李 磊,王延梅

1.滕州市疾病預(yù)防控制中心艾滋病防治科,山東滕州 277599;2.滕州市婦幼保健院兒童康復(fù)科,山東滕州 277599

隨著重癥患者高強(qiáng)度抗菌藥物的廣泛使用和介入等相關(guān)開放性操作的廣泛開展，凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)所致的血流感染發(fā)病率逐漸升高并且呈現(xiàn)出明顯的多重耐藥性，這不僅增加了治療的困難程度和成本，而且潛在的院內(nèi)交叉感染趨勢(shì)給醫(yī)院感染管理提出了新的挑戰(zhàn)[1-3]。有文獻(xiàn)報(bào)道，CNS在革蘭陽(yáng)性球菌所致的感染中，檢出率占比逐年升高，已達(dá)革蘭陽(yáng)性球菌總檢出率的30%以上，特別是耐甲氧西林的CNS(MRCNS)，其所占比例高達(dá)90%，故對(duì)CNS進(jìn)行耐藥基因的研究逐漸成為臨床關(guān)注的重點(diǎn)[2,4]。亦有研究指出，在重癥患者中，特別是老年和兒童患者，在接受介入治療或者存在留置通道的情況下，其MRCNS的感染更加普遍[5]，由于該類患者在藥物的選擇使用上受到更多的限制，故迫切需要更多耐藥基因的相關(guān)研究，以更加全面地認(rèn)識(shí)相關(guān)菌株和更好地服務(wù)臨床。本研究嘗試探討血流感染CNS的耐藥性和耐藥基因，并對(duì)可能發(fā)生的MRCNS血流感染進(jìn)行危險(xiǎn)因素分析。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 選擇2017年1月至2020年1月臨床分離的CNS菌株共107株。詳細(xì)記錄每株菌株的來(lái)源，對(duì)應(yīng)患者的一般資料，包括體溫、白細(xì)胞數(shù)量、基礎(chǔ)疾病、導(dǎo)管使用、血清降鈣素原水平、血培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)時(shí)間、血培養(yǎng)送檢次數(shù)和陽(yáng)性次數(shù)、抗菌藥物使用和預(yù)后轉(zhuǎn)歸情況，根據(jù)文獻(xiàn)判斷其是否為污染菌[6]。將血培養(yǎng)分離的CNS菌株均轉(zhuǎn)種于菌株保存管，置于-70 ℃冰箱凍存，行雙人雙鎖管理并進(jìn)行使用登記和記錄。

1.2菌株鑒定和藥敏試驗(yàn) 使用美國(guó)BD公司的全自動(dòng)血培養(yǎng)儀進(jìn)行血液培養(yǎng)，血培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)后記錄報(bào)陽(yáng)時(shí)間，并進(jìn)行革蘭染色鏡檢和報(bào)陽(yáng)瓶的菌株分離培養(yǎng)，進(jìn)入病案系統(tǒng)記錄患者的相關(guān)臨床資料，分離培養(yǎng)后的純菌落使用質(zhì)譜儀(布魯克公司)進(jìn)行細(xì)菌鑒定。完成鑒定的菌株進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，采用紙片擴(kuò)散法(Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法)和E-test法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏紙片來(lái)自O(shè)xoid公司，E-test試劑條來(lái)自鄭州安圖生物工程股份有限公司，營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板使用MH平板，購(gòu)買自廣州迪景微生物科技有限公司。藥敏結(jié)果根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)2020年版(CLSI-2020)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。耐甲氧西林的判定亦采用CLSI-2020的標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌(ATCC25923和ATCC43300)，購(gòu)買自國(guó)家臨床檢驗(yàn)中心。

1.3耐藥基因檢測(cè)

1.3.1菌株DNA的制備 首先將菌株保存管復(fù)溫，并挑取少量的CNS菌懸液接種于MH平板上，培養(yǎng)16 h后，選取單個(gè)CNS菌落全部溶于含溶菌酶的核酸溶解緩沖液(TE)中，振蕩后37 ℃處理30 min，隨后100 ℃處理15 min，最后以12 000 r/min高速離心10 min，取上清液，-20 ℃保存待用，相關(guān)試劑購(gòu)買自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3.2基因擴(kuò)增體系與條件 基因擴(kuò)增的儀器使用珠海黑馬擴(kuò)增儀，試劑使用賽默飛世爾的全套試劑，包括DNA聚合酶(Taq酶)、脫氧核糖核苷酸(dNTPs)、鎂離子等。擴(kuò)增體系設(shè)定為25 μL，其中包括2倍濃度的預(yù)混溶液12.5 μL，Taq酶1 μL，正反向引物各1 μL，細(xì)菌DNA 1 μL，無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足總體系至25 μL，混勻電離后放入擴(kuò)增儀中。反應(yīng)條件設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、52 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照無(wú)DNA模版，其他成分均相同；陽(yáng)性對(duì)照是含目的基因片段的DNA基因組。根據(jù)是否擴(kuò)增出目的條帶來(lái)確定基因陽(yáng)性菌株，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%凝膠電泳，紫外線燈下觀察擴(kuò)增產(chǎn)物并記錄結(jié)果。

