莫紫梅，袁光蔚，王海波，陳寧周，寧 芯，江秋霞，韋春夢(mèng)

(1.廣西-東盟食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣西 南寧 530022;2.玉林師范學(xué)院化學(xué)與食品科學(xué)學(xué)院，廣西 玉林 537000)

黃曲霉毒素B1(AFB1)是黃曲霉毒素中最毒的一種，遠(yuǎn)高于氰化物和砷化物，它分布范圍廣，對(duì)大多數(shù)食品原料及成品均有一定程度的污染，且高溫也很難將其破壞，是已知的最強(qiáng)致癌物之一，屬于一類致癌物，對(duì)人們的健康及生活造成極大威脅[1]。因此，AFB1的檢測(cè)受到高度重視。

目前AFB1的檢測(cè)方法有：薄層分析法、液相色譜法、酶聯(lián)免疫法、毛細(xì)管電泳法、熒光光度法以及免疫膠體金檢測(cè)法等[1]。薄層分析法是一種半定量的檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)單且價(jià)格低廉有效，通量高、準(zhǔn)確、迅速；缺點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)操作繁瑣、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)、萃取和凈化效果較低、靈敏度低、重現(xiàn)性差[1-4]。高效液相色譜法是目前常用的檢測(cè)方法，它靈敏度高、特異性好、分離能力強(qiáng)、能夠?qū)悠窚?zhǔn)確定性；缺點(diǎn)為操作復(fù)雜、前處理時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)儀器及費(fèi)用昂貴[1-4]。酶聯(lián)免疫法是將抗體(抗原)固定在聚苯乙烯材料上，然后加入酶標(biāo)抗原(抗體)，抗原特異性結(jié)合抗體后，經(jīng)顯色底物反應(yīng)顯色，測(cè)定光學(xué)信號(hào)強(qiáng)度，從而確定待測(cè)物濃度[1，3，5]，其優(yōu)點(diǎn)為準(zhǔn)確、快速、定量、毒性?。蝗秉c(diǎn)是檢測(cè)少量樣本時(shí)成本高、重復(fù)性較低、試劑需要低溫保存，試驗(yàn)假陽(yáng)性概率較高，需配備專門的酶標(biāo)儀降低假陽(yáng)性率[1]。毛細(xì)管電泳法是一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離技術(shù)，它是依據(jù)樣品中各組分之間的遷移速度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)化合物的分離檢測(cè)方法。其優(yōu)點(diǎn)為該方法與激光減弱熒光檢測(cè)器連用可提高靈敏度；缺點(diǎn)為檢測(cè)操作復(fù)雜、檢測(cè)成本相對(duì)較高，不適宜在試樣檢測(cè)中廣泛應(yīng)用[6]。熒光光度法是我國(guó)黃曲霉毒素檢測(cè)的國(guó)標(biāo)方法之一，利用黃曲霉毒素中各種不同類型毒素的熒光強(qiáng)弱程度之間的特性差異從而通過熒光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)分析。其優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)迅速、靈敏度高、測(cè)定準(zhǔn)確、適用于大量樣品的檢測(cè)。缺點(diǎn)是樣品需經(jīng)提取、凈化、分離等操作，檢測(cè)費(fèi)用高、尚不能對(duì)單一的毒素進(jìn)行檢測(cè)[1-7]。免疫膠體金檢測(cè)法是一種通過應(yīng)用膠體金作為免疫反應(yīng)示蹤物質(zhì)的新型抗原抗體特異反應(yīng)的免疫標(biāo)記技術(shù)。該檢測(cè)方法的原理為：利用在 pH值呈弱堿性情況下，存在于非離子型溶液介質(zhì)中，呈負(fù)電荷的膠體金與帶正電荷的蛋白質(zhì)分子基團(tuán)結(jié)合，形成特定的免疫反應(yīng)的標(biāo)記物，從而進(jìn)行檢測(cè)，用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)，可進(jìn)一步檢測(cè)黃曲霉毒素[1，4，8]。其優(yōu)點(diǎn)為可對(duì)單份樣品進(jìn)行測(cè)定，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)效率高，適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)；缺點(diǎn)是只能達(dá)到半定量，復(fù)性較差，檢測(cè)結(jié)果無法保存，只能作為快速篩查的手段[1]。

