游效應(yīng)體，在哺乳動物中包括4 個成員：SRGAP1、SRGAP2、SRGAP3 和Rho GTP 酶活化蛋白4（Rho GTPase activating protein 4，ARHGAP4）[4]。SRGAP1 作為一種GTPase 活化蛋白，其主要生理功能是將Rho-GTP 水解為Rho-GDP[5]。早期研究發(fā)現(xiàn)SRGAP 家族分子干預(yù)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)節(jié)[6]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，SRGAP1 在胃癌中表達(dá)上調(diào)，通過激活Wnt/β-連環(huán)蛋白（Wnt/β-catenin）通路發(fā)揮致癌作用，尤其是促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[7]。SRGAP1基因上有大量腫瘤相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)，比如在甲狀腺乳頭狀癌中，SRGAP1 可能是低外顯性的易感性候選基因[8]。SRGAP1 可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，并作為一個有用的抗腫瘤靶點(diǎn)已超過20 年。但是，SRGAP1 在卵巢癌中的表達(dá)水平與臨床意義鮮有報道。本研究通過免疫組織化學(xué)法分析SRGAP1 在卵巢癌組織中的表達(dá)差異，通過蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）和實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT -PCR）從蛋白和mRNA 層面驗(yàn)證，并分析SRGAP1 與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，探尋SRGAP1 是否可作為卵巢癌早期診斷的有效標(biāo)志物，以期為早期卵巢癌的診斷、病情監(jiān)測、預(yù)后等提供有價值的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇2008—2018 年于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院（我院）住院治療的180 例卵巢腫瘤患者的組織蠟塊。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為卵巢良性囊腫或卵巢癌，所有患者術(shù)前均未接受藥物治療及放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤疾??；合并心、腦、腎、肺和肝等重要器官功能障礙。最終選取64 例卵巢良性囊腫組織、116 例卵巢癌組織和71 例卵巢癌腹膜轉(zhuǎn)移組織的樣本?；颊吣挲g25～74 歲，中位年齡53 歲，包括高級別漿液性卵巢癌37 例，低級別漿液性卵巢癌5 例，交界性卵巢腫瘤16 例，高級別漿液性輸卵管癌13 例，卵巢內(nèi)膜樣腺癌10 例，卵巢透明細(xì)胞癌22 例，卵巢癌特殊類型及轉(zhuǎn)移13 例。術(shù)中同時留取同一患者的卵巢癌組織及腹膜轉(zhuǎn)移組織。卵巢癌的組織病理學(xué)診斷、分級和分期均依據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（The International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）標(biāo)準(zhǔn)。本研究經(jīng)我院倫理委員會的批準(zhǔn)，并獲得患者及家屬的知情同意。

1.2 主要試劑兔單克隆抗體SRGAP1（ab171938）購于英國Abcam 公司。兔單克隆抗體β-actin（20536-1-AP）購于中國武漢Proteintech 公司。免疫組織化學(xué)試劑盒二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑及辣根過氧化物酶（HRP）耦聯(lián)的山羊抗兔抗體購于武漢Servicebio 科技有限公司。聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）購于美國Millipore 公司。蛋白裂解液購于北京Solarbio 科技有限公司。新型總RNA 抽提試劑（Trizol 裂解液）及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本Takara 生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)法組織芯片均經(jīng)4%多聚甲醛固定，固定后，修剪、脫水、包埋、切片、染色，制備成4 μm 切片備用。65 ℃烤箱烘烤1 h，二甲苯溶液脫蠟和梯度乙醇中脫去二甲苯。檸檬酸抗原修復(fù)30 min，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑孵育30 min，山羊血清室溫孵育1 h 以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，一抗（ab171938，濃度1∶200）4 ℃孵育過夜。二抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液各室溫孵育30 min。顯微鏡下DAB 顯色，蘇木素復(fù)染3 min。常規(guī)脫水、透明及封片。根據(jù)染色深度，染色強(qiáng)度分為弱、中、強(qiáng)。用組織化學(xué)評分（H-score）半定量蛋白表達(dá)，計算為∑（PI×I）=（弱強(qiáng)度細(xì)胞的百分比×1）+（中等強(qiáng)度的細(xì)胞百分比×2）+（高強(qiáng)度細(xì)胞百分比×3）。其中PI 表示陽性信號像素面積占比；I 代表著色強(qiáng)度[9-10]。

