穆燕， 趙文君， 艾鑫， 律鳳霞

(牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157012)

紅菇(RussulalepidaFr.)屬擔(dān)子菌綱、傘菌目、紅菇科，秋季林下群生或單生的菌根真菌。廣泛分布于我國(guó)各林地。子實(shí)體含有5種多糖、28種脂肪酸，富含蛋白質(zhì)和倍半萜等活性物質(zhì)。味甘性溫，長(zhǎng)期食用可益壽延年，有滋陰補(bǔ)虛、清涼解毒、抑抗腫瘤的功效，少數(shù)有毒[1-2]。紅菇較高的食藥用價(jià)值倍受食用者和學(xué)者們的關(guān)注和研究，而紅菇的季節(jié)性出菇和人工栽培的低產(chǎn)特性限制了其價(jià)值應(yīng)用。有學(xué)者研究及報(bào)道證實(shí)，許多大型真菌具有天然的抑病菌效果，既能提供食藥用成份[3-4]，也可替代抑菌防腐的化學(xué)藥劑，達(dá)到植物病害生物防治的目的[5-6]。實(shí)驗(yàn)分離純化野生紅菇菌絲體，對(duì)其代謝物質(zhì)抑制植物病原真菌的作用進(jìn)行了初步研究，探討紅菇菌絲體在植物病害防治中的應(yīng)用價(jià)值[7]，為彌補(bǔ)紅菇子實(shí)體季節(jié)性缺失提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

紅菇菇蕾：秋季野生蘑菇生長(zhǎng)季節(jié)林下采集。

真菌DNA 提取試劑盒：QIAGEN公司產(chǎn)品；

PCR Mix試劑盒：寶生物有限公司產(chǎn)品；

水稻稻瘟菌：牡丹江師范學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

其他常用試劑：國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器及培養(yǎng)基

分析天平；恒溫振蕩培養(yǎng)箱；自動(dòng)高溫蒸汽滅菌鍋；超凈工作臺(tái)；PCR擴(kuò)增儀；恒溫水浴鍋等。

孟加拉紅培養(yǎng)基(分離純化時(shí)使用抑細(xì)菌)：葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂(無(wú)水)0.5 g、瓊脂20 g、孟加拉紅0.03 g、氯霉素0.1 g(乙醇溶解后加入)，定容至1000 mL，分裝后滅菌備用。

PDA培養(yǎng)基(抑菌培養(yǎng)時(shí)使用)：200 g去皮馬鈴薯(加水煮沸10 min取濾液)、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、定容至1000 mL，分裝后滅菌備用。

2 試驗(yàn)方法

2.1 野生紅菇菇蕾(子實(shí)體)采集及組織分離

組織法分離菌絲[8-10]：野外采集的紅菇菇蕾帶回實(shí)驗(yàn)室，無(wú)菌環(huán)境下75%酒精快速清洗菇體表面，徒手掰開菌蓋，無(wú)菌刀割取內(nèi)部菌肉組織，接種至孟加拉紅培養(yǎng)基平板中，恒溫(26 ℃)倒置暗培養(yǎng)，隨時(shí)觀察菌絲生長(zhǎng)及是否污染，多次轉(zhuǎn)接篩選菌落單一無(wú)污染的培養(yǎng)平板。

2.2 紅菇菌絲體與子實(shí)體遺傳同一性鑒定

菌落單一無(wú)污染的分離培養(yǎng)物繼續(xù)暗培養(yǎng)至菌膜形成，分別提取子實(shí)體和菌膜DNA， 以真菌ITS通識(shí)引物對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件如表1。

表1 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠(1%)電泳，目的條帶清晰的PCR產(chǎn)物外送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI網(wǎng)站BLAST比對(duì)，確定所測(cè)序列的種屬并驗(yàn)證菌絲體和子實(shí)體序列是否同一[11-12]。

2.3 紅菇代謝液制備及pH值測(cè)定

分離純菌絲體轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基，恒溫振蕩培養(yǎng)(26 ℃，150 r/min)，10 d后每隔2 d無(wú)菌條件下取培養(yǎng)液測(cè)pH值，直到培養(yǎng)液pH值趨于恒定(約20 d)，培養(yǎng)液無(wú)菌條件過(guò)濾備用。

2.4 紅菇與水稻稻瘟菌的抑菌實(shí)驗(yàn)

對(duì)峙培養(yǎng)：用記號(hào)筆將無(wú)菌培養(yǎng)皿(直徑9 cm)底皿在直徑上平分三段標(biāo)記兩個(gè)三分點(diǎn)，無(wú)菌條件下倒PDA培養(yǎng)基平板，凝固后在兩個(gè)標(biāo)記點(diǎn)對(duì)應(yīng)接種紅菇和水稻稻瘟菌，兩菌塊相距3 cm；重復(fù)三板。封口膜封邊后倒置恒溫(26 ℃)暗培養(yǎng)，待兩個(gè)菌落生長(zhǎng)到彼此接觸后，觀察菌落形態(tài)及菌絲間的拮抗及抑制效果。