量子點(diǎn)作為近幾年出現(xiàn)的新型熒光標(biāo)記材料，因其具有發(fā)射光譜范圍窄且對(duì)稱，激發(fā)光譜范圍寬，發(fā)射峰可調(diào)節(jié)尺寸[5]，穩(wěn)定性好，信噪比高，生物相容性好，熒光壽命(20～50 ns)長(zhǎng)于背景熒光的壽命(1～10 ns)，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)和量化其熒光強(qiáng)度[5，8，9]。量子點(diǎn)熒光免疫層析法(QDs-based IFA)對(duì)人員的要求低，檢測(cè)時(shí)間短，成本低且定量，但準(zhǔn)確性低于液相色譜，已被廣泛用于生物醫(yī)藥、微生物學(xué)、分析化學(xué)、食品等領(lǐng)域[10，14]。量子點(diǎn)熒光可通過調(diào)節(jié)發(fā)射峰尺寸實(shí)現(xiàn)單激發(fā)、多波長(zhǎng)輻射，形成彩色 QDs，在標(biāo)記多種真菌毒素的抗體后，可以實(shí)現(xiàn)同步檢測(cè)食品中的AFT和其他毒素[15-19]，能夠有效提高檢測(cè)效率。

本試驗(yàn)采用同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(國(guó)標(biāo)法)和量子點(diǎn)熒光免疫層析法定量檢測(cè)花生油中AFB1的含量，通過2種方法的比較，確定量子點(diǎn)熒光免疫層析法檢測(cè)花生油中AFB1的可行性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器與設(shè)備

QUINTIX313-ICEU電子天平，德國(guó)賽多利斯公司；RDTANA460R離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Multi Reax多管式渦旋振蕩器，德國(guó)海道夫公司；NepQD-Infinity-V1快速免疫熒光分析儀，江蘇量點(diǎn)科技有限公司；Milli-Q 超純水系統(tǒng)，美國(guó)Milli-pore公司；EBA 270離心機(jī)，德國(guó)Hettich科學(xué)儀器公司；Shimadzu DGU-20A超高效液相色譜儀，日本島津公司；AB QTRAP 4500 MS四極桿質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)，美國(guó)AB SCIEX公司。

1.1.2材料與試劑

磷酸鹽緩沖液：8.00 g氯化鈉、1.20 g磷酸氫二鈉、0.20 g磷酸二氫鉀、0.20 g氯化鉀，用900 ml水溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.4，用水定容至1 000 ml；實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q超純水。甲醇、乙腈、甲酸、乙酸、乙酸銨(色譜純)，德國(guó)默克股份公司；AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液、13C17-AFB1內(nèi)標(biāo)(純度≥98%)、黃曲毒素免疫親和柱，ROMER LABS有限公司。

1.2 方法

1.2.1量子點(diǎn)熒光免疫層析法

(1)樣品前處理

取1 g花生油于15 ml離心管中，加入2 ml 70%甲醇水溶液，震蕩5 min，6 000 g離心5 min，收集上清液。取上清液100 μl，與磷酸鹽緩沖溶液600 μl振蕩混勻，待上樣檢測(cè)。

(2)樣品檢測(cè)

將檢測(cè)卡及待檢樣本取出，平衡至室溫，開啟NepQD-Infinity-V1快速免疫熒光分析儀。將檢測(cè)卡加樣孔朝上平放，移取的待檢樣本75 μl垂直緩慢滴入檢測(cè)卡的加樣孔中，反應(yīng)15 min，將檢測(cè)卡插入 NepQD-Infinity-V1/P1快速熒光分析儀，并進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