1.4 Western blotting 法檢測組織SRGAP1 蛋白表達(dá)取3 例卵巢良性囊腫組織，3 例卵巢癌和配對的腹膜轉(zhuǎn)移組織，充分研磨后加RIPA 裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 r/min離心30 min。吸取上清液，測蛋白濃度。8%SDS-PAGE 電泳分離，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入稀釋的SRGAP1 抗體（1∶2 000）、β-actin 抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜5 min×3 次，HRP 耦聯(lián)的兔二抗（1∶1 000）室溫孵育2 h，TBST 洗膜5 min×3 次。ECL 發(fā)光。以肌動蛋白（ACTIN）為內(nèi)參計算目的蛋白SRGAP1 的相對表達(dá)量?；叶葤呙瑁琁mage J 軟件分析灰度值，以灰度值表示蛋白表達(dá)量。

1.5 qRT-PCR 檢測組織SRGAP1 的mRNA 表達(dá)取1.4中敘述的3 例卵巢良性囊腫組織，3 例卵巢癌和配對的腹膜轉(zhuǎn)移組織，使用Trizol 試劑提取RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并使用PrimeScript RT-PCR 試劑盒進(jìn)行PCR。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）被用作SRGAP1 mRNA 的內(nèi)部參照。進(jìn)行3 次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。通過2-ΔΔCT相對定量計算RNA 相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.6 SRGAP1 mRNA 表達(dá)的生存分析為驗(yàn)證SRGAP1 對卵巢癌患者預(yù)后的評價價值，利用Kaplan Meier plotter 在線生存分析網(wǎng)站（https://kmplot.com/analysis/）對卵巢癌患者的相關(guān)臨床數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析。設(shè)置條件如下，①Cancer type：Ovarian cancer；②Gene：SRGAP1（1555875_at）；③Survival：總生存期（overallsurvival，OS）（n=1657），無進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）（n=1 436）和進(jìn)展后生存期（post progression survival，PPS）（n=782）；④其他條件為默認(rèn)設(shè)定。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)使用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，3 組間比較采用方差分析，2 組間比較采用獨(dú)立樣本均數(shù)的t 檢驗(yàn)。定性資料用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier plotter 分析法及Log-rank 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SRGAP1 在卵巢良性囊腫組織、卵巢癌組織及腹膜轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)免疫組織化學(xué)染色顯示，SRGAP1 在卵巢良性囊腫組織中不表達(dá)或呈弱陽性表達(dá)，在卵巢癌組織及腹膜轉(zhuǎn)移組織中免疫染色陽性物質(zhì)明顯增強(qiáng)，呈淡黃色至棕褐色片狀，主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞膜和細(xì)胞核少見（見圖1A）。卵巢良性囊腫組織、卵巢癌組織和卵巢癌腹膜轉(zhuǎn)移組織中SRGAP1 H-score 評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=12.00，P＜0.05）。卵巢癌組織的SRGAP1 H-score 評分高于卵巢良性囊腫組織（t=2.16，P＜0.05），且腹膜轉(zhuǎn)移組織的SRGAP1 H-score 評分顯著高于卵巢癌組織（t=3.24，P＜0.05）（見圖1B）。Western Blotting 證實(shí)卵巢良性囊腫組織、卵巢癌和配對的腹膜轉(zhuǎn)移組織中SRGAP1 蛋白相對表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=38.19，P＜0.05），卵巢癌中SRGAP1 蛋白表達(dá)水平高于卵巢良性囊腫組織（t=3.23，P＜0.05），且腹膜轉(zhuǎn)移組織的SRGAP1 蛋白表達(dá)水平高于卵巢癌組織（t=4.53，P＜0.05），見圖1C～D）。qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)證實(shí)3組中SRGAP1 mRNA 相對表達(dá)水平的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=56.13，P＜0.05），卵巢癌中SRGAP1 mRNA表達(dá)水平高于卵巢良性囊腫組織（t=19.05，P＜0.05），且腹膜轉(zhuǎn)移組織的SRGAP1 mRNA 表達(dá)水平高于卵巢癌組織（t=3.96，P＜0.05），見圖1E。