添加紅菇代謝液培養(yǎng)水稻稻瘟菌：將紅菇代謝液(2.2制備)按0 %、25 %、50 %、75%、100 %的濃度梯度添加到常規(guī)PDA培養(yǎng)基中，分別接種已活化的稻瘟病菌，三個(gè)重復(fù)，封口膜封邊恒溫暗培養(yǎng)，待稻瘟病菌明顯萌發(fā)后，每隔5 d測(cè)量稻瘟病菌菌落生長(zhǎng)直徑，計(jì)算抑菌率。

3 結(jié)果與分析

3.1 紅菇子實(shí)體形態(tài)特征初鑒別

野生紅菇子實(shí)體中等大小，菌蓋中部色深紅至暗(黑)紅，邊緣紅色較淡，菌肉白色，菌蓋表面覆少許鱗片，菌柄長(zhǎng)柱或稍彎曲，纖維質(zhì)，符合紅菇子實(shí)體表型特征(如圖1)。

圖1 野生紅菇子實(shí)體

3.2 紅菇組織分離培養(yǎng)

多次轉(zhuǎn)板分離的菌絲體在孟加拉紅培養(yǎng)基中呈現(xiàn)白色致密菌絲(如圖2)。

圖2 紅菇組織分離培養(yǎng)物

3.3 紅菇分離菌液體培養(yǎng)

紅菇純化菌恒溫振蕩液體培養(yǎng)15d后得到大小均勻的白色菌球，代謝液清澈，菌球清晰可見(如圖3)，pH值恒定為3.44，無(wú)菌過(guò)濾得清澈濾液。

圖3 紅菇分離菌液體培養(yǎng)

3.4 紅菇子實(shí)體及菌絲體DNA分子鑒定

分離菌菌膜與子實(shí)體同時(shí)提取DNA，以真菌ITS通識(shí)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分離(如圖4)。

圖4 DNA的PCR(真菌通識(shí)引物)產(chǎn)物電泳圖

圖5 PCR產(chǎn)物序列BLAST比對(duì)結(jié)果

1-2泳道：子實(shí)體DNA；3-4泳道：菌絲體DNA 見：子實(shí)體和菌絲體DNA的PCR產(chǎn)物在約700bp處出現(xiàn)目的條帶，測(cè)序后比對(duì)子實(shí)體和菌絲體PCR產(chǎn)物序列相同；測(cè)序序列經(jīng)網(wǎng)站Nucleotide BLAST比對(duì)，與網(wǎng)站公布MK532813.1同源性達(dá)100%，確定采集的子實(shí)體和分離的純培養(yǎng)物為東北紅菇[9](如圖4)。

3.5 紅菇對(duì)水稻稻瘟菌的抑菌效果

平板對(duì)峙培養(yǎng)如圖6-a所示：三組稻瘟菌菌絲生長(zhǎng)空間極小，即紅菇菌株對(duì)稻瘟菌生長(zhǎng)的抑制效果顯著，且明顯降解并阻抑了稻瘟菌黑色素分泌。

a為紅菇與稻瘟菌對(duì)峙試驗(yàn)；b為紅菇代謝液對(duì)稻瘟菌抑制試驗(yàn)

紅菇代謝液pH值恒定至3.44后無(wú)明顯變化，不同比例添加至PDA固體培養(yǎng)基接種稻瘟菌。圖6-b顯示：紅菇代謝液對(duì)稻瘟菌絲生長(zhǎng)有抑制作用但差異不顯著(表2)，而表現(xiàn)明顯的是添加代謝液的稻瘟菌均表現(xiàn)為氣生菌絲量增加，其原理及生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值有待后續(xù)研究驗(yàn)證；從培養(yǎng)皿背面圖可見：添加紅菇代謝液的稻瘟菌黑色素分泌均受顯著抑制，大于75 %添加量時(shí)對(duì)稻瘟菌黑色素分泌表現(xiàn)完全抑制效果。

表2 添加代謝液培養(yǎng)稻瘟菌菌落直徑及差異分析

4 結(jié)論

無(wú)需特殊培養(yǎng)條件，紅菇子實(shí)體經(jīng)組織分離可獲得遺傳一致的菌絲體及代謝液，紅菇菌株對(duì)水稻稻瘟菌有顯著的拮抗及抑制作用，其代謝液對(duì)稻溫菌的生長(zhǎng)量抑制不顯著，但可阻隔其黑色素分泌，而產(chǎn)生黑色素的植物病原真菌，其黑色素是侵染植物的必要條件，紅菇代謝液對(duì)不同致病菌抑菌效果的差異可通過(guò)提高添加濃度和純度進(jìn)一步進(jìn)行研究，但其產(chǎn)生酸性代謝液是其抑菌的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。因此紅菇及其代謝液在水稻稻瘟病生長(zhǎng)防治有研究應(yīng)用價(jià)值。菌絲體的培養(yǎng)彌補(bǔ)了子實(shí)體季節(jié)性生長(zhǎng)的限制，為野生紅菇的生物防治價(jià)值的研究應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。