(1)樣品前處理

按GB 5009.22—2016[7]操作。稱取5 g花生油于50 ml離心管中，加入100 μl同位素內(nèi)標(biāo)工作液(100 ng/ml)，振蕩混勻后靜置30 min，加入20 ml乙腈-水溶液(84+16)，渦旋混勻，振蕩20 min，在6 000 r/min下離心10 min，上清液備用。準(zhǔn)確移取 4 ml上清液，加入 46 ml 1% Trition X-100的PBS，混勻，經(jīng)免疫親和柱凈化，采用甲醇洗脫，洗脫液在50℃下用氮?dú)獯抵两桑尤?.0 ml初始流動(dòng)相，渦旋 30 s溶解殘留物,0.22 μm濾膜過濾，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。

(2)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

AFB1工作液的配制：精密稱取一定量的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，濃度為200 ng/ml。

13C17-AFB1同位素內(nèi)標(biāo)工作液：精密稱取一定量的AFB1內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，濃度為100 ng/ml。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：準(zhǔn)確移取AFB1工作液，同位素內(nèi)標(biāo)工作液適量，配制成濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0、25.0 ng/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中內(nèi)標(biāo)濃度為 2.0 ng/ml。

(3)色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18柱(150 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫：40℃；流速：0.3 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl；流動(dòng)相：A 為5 mmol/L乙酸銨溶液，B 為乙腈-甲醇(50+50)溶液；采用梯度洗脫程序，見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

(4)質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描模式：正離子掃描(ESI+)；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；電噴霧電壓(IS)：5 500 V；離子源溫度：550℃；curtain gas(氣簾氣)為35.0 psi；gas1(霧化氣)、gas2(輔助氣)分別為55，55 psi。MRM相關(guān)參數(shù)設(shè)定見表2。

表2 黃曲霉毒素B1的保留時(shí)間、定性離子、定量離子與內(nèi)標(biāo)物等MRM相關(guān)參數(shù)設(shè)定

2 結(jié)果

2.1 線性范圍、檢出限、回收率及精密度

同位素稀釋高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線為:Y=62 588X+2 827,相關(guān)系數(shù)R=0.999 6，表明在濃度0.1～25.0 ng/ml內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限0.02 μg/kg。

量子點(diǎn)熒光免疫層析法采用NepQD-Infinity-V1快速免疫熒光分析儀內(nèi)置曲線，其線性方程為:Y=1.340 1X-1.672 44，相關(guān)系數(shù)R2=0.991 30，其中Y=ln(p/q)，p=OD/OD0，q=1-p，式中X為ln(目標(biāo)物濃度)，OD為目標(biāo)物反應(yīng)值，OD0為目標(biāo)物濃度為0的反應(yīng)值均值。量子點(diǎn)熒光免疫層析檢測(cè)花生油中AFB1的線性范圍為0.5～25.0 μg/kg，檢出限為0.5 μg/kg。

取陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，設(shè)計(jì)3個(gè)不同水平，將AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到空白花生油樣品中，混合均勻，按照1.2.2 方法進(jìn)行試驗(yàn)，同位素稀釋高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜和量子點(diǎn)熒光免疫層析法的回收率分別為83.2%～94.6和78.6%～88.3%，精密度為1.5%～3.5%和1.6%～3.8%，(見表3)。根據(jù) GB/T 27404—2008附錄F[21]中的要求，回收率參考范圍被測(cè)組分含量<0.1 mg/kg時(shí)，回收率范圍在60%～120%，符合國(guó)標(biāo)要求。

表3 2種檢測(cè)方法線性方程、回收率、檢出限比較

2.2 質(zhì)控樣及其精密度

采用2種方法對(duì)購(gòu)買具有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的質(zhì)控樣(特性值8.851 μg/kg，特性值區(qū)間 5.449～12.253 μg/kg)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，同位素稀釋高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法和量子點(diǎn)熒光免疫層次法的結(jié)果分別為9.051 μg/kg及7.752 μg/kg，均在特性值區(qū)間范圍內(nèi)，符合要求。且對(duì)樣品進(jìn)行6次獨(dú)立重復(fù)測(cè)試，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.6%和3.7%，精密度均符合定量分析的要求，見表4。