圖1 SRGAP1 在卵巢良性囊腫組織、卵巢癌組織和卵巢癌腹膜轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)情況

2.2 SRGAP1 表達(dá)水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系在116 例卵巢癌患者中，以H-score 評分的中位數(shù)為界限，分為SRGAP1 高表達(dá)和低表達(dá)，SRGAP1 高表達(dá)患者77 例，占66.38%，低表達(dá)患者39 例，占33.62%。對SRGAP1 高表達(dá)和低表達(dá)患者的臨床病理特征進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，2 組患者的組織學(xué)分型和病理學(xué)分級比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），年齡、分期或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表2。

表2 116 例卵巢癌患者SRGAP1 表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 [例（%）]

2.3 SRGAP1 與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系本研究存在一定局限性，部分患者未接受電話隨訪，故未利用本研究的病例進(jìn)行預(yù)后分析。為了探究SRGAP1對卵巢癌患者預(yù)后的相關(guān)性，利用Kaplan Meier plotter 在線生存分析網(wǎng)站分析，結(jié)果顯示，SRGAP1低表達(dá)組較高表達(dá)組OS（P=0.000 82，HR=1.53，見圖2A）和PFS（P=0.000 24，HR=1.5，見圖2B）均顯著增加。SRGAP1 低表達(dá)組較高表達(dá)卵巢癌患者有較好的PPS，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.054，HR=1.32）（見圖2C）。

圖2 SRGAP1 表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后的生存分析

3 討論

卵巢癌發(fā)病機(jī)制不明，其分子機(jī)制近年成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，如卵巢癌易感基因（BRCA）、P53和人附睪蛋白4（human epididymis protein 4，HE4）基因的表達(dá)異常。因此，迫切需要深入探索卵巢癌早期診斷的特異性腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。SRGAP1 是在軸突引導(dǎo)和細(xì)胞遷移中介導(dǎo)Slit2-Robo1 下游信號通路的重要組成部分，由含有氨基（N）末端的FBAR 結(jié)構(gòu)域、羧基（C）末端SH3 結(jié)構(gòu)域和RhoGAP結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[11]。Slit-Robo 信號通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要生物學(xué)功能，如干預(yù)腫瘤細(xì)胞黏附、遷移和凋亡，以及促進(jìn)腫瘤血管形成等[12]。

