成 昭 ，程詩雅，尉祎雯，馮凱茵，張雪嬌

（西安醫(yī)學院藥學院,陜西西安710021）

在人工粘合材料的合成與應用研究中,目標材料的合成可修飾性與線路設計[1-2]、材料的粘合性能與生物相容性[3-4]一直是該領域研究的兩個主要關注點?；谏飦碓凑澈喜牧?進行仿生合成設計與合成線路優(yōu)化,一方面能夠保證所合成材料的生物親合性能,降低人工合成材料的細胞毒性及可能免疫應激反應,另一方面便于以合成設計思路調控材料結構、簡化合成步驟,增強人工合成材料結構的可修飾性。同時,人工合成材料來源單純,其結構與分子量均處于一定的可調控范圍,相較于生物來源材料的復雜性[5],便于設計精準實驗方案、系統(tǒng)考查合成材料的穩(wěn)定性與毒性,建立仿生粘合材料在生命體環(huán)境中的安全性和適用性的系統(tǒng)評價參數(shù)。

貽貝依靠其絲足腺黏液,表現(xiàn)出強大的生物粘合性能[6]。貽貝分泌的生物粘合劑主要成分為貽貝粘合蛋白(mussel adhesive protein,MAP),其結構中包含高化學活性的粘合單元鄰二酚[7],通過鄰二酚在水環(huán)境中的離解與帶電[8]、氧化與交聯(lián)[9]等作用過程,實現(xiàn)貽貝在巖石、鋼鐵、玻璃等多種材料界面的穩(wěn)定粘合[10-11]。基于仿生合成手段,設計在人工合成粘合劑中引入鄰二酚粘合單元[12],降低合成材料的細胞毒性及可能免疫應激反應,改善人工粘合劑的粘附與生物相容性能。同時,引入具有較高化學修飾性的聚氨酯片段、簡化合成步驟。通過高分子基體合成與粘合單元引入等合成步驟,得到一種新型MAP仿生粘合材料,并進行合成路線設計、材料熱穩(wěn)定性與細胞毒性考查,初步評價了該仿生粘合材料進一步應用于生命體環(huán)境的安全性和適用性[13]。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：TENSOR T-27傅里葉變換紅外分光光度計(德國BRUKER)；AVANCE Ⅲ超導核磁共振波譜儀(德國BRUKER,400MHz,溶劑DMSO-d6,內(nèi)標TMS)；PLGPC50凝膠滲透色譜儀(美國Agilent Technologie)；PE-TGA7熱失重分析儀(美國Perkin Elmer)；1510 Mwltiskan Go多功能酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Thermo Fisher)。

試劑：異佛爾酮二異氰酸酯(IPDI)、聚丙二醇1000(PPG 1000)、二羥甲基丙酸(DMPA)、二丁基二月桂酸錫(DBTL)、N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、多巴胺鹽酸鹽、三乙胺等試劑,DMF、DMSO等反應溶劑,均為分析純,購自阿拉丁試劑有限公司。

1.2 合成

通過擴鏈、偶聯(lián)兩步主要反應,合成得到一種新型MAP仿生粘合材料（圖1）。

如合成路線圖1所示,擴鏈過程首先經(jīng)由1）IPDI氰鍵與PPG 1000羥基作用得到聚氨酯預聚物（化合物1）,再經(jīng)2）化合物1與擴鏈劑DMPA、縮合劑DCC、催化劑DBTL共同作用,得到聚氨酯預聚物的擴鏈產(chǎn)物（化合物2）；在擴鏈產(chǎn)物（化合物2）的結構基礎上,為了接入鄰二酚粘合單元、實現(xiàn)材料功能修飾,同時,進一步調控目標粘合材料的分子量,經(jīng)由3）偶聯(lián)過程進行目標粘合材料的側鏈修飾,得到了一種MAP高分子仿生粘合材料（化合物3）。

圖1 MAP仿生粘合材料的合成路徑Fig. 1 Synthetic route of the biomimetic MAP adhesive material

基于MAP中鄰二酚結構離解吸附與氧化交聯(lián)共同作用的粘合機制,進行仿生合成設計,能夠初步保證目標粘合材料（化合物3）的低毒性及生物相容性；同時,進行擴鏈、偶聯(lián)的分步合成,實現(xiàn)了對合成路線的分段調控,加強了粘合材料合成的可修飾性,為人工粘合材料未來研發(fā)工作中的分節(jié)點合成與功能化修飾提供了參考。