表4 2種檢測(cè)方法質(zhì)控樣測(cè)定結(jié)果

2.3 靈敏度、假陰性率

靈敏度是指方法在實(shí)驗(yàn)條件下達(dá)到實(shí)際最低檢出水平時(shí)，檢出陽(yáng)性結(jié)果的陽(yáng)性樣品數(shù)占總陽(yáng)性樣品數(shù)的百分比。假陰性率是指方法在實(shí)驗(yàn)條件下達(dá)到實(shí)際最低檢出水平時(shí)，陽(yáng)性樣品中檢出陰性結(jié)果的最大概率(以百分比計(jì))。根據(jù)食藥監(jiān)辦科〔2017〕43號(hào)《食品快速檢測(cè)方法評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》中計(jì)算公式，熒光量子點(diǎn)免疫層析法靈敏度及假陰性率見表5。

表5 熒光量子點(diǎn)免疫層析法靈敏度及假陰性率

在參比方法檢測(cè)的所有陽(yáng)性樣本中：

參比方法的陽(yáng)性樣本數(shù)量(N1)=快檢陽(yáng)性數(shù)量(N11)+快檢陰性數(shù)量(N12)。

靈敏度(p+，%)=快檢陽(yáng)性數(shù)量(N11)/(參比方法的陽(yáng)性數(shù)量(N1))×100(其中參比方法的陽(yáng)性數(shù)量=快檢陽(yáng)性數(shù)量+快檢陰性數(shù)量)。

假陰性率(pf-，%)=快檢陰性數(shù)量(N12)/參比方法的陽(yáng)性數(shù)量(N1)×100。

本試驗(yàn)中，同位素稀釋高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法為參比方法，量子點(diǎn)熒光免疫層析為快檢方法。由表6可知，在試驗(yàn)的76批樣本中，參比方法測(cè)定的陽(yáng)性樣本數(shù)為76批，量子點(diǎn)熒光免疫層析法檢測(cè)的陽(yáng)性樣本數(shù)為70批，陰性樣本數(shù)為6批，故熒光量子點(diǎn)免疫層析檢測(cè)技術(shù)的靈敏度為92.1%，假陰性率為7.9%。

2.4 2種方法一致性的比較

參比方法陽(yáng)性樣本中AFB1含量的比較見表6。由表6可知，同位素稀釋法高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法和量子點(diǎn)熒光免疫層析法檢測(cè)的76批樣品中，兩種方法的相對(duì)偏差為0.05%～9.93%。對(duì)兩種方法AFB1檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行T檢驗(yàn)，t=0.9 993，t雙衛(wèi)臨尾(0.025,76)=2.291，t

表6 參比方法陽(yáng)性樣本中AFB1含量的比較

3 結(jié)論與討論

量子點(diǎn)熒光免疫層析法檢測(cè)花生油中AFB1的檢出限、回收率、精密度均良好，且和國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法同位素稀釋高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法數(shù)據(jù)對(duì)比無顯著性差異，符合國(guó)標(biāo)要求。量子點(diǎn)熒光免疫層析法是基于量子點(diǎn)標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)，利用熒光分析儀測(cè)定卡上檢測(cè)線和控制線的熒光強(qiáng)度，而且其樣品提取簡(jiǎn)單，只需簡(jiǎn)單的振蕩提取、離心、稀釋后即可上機(jī)檢測(cè)，且有內(nèi)置曲線可快速讀出結(jié)果。該方法具有分析時(shí)間短、步驟簡(jiǎn)單、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，靈敏度、特異性均很好，適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，可在基層快檢中推廣應(yīng)用，用于各地市場(chǎng)監(jiān)管單位現(xiàn)場(chǎng)快速定量檢測(cè)食用油中AFB1含量，同時(shí)也為該方法用于其它真菌毒素的定量熒光免疫檢測(cè)提供了參考。