1.3.3耐藥基因引物 檢測(cè)耐藥基因的引物，包括耐β-內(nèi)酰胺酶類基因mecA、耐四環(huán)素類基因tetM、耐氨基糖苷類基因aac(6′)/aph(2′)和aph3′-Ⅲ、耐大環(huán)內(nèi)酯類基因ermA和ermC、耐消毒劑類基因qacA/B/C和耐喹諾酮類基因gyrA。基因引物見表1。

表1 PCR引物序列與產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用Whonet5.0軟件對(duì)107株CNS菌株進(jìn)行耐藥性分析，數(shù)據(jù)分析使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)或者Fisher檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25,P75)表示，兩組間比較采用秩和檢驗(yàn)；采用Logistic回歸進(jìn)行影響因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1菌株特征 107株菌株均從患者血培養(yǎng)中分離，其中表皮葡萄球菌42株，溶血葡萄球菌31株，人葡萄球菌23株，頭狀葡萄球菌11株。107株中最終確定為感染菌株70株(感染組)，37株為可疑污染菌株(可疑組)，即根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)和檢查結(jié)果等判斷，污染的可能性大，但仍然執(zhí)行藥敏試驗(yàn)，報(bào)告藥敏結(jié)果，可疑污染菌株占比為34.6%。菌株來(lái)源患者的性別分布為男63例，女44例；科室分布為重癥監(jiān)護(hù)室64例，腎內(nèi)科23例，神經(jīng)外科8例，兒科8例，其他科室4例。70株感染菌株中MRCNS為53株，37株可疑污染菌株中MRCNS為32株，兩組MRCNS所占比例的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2兩組菌株耐藥性的比較 兩組菌株在青霉素G、克林霉素、紅霉素、呋喃妥因、萬(wàn)古霉素、利奈唑胺、替考拉寧以及奎奴普丁/達(dá)托霉素的比較中，耐藥率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在慶大霉素、左旋氧氟沙星、環(huán)丙沙星、莫西沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑和四環(huán)素的比較中，感染組的耐藥率明顯低于可疑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組菌株耐藥性的比較

2.3兩組菌株的耐藥基因攜帶率比較 兩組菌株耐β-內(nèi)酰胺酶類基因mecA、耐氨基糖苷類基因aph3′-Ⅲ、耐大環(huán)內(nèi)酯類基因ermA和ermC的攜帶率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而在耐喹諾酮類基因gyrA、耐四環(huán)素類基因tetM和耐氨基糖苷類基因aac(6′)/aph(2′)的攜帶率比較中，可疑組明顯高于感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；感染組耐消毒劑類基因qacA/B/C的攜帶率為62.9%，明顯高于可疑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組菌株的耐藥基因攜帶率比較

2.4耐藥基因mecA的PCR電泳圖 將耐藥基因mecA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行凝膠電泳成像，可見11條泳道，從左至右分別是指示條帶M(分別為50、100、150、300、500、600、1 000、1 500 bp)，陰性對(duì)照N，檢測(cè)菌株S，陽(yáng)性對(duì)照P，檢測(cè)菌株S和陰性對(duì)照N。見圖1。

注：M為指示條帶，N為陰性對(duì)照，S為待測(cè)菌株，P為陽(yáng)性對(duì)照。

2.5兩組菌株的消毒劑最小抑菌濃度比較 未攜帶qacA/B/C基因的兩組菌株對(duì)苯扎溴銨、氯己定和戊二醛的最小抑菌濃度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。感染組攜帶qacA/B/C基因的菌株，其最小抑菌濃度明顯高于可疑組(P<0.05)。見表4。

表4 兩組菌株的消毒劑最小抑菌濃度比較[M(P25,P75)，μg/mL]

2.6影響患者臨床結(jié)局的單因素Logistic回歸分析 以患者死亡或者放棄治療為不良轉(zhuǎn)歸，以好轉(zhuǎn)出院或者轉(zhuǎn)入普通病房為良好轉(zhuǎn)歸，分析兩組患者的年齡、性別、耐藥基因攜帶等臨床資料對(duì)轉(zhuǎn)歸結(jié)局的影響，回歸分析發(fā)現(xiàn)，年齡和qacA/B/C基因是CNS感染患者臨床結(jié)局的影響因素(P<0.05)。見表5。

