于永洋 張福星 劉昭暉 黃耘 王思力

(廈門大學附屬第一醫(yī)院 1普外科，福建 廈門 361000；2血液科)

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，多發(fā)于中老年人，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率在所有惡性腫瘤中均位于第5位，且還在呈上升的趨勢〔1〕。由于早期結(jié)直腸癌可無明顯癥狀，待病情發(fā)展至一定階段時才會出現(xiàn)排便習慣改變、血便、腹痛等缺乏特異性的癥狀，因此大部分患者都是在中晚期才確診，錯過了最佳治療的時機〔2〕。據(jù)統(tǒng)計在疾病早期結(jié)直腸癌的5年生存率為95%，而晚期則下降到35%〔3〕，由此可見盡早診斷對改善患者的預后具有重要的意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)可參與調(diào)控DNA甲基化、基因組印記、組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾等，目前已有研究證實〔4，5〕，lncRNA在多種惡性腫瘤中均存在表達失調(diào)，并對疾病的發(fā)生、發(fā)展起到重要的作用。lncRNA小核仁RNA宿主基因(SNHG)5是與多種惡性腫瘤密切相關的lncRNA，相關研究顯示〔6〕，外周血中l(wèi)ncRNA SNHG5對非小細胞肺癌有較高的診斷價值，細胞實驗證實〔7〕，lncRNA SNHG5可促進結(jié)直腸癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和遷徙。然而目前尚不清楚血清lncRNA SNHG5對結(jié)直腸癌是否有輔助診斷價值，本研究旨在分析血清lncRNA SNHG5與老年結(jié)直腸癌患者臨床病理的關系，并分析其與腫瘤標志物對結(jié)直腸癌的診斷價值。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取2018年1月至2020年4月在廈門大學附屬第一醫(yī)院接受治療的結(jié)直腸癌患者74例作為結(jié)直腸癌組，另選取30例同時期在廈門大學附屬第一醫(yī)院接受治療的結(jié)直腸息肉患者作為息肉對照組，30例同時期在廈門大學附屬第一醫(yī)院體檢的健康志愿者作為健康對照組。3組一般資料均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見表1。納入標準：①所有患者經(jīng)病理確診；②入組前未接受放化療等任何形式的治療；③均為首次發(fā)??；④均為年齡>60歲的老年患者；⑤對本次研究內(nèi)容知情同意。排除標準：①合并有血液系統(tǒng)疾病、免疫功能障礙者；②合并有除結(jié)直腸癌之外的惡性腫瘤；③合并肝腎等重要臟器功能不全者；④合并全身感染性疾病者。

表1 3組一般資料比較

1.2方法 抽取3組空腹狀態(tài)下的靜脈血5 ml，離心10 min(3 000 r/min)后提取血清，置于-70℃的冰箱中保存待測。采用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取血清中的總RNA，在分光光度計(Thermofisher公司，ND1000)確定RNA純度和濃度，結(jié)果滿意后進行逆轉(zhuǎn)錄反應，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTM RT Master Mix)對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄反應得到cDNA，采用實時熒光定量PCR法檢測血清lncRNA SNHG5的相對表達量。lncRNA SNHG5的引物如下，正向：5′-TACTGGCTGCGCACTTCG-3′，反向：5′-CAGTAAAAGGGGAACACCA-3′；內(nèi)參基因 GAPDH的引物如下，正向：5′-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3′，反 向 ：5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′。反應條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)。采用2-ΔΔCt計算lncRNA SNHG5相對表達量。 采用全自動電化學發(fā)光免疫分析儀(Roche，E170)檢測血清癌胚抗原(CEA)及糖類抗原(CA)199的水平。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0軟件進行t檢驗、方差分析、LSD-t檢驗、Pearson相關分析。 受試者工作特征(ROC)曲線分析預測診斷評估價值。

2 結(jié) 果

2.1血清lncRNA SNHG5、CEA、CA199比較 3組血清lncRNA SNHG5、CEA、CA199整體比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.001)，結(jié)直腸癌組血清lncRNA SNHG5、CEA、CA199水平明顯高于息肉對照組和健康對照組(P<0.05)，息肉對照組和健康對照組的血清lncRNA SNHG5、CEA、CA199水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，P<0.001)，見表2。

表2 3組血清lncRNA SNHG5、CEA、CA199比較

2.2結(jié)直腸癌患者血清lncRNA SNHG5與臨床病理特征的關系 結(jié)直腸癌患者血清lncRNA SNHG5與性別、年齡均不相關(P>0.05)，與腫瘤直徑、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度有關(P<0.05)，見表3。

表3 結(jié)直腸癌患者血清lncRNA SNHG5與臨床病理特征的關系

2.3結(jié)直腸癌患者血清lncRNA SNHG5與CEA、CA199的相關性分析 結(jié)直腸癌患者血清lncRNA SNHG5與CEA、CA199均呈正相關(r=0.478、0.362，P=0.000、0.002)。