1.2.1 聚氨酯預聚物（化合物1）的合成[14]

DMF為溶劑、氮氣保護下,將物質的量之比為2：1.2的IPDI與PPG 1000混合均勻,反應6h后,減壓蒸餾,得到無色至淺黃色的油狀物,即為聚氨酯預聚物（化合物1）。

1.2.2 聚氨酯預聚物擴鏈產(chǎn)物（化合物2）的合成

DMF為溶劑、氮氣保護下,將物質的量之比為1：2：0.2的聚氨酯預聚物（化合物1）、DMPA、DBTL混合均勻,反應3h,得到無色至淺黃色油狀物,即為聚氨酯預聚物擴鏈產(chǎn)物（化合物2）。

1.2.3 目標MAP粘合材料（化合物3）的合成

DMF為溶劑、氮氣保護下,將物質的量之比為1：0.12：1:0.1：15的聚氨酯預聚物擴鏈產(chǎn)物（化合物2）、DCC、多巴胺鹽酸鹽、三乙胺、DMF混合均勻,反應8h后,得到粗產(chǎn)物沉淀。進行粗產(chǎn)物的酸洗、透析,得到目標MAP粘合材料（化合物3）,為淺黃色油狀物。

2 結果與討論

2.1 結構表征

2.1.1 IR與枝節(jié)率

以KBr壓片法對所合成的MAP粘合材料進行IR測定,得到圖2。無論合成條件如何改變（如圖2中淺灰、灰、黑色所標注的投料比變化以及催化劑DBTL加入與否）,3400～3500 cm-1處酚羥基與1600～1700 cm-1處酰胺鍵的特征吸收峰均有出現(xiàn),只是呈現(xiàn)百分透過率,即吸收峰強度的差別。

圖2 MAP粘合材料的紅光吸收光譜Fig. 2 IR spectra of the MAP adhesive material

對比圖2中所標注的淺灰、灰、黑色3個系列的吸收譜線,可知：1）在化合物2的合成中,控制催化劑DBTL加入量及其他反應條件不變,僅調控化合物1與DMPA的投料比,即初始反應物PPG 1000（與化合物1物質的量近似相當）與DMPA的投料比分別為PPG 1000：DMPA=1：1與1：3時,得到相應為灰色（PPG 1000：DMPA=1：1）與黑色（PPG 1000：DMAP=1：3）標注的2個系列吸收譜線,其中,各官能團特征吸收峰的百分透過率呈現(xiàn)明顯差異；2）進一步對比催化劑未加入的淺灰色系列與催化劑加入的灰色/黑色系列,也呈現(xiàn)類似的官能團吸收峰強度差別。綜合1）與2）兩方面差別,能夠對目標MAP粘合材料側鏈中、鄰二酚粘合單元的接入量做出初步判斷,同時,能夠對催化劑DBTL影響聚氨酯預聚物進行擴鏈反應時的枝節(jié)率做出分析,還可進一步實現(xiàn)對枝節(jié)率與MAP材料粘合性能相關性的分析。人工粘合材料的未來研發(fā),將可圍繞著催化劑品類與性能的改變、催化劑加入量的調控等方向進行,實現(xiàn)對粘合性、枝節(jié)率等性能參數(shù)的進一步調控。

2.1.21H NMR

DMSO-d6做溶劑、TMS為內(nèi)標,對所合成的MAP粘合材料進行1H NMR測定,得到其核磁共振氫譜,特征氫的化學位移如圖3所示標注。其中,δ=8.28與～3.70分別對應于羧基與酚羥基中活潑氫的特征位移,說明MAP粘合材料的側鏈結構中,已通過聚氨酯預聚物擴鏈產(chǎn)物（化合物2）與多巴胺鹽酸鹽的擴鏈反應,成功接入了鄰二酚粘合功能單元。

圖3 催化劑DBTL加入與未加入時MAP粘合材料的核磁共振氫譜Fig. 3 1H NMR spectra of the MAP adhesive material with and without DBTL catalyst