表5 影響患者臨床結(jié)局的單因素Logistic回歸分析

3 討 論

隨著血流感染相關(guān)診療技術(shù)的不斷發(fā)展，CNS的感染越來(lái)越受到重視，雖然血培養(yǎng)相關(guān)診療指南中關(guān)于CNS的解讀仍然較為謹(jǐn)慎，初次單套單瓶檢出的CNS是污染菌的可能性大，但是臨床更加傾向于繼續(xù)進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，并根據(jù)藥敏結(jié)果和患者的臨床資料進(jìn)行全面判斷[2]。從本研究也可以看出，CNS的檢出主要集中于重癥和兒童患者，這類患者具有明顯的潛在感染可能，原因可能是抵抗力低下、靜脈通道開放和高強(qiáng)度抗菌藥物的使用[7]。本次納入研究的107株CNS中確定是感染菌株的有70株，可疑污染菌株37株，占比為34.6%，這說(shuō)明血培養(yǎng)檢出的CNS中65.4%是感染菌，其所占的比例較高，及早地報(bào)告藥敏結(jié)果和選擇合適的敏感藥物具有明顯的積極意義，這也為臨床相關(guān)診療提供建議，即需要對(duì)血培養(yǎng)檢出的CNS給予足夠的重視。

在本研究中，將感染組和可疑組進(jìn)行分組比較，發(fā)現(xiàn)兩組菌株的抗菌藥物耐藥率存在明顯的差異，在慶大霉素、左旋氧氟沙星、環(huán)丙沙星、莫西沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑和四環(huán)素的比較中，感染組的耐藥率明顯低于可疑組(P<0.05)。這可能是由多方面的原因?qū)е碌?，其一，感染組和可疑組的菌株數(shù)均不足，在小樣本中，差異可能被放大；其二，兩組菌株的來(lái)源不同，故其耐藥性存在差異；其三，兩組菌株耐藥基因攜帶率不同，故其耐藥性不同[8-12]。隨后，研究者觀察其耐藥基因的攜帶情況，結(jié)果顯示，在耐喹諾酮類基因gyrA、耐四環(huán)素類基因tetM和耐氨基糖苷類基因aac(6′)/aph(2′)的攜帶率比較中，可疑組明顯高于感染組(P<0.05)，說(shuō)明可疑組具有更高的耐藥基因攜帶率，而且同一菌株攜帶多種耐藥基因的現(xiàn)象亦存在，這需要給予更多關(guān)注[10,13-16]。tetM基因的耐藥機(jī)制主要是編碼外排泵蛋白和核糖體保護(hù)蛋白，gyrA基因的耐藥機(jī)制主要是改變酶的空間結(jié)構(gòu)，阻止藥物進(jìn)入作用區(qū)和改變喹諾酮-酶-DNA的復(fù)合物進(jìn)而失效，aac(6′)/aph(2′)基因的耐藥機(jī)制主要是產(chǎn)生鈍化酶，使藥物鈍化失活[17]。

本研究結(jié)果顯示，感染組的耐消毒劑類基因qacA/B/C攜帶率明顯高于可疑組(P<0.05)，說(shuō)明感染組菌株具有更加明顯的抗消毒劑能力?？瓜緞┠芰Φ墨@得主要是靠消毒劑外排蛋白的產(chǎn)生，由qac家族基因表達(dá)，其主要是qacA、qacB和qacC 3種。有研究指出，CNS的qacA、qacB和qacC在超過(guò)50%的菌株質(zhì)粒中存在，在本研究中檢出比例為62.9%，高于文獻(xiàn)報(bào)道，說(shuō)明耐消毒劑類基因的攜帶正在變得越來(lái)越普遍[18-20]。耐消毒劑類基因的檢出給臨床工作者強(qiáng)烈的提示，菌株有獲得耐消毒劑的能力，需在保護(hù)患者的同時(shí)注意自身防護(hù)。本研究還對(duì)3種消毒劑的最小抑菌濃度進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)感染組攜帶qacA/B/C基因的菌株其消毒劑最小抑菌濃度明顯高于可疑組(P<0.05)，說(shuō)明需要對(duì)CNS菌株的耐消毒劑類基因檢測(cè)和控制給予更多的關(guān)注[21]。本研究經(jīng)Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，年齡和qacA/B/C基因是CNS感染患者臨床結(jié)局的影響因素。

綜上所述，血流感染的CNS在藥物耐藥性、耐藥基因攜帶和耐消毒劑水平方面存在明顯的特點(diǎn)，攜帶qacA/B/C基因的CNS血流感染患者轉(zhuǎn)歸不良，應(yīng)給予足夠重視。