2.4血清lncRNA SNHG5與CEA、CA199對結(jié)直腸癌患者的診斷價值分析 進一步探討血清lncRNA SNHG5與CEA、CA199對結(jié)直腸癌患者的診斷價值，以結(jié)直腸癌組為陽性樣本，以健康對照組、息肉對照組為陰性樣本，建立ROC診斷分析模型。三指標均參考臨床實踐劃分成8～12個組段。經(jīng)ROC曲線分析知：各指標均具有較高的診斷價值，LncRNA ROC曲線下面積(AUC)分別為0.784、0.763、0.746。聯(lián)合應用對結(jié)直腸癌患者的預測/診斷價值：AUC為0.876。顯然其診斷效能比單一指標均有明顯提高。見表4和圖1。

表4 血清lncRNA SNHG5與CEA、CA199對結(jié)直腸癌患者的診斷價值分析

圖1 血清lncRNA SNHG5與CEA、CA199診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線

3 討 論

2018年結(jié)直腸癌新發(fā)病例約128萬，死亡病例約88萬，我國是結(jié)直腸癌高發(fā)的國家，發(fā)病率和死亡例數(shù)均位居全球第一〔8，9〕。血清腫瘤標志物檢測是臨床診斷惡性腫瘤的重要手段，《中國結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2017年版)》中明確指出結(jié)直腸癌患者在診斷、治療前、評價療效和隨訪時必須檢測相關腫瘤標志物：CEA及CA199〔10〕，但采用CEA、CA199診斷依然存在一定的誤診和漏診的情況，其診斷價值有待進一步提高。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，lncRNA逐漸成為惡性腫瘤領域研究的熱點，部分lncRNA與腫瘤的惡性增殖、侵襲浸潤等多種生物學活動密切相關，結(jié)腸癌相關轉(zhuǎn)錄因子1、肺癌轉(zhuǎn)移相關轉(zhuǎn)錄本1等lncRNA已被證實具有早期輔助診斷結(jié)直腸癌的潛力〔11，12〕。由于lncRNA可在血液樣本中穩(wěn)定表達，具有臨床取樣方便、重復性好等特點，且部分lncRNA可在腫瘤早期即異常表達，因此lncRNA有望成為結(jié)直腸癌診斷、治療和預后評估的新型分子標志物，具有較為廣闊的研究和應用前景。

lncRNA SNHG5位于染色體6q14.3上，長度為524 bp，含有6個外顯子，具有完整剪接U50宿主基因的能力〔13〕。lncRNA SNHG5是一種與惡性腫瘤密切相關的lncRNA，但其在不同惡性腫瘤中發(fā)揮的作用有所差異〔14〕。Chi等〔15〕發(fā)現(xiàn)，lncRNA SNHG5在乳腺癌中表達上調(diào)，且可通過調(diào)控增殖細胞核抗原的表達促進乳腺癌細胞增殖。細胞實驗發(fā)現(xiàn)〔16〕，抑制黑素瘤細胞系中l(wèi)ncRNA SNHG5的表達可促進細胞凋亡，并能抑制細胞的增殖和侵襲能力。然而在胃癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG5表達下調(diào)，且其具有抑制胃癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的能力〔17〕。在肺腺癌中增加lncRNA SNHG5的表達則可增加癌細胞對吉非替尼的敏感性〔18〕。本研究結(jié)果顯示，血清lncRNA SNHG5水平表達越高預示著更大的腫瘤直徑、更高的分期、更低的分化程度及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這均提示lncRNA SNHG5在結(jié)直腸癌中是一種促癌因子。Zhang等〔7〕研究顯示，lncRNA SNHG5可通過調(diào)控微小RNA-132-3p影響CAMP反應元件結(jié)合蛋白5的表達，進而促進結(jié)直腸癌的惡性進展。而Damas等〔19〕研究顯示，lncRNA SNHG5的缺失可導致結(jié)直腸癌細胞周期阻滯，抑制腫瘤的生長，且過表達lncRNA SNHG5可增加癌細胞對奧沙利鉑的耐藥性。由此可見，lncRNA SNHG5是一種與結(jié)直腸癌密切相關的lncRNA，可促進疾病的惡性進展，有作為診斷結(jié)直腸癌生物標志物的潛力。本研究通過ROC分析發(fā)現(xiàn)，血清lncRNA SNHG5診斷結(jié)直腸癌的價值較高，曲線下面積為0.784，但其敏感度還有待進一步提升。由于單一生物標志診斷具有一定的局限性，目前多項生物標志物聯(lián)合診斷已成為趨勢所在〔20〕，本研究進一步發(fā)現(xiàn)，lncRNA SNHG5、CEA、CA199三指標聯(lián)合可有效提升對結(jié)直腸癌的診斷價值，提示三指標聯(lián)合檢測對結(jié)直腸癌有較高的輔助診斷價值，具有一定的臨床應用前景。