此外,對圖3中(PPG 1000-IPDI): DMPA 分別為1：1與1：3的2個系列譜線對比可知,保持測樣量一致時,增加擴鏈劑DMPA在擴鏈反應中的用量,得到 (PPG 1000-IPDI)：DMPA=1：3系列的譜線強度顯著增強,再結合圖2中的官能團特征吸收峰強度隨投料比的相應變化,能夠對擴鏈反應中影響粘合材料枝節(jié)率的兩種影響因素做出進一步判斷,即催化劑DBTL與擴鏈劑DMPA均能顯著提高目標MAP粘合材料的枝節(jié)率,從而進一步影響其粘合性能。

2.1.3 GPC與分子量分布

以聚苯乙烯為標準聚合物,流動相為含0.01 mol/L溴化鋰的DMF(流速1.0 mL/min),40°C下、進行所合成MAP粘合材料的GPC測定,得到表示聚合物分子量及其分布的圖4及表1。其中,由表1中接近于1的多分散指數(shù)PD=Mw/Mn可知,所合成的MAP高分子粘合材料聚合分布均勻,其黏均摩爾質量Mv=1193。

圖4 MAP粘合材料的凝膠滲透色譜Fig. 4 Gel permeation chromatography of the MAP adhesive material

表1 MAP粘合材料的分子量及分布Table 1 Molecular weight and distribution of the MAP adhesive material

2.2 粘合材料穩(wěn)定性與安全性評價

2.2.1 熱穩(wěn)定性

氮氣條件下,進行所合成MAP粘合材料的熱失重分析(樣品用量5mg,升溫速率20°C/min,溫度范圍40～600 °C),得到圖5。

圖5 MAP粘合材料的熱重分析曲線Fig. 5 Thermogravimetry curve of the MAP adhesive material

由圖5可見,所合成材料的熱失重曲線平滑、連續(xù),具有良好的穩(wěn)定性,表現(xiàn)出與彈性體熱穩(wěn)定趨勢的一些相似性[15-16]。兩個熱失重段分別處于1）150～250 °C與2）250～350 °C,分別對應于聚氨酯材料結構中1）因IPDI和DMPA分解而產(chǎn)生的軟段熱失重,以及2）由于PPG 1000分解所形成的硬段熱失重。

2.2.2 細胞毒性

將對數(shù)生長期的EVC304細胞接種于96孔板,于37°C、5%CO2及90%濕度條件下培養(yǎng)24h,待細胞貼壁后更換新培養(yǎng)基,再加入所合成粘合材料的DMF溶液,進行目標材料的濃度梯度分組,每組濃度設6個平行孔,使各組中的粘合材料終質量濃度分別為125、250、500、1000、2000、4000 μg/L,對照組則加入等體積溶劑。于37°C恒溫培養(yǎng)箱中,將上述加樣后的96孔板培養(yǎng)24h,去除培養(yǎng)基,每孔加入配置好的20μL MTT溶液和180μL培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)4h。移去上清液后,每孔加入150μL二甲基亞砜,震蕩10min(頻率60次/min),測定490nm處的吸光度數(shù)值[17-18],計算細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率(%)=(1-吸光度實驗組/吸光度對照組)× 100%,繪制得到所合成MAP粘合材料對體外ECV304細胞的增殖抑制曲線（圖6）。結果顯示,所合成MAP粘合材料在ECV304細胞中的增殖抑制作用隨自身濃度增加而增大,就其濃度增幅的整體趨勢而言,該合成材料呈現(xiàn)低毒性[19]。

圖6 MAP粘合材料對ECV304細胞的24h增殖抑制作用Fig. 6 Cytotoxicity of the MAP adhesive material on ECV304 at 24h

3 結論

基于MAP鄰二酚結構離解吸附與氧化交聯(lián)共同作用的粘合機理,經(jīng)由仿生合成路徑得到一種MAP型粘合材料,以熱失重分析、MTT實驗初步評價所合成粘合材料的熱穩(wěn)定性與生物安全性,同時,通過IR、1H NMR、GPC等表征該粘合材料結構。綜合實驗結果,合成得到的MAP型粘合材料表現(xiàn)良好的熱穩(wěn)定性與低毒性,具有進一步應用于生物醫(yī)學領域、進行快速粘合修復的良好前景。

該粘合材料經(jīng)由擴鏈、偶聯(lián)的分步合成方法,實現(xiàn)了對合成路線的分段調控,加強了粘合材料合成的可修飾性,為人工粘合材料未來研發(fā)工作中的分節(jié)點合成與功能化修飾提供了參考。