3.1 SRGAP1 在卵巢癌中的表達(dá)全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome wide association study，GWAS）發(fā)現(xiàn)SRGAP1 內(nèi)含子中的SNP 位點(diǎn)rs11175194 是中國漢族女性上皮性卵巢癌的易感基因[13]，表明SRGAP1與上皮性卵巢癌的發(fā)病有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，SRGAP1在卵巢癌和腹膜轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)水平高于卵巢良性囊腫組織，與卵巢癌組織相比，SRGAP1 在腹膜轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)進(jìn)一步增加。表明卵巢癌患者組織病變會誘導(dǎo)SRGAP1 蛋白的表達(dá)，并且腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)中的SRGAP1 釋放至胞外，可能促進(jìn)癌癥進(jìn)展。Huang 等[7]發(fā)現(xiàn)SRGAP1 在胃癌的發(fā)生過程中過表達(dá)，介導(dǎo)微小RNA-340（miR-340）和miR-124 的表觀遺傳沉默，并通過激活Wnt/β-catenin 通路發(fā)揮致癌作用。SRGAP1 的過表達(dá)可能改變腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)并且激活相關(guān)通路。SRGAP1 在胃癌中表達(dá)同樣上調(diào)，與本研究類似。Wnt/β-catenin 信號通路是與癌癥有關(guān)的一個重要級聯(lián)反應(yīng)，其被抑制與腫瘤干細(xì)胞的起始、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移以及人類惡性腫瘤的耐藥性密切相關(guān)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin 通路參與介導(dǎo)卵巢癌的發(fā)展及耐藥[15-17]。本研究通過Western blotting 和qRT-PCR 技術(shù)發(fā)現(xiàn)SRGAP1 在卵巢良性囊腫、卵巢癌及腹膜轉(zhuǎn)移組織中的蛋白和mRNA 表達(dá)水平依次遞增，進(jìn)一步驗(yàn)證了SRGAP1 在蛋白和基因?qū)用娴谋磉_(dá)情況。分析發(fā)現(xiàn)，SRGAP1 的表達(dá)與患者的組織學(xué)分型和病理學(xué)分級有顯著差異，但與患者年齡、FIGO 分期和是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。這提示SRGAP1 蛋白表達(dá)可能影響卵巢癌的病理分級，加劇癌細(xì)胞的擴(kuò)散。Li 等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞癌組織中SRGAP1 和SRGAP2 的表達(dá)水平均顯著高于正常人，且SRGAP2 在mRNA 和蛋白水平均顯著上調(diào)。此外，SRGAP2 的升高與肝細(xì)胞癌的臨床分期密切相關(guān)，并與肝癌患者的臨床預(yù)后負(fù)相關(guān)，本研究結(jié)果與之相似。

3.2 SRGAP1 對卵巢癌患者的預(yù)后判斷通過線上數(shù)據(jù)庫Kaplan-Meier 曲線分析，發(fā)現(xiàn)在OS 和PFS這2 個指標(biāo)中，SRGAP1 高表達(dá)的卵巢癌患者生存期均降低。說明SRGAP1 基因高表達(dá)是卵巢癌預(yù)后的危險因素，提示SRGAP1 作為預(yù)后的診斷標(biāo)志物具備一定的應(yīng)用前景。但Feng 等[19]發(fā)現(xiàn)SRGAP1 在結(jié)直腸癌中起作用，其下調(diào)減弱了細(xì)胞分裂周期蛋白42（cell division control protein 42，CDC42）的抑制作用，并且SRGAP1 的下調(diào)與腫瘤進(jìn)展和預(yù)后不良有關(guān)，該研究認(rèn)為SRGAP1 是結(jié)直腸癌的腫瘤抑制因子，與本研究結(jié)果相反。CDC42 是典型的Rho 家族成員，SRGAP1 通過與CDC42 相互作用參與RhoA 活性的調(diào)節(jié)，CDC42 已被證明在癌癥發(fā)展中發(fā)揮重要作用[20]。值得注意的是，CDC42 陽性的巨噬細(xì)胞存在于大多數(shù)與癌無關(guān)的子宮內(nèi)膜異位癥囊腫中，并且可以預(yù)防卵巢子宮內(nèi)膜異位的惡性轉(zhuǎn)化[21]。綜上，Slit-Robo 信號通路調(diào)控卵巢癌是個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，具體的微觀調(diào)控有待進(jìn)一步探究。此外，有研究發(fā)現(xiàn)SRGAP1 可以促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞系SKOV3 和OVCA432 的增殖，但SRGAP1 對下游GTP 酶活性調(diào)節(jié)的具體機(jī)制仍然未知[22]，推測SRGAP1 可能通過促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖等惡性生物學(xué)行為影響卵巢癌進(jìn)展。

綜上，本研究證實(shí)SRGAP1 在卵巢癌中表達(dá)水平上調(diào)，其表達(dá)水平與組織學(xué)分型和病理學(xué)分級有關(guān)，SRGAP1 高表達(dá)與卵巢癌患者的不良預(yù)后有關(guān)，是潛在的監(jiān)測病情及判斷預(yù)后的分子指標(biāo)。然而，SRGAP1 影響卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制仍需體內(nèi)外的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究。