程嬌梅，齊祥明，郭曉華

(1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266000；2.青島蔚藍(lán)生物股份有限公司，山東 青島 266000；3.山東美佳集團(tuán)有限公司，山東 日照 276826)

阿魏酸酯酶，又稱為肉桂酸酯酶，屬于羧酸酯水解酶亞類，該酶可以水解植物細(xì)胞壁中由阿魏酸、對(duì)香豆酸及二聚阿魏酸等酚酸與半纖維素和木質(zhì)素形成的酯鍵，打破它們形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，將半纖維素和木質(zhì)素分開(kāi)，使纖維素酶可以與纖維素充分接觸，大大提高纖維素的降解率。因此阿魏酸酯酶可以實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素、纖維素等的加速降解，同時(shí)還釋放出阿魏酸、對(duì)香豆酸等抗氧化活性物質(zhì)，在飼料、食品工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用前景[1]。

酶活力是酶制劑生產(chǎn)、應(yīng)用中的關(guān)鍵定量指標(biāo)。目前，阿魏酸酯酶的研究主要集中在產(chǎn)酶菌的篩選[2-3]、晶體結(jié)構(gòu)研究[4]、基因表達(dá)[5]、發(fā)酵條件優(yōu)化[2-6]、酶學(xué)性質(zhì)研究[7]、應(yīng)用[8-9]及與其他酶的協(xié)同作用[10]等。而這些研究中，涉及到阿魏酸酯酶酶活力測(cè)定的內(nèi)容往往過(guò)于簡(jiǎn)單、含糊。目前可查的步驟清晰的阿魏酸酯酶酶活力測(cè)定方法還是十幾年前報(bào)道的分光光度法[11-12]，該法易受樣品中其他組分的干擾，測(cè)定準(zhǔn)確度不高，且檢測(cè)過(guò)程無(wú)法自動(dòng)化，時(shí)間成本較高，無(wú)法滿足阿魏酸酯酶發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)的檢測(cè)需求。

因此，本研究嘗試基于該酶反應(yīng)產(chǎn)物阿魏酸的液相色譜定量檢測(cè)法，確定該酶活力的檢測(cè)方法。酶活力測(cè)定的關(guān)鍵在于，通過(guò)液相色譜將底物阿魏酸甲酯和產(chǎn)物阿魏酸分離，實(shí)現(xiàn)對(duì)阿魏酸甲酯和阿魏酸兩種物質(zhì)含量的精確定量。在此基礎(chǔ)之上，我們還對(duì)該酶的酶促反應(yīng)條件進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，進(jìn)而建立了操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確可靠的酶活力測(cè)定方法，為該酶制劑的生產(chǎn)技術(shù)開(kāi)發(fā)及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供酶活力檢測(cè)方法上的支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿魏酸酯酶：液體，由青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司提供。

阿魏酸：≥99.5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；阿魏酸甲酯：≥99.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、乙酸均為市售色譜純；十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、一水合檸檬酸均為市售分析純；分析用水為自制純凈水。

1.2 儀器與設(shè)備

e2695、2489高效液相色譜儀，美國(guó)沃特世公司；PHS-3E pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；TG16-WS高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；DK-98-IIA恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；QT-1漩渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司。

1.3 分析方法

1.3.1酶活力定義及酶促反應(yīng)步驟

阿魏酸酯酶酶活力定義：在一定的溫度、pH值下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol阿魏酸，定義為1個(gè)酶活力單位，用U表示。

酶促反應(yīng)步驟：取2支試管，加入1 ml稀釋后的酶液，一定溫度下預(yù)熱5 min，然后加入1 ml阿魏酸甲酯溶液，反應(yīng)一定時(shí)間，加入2 ml終止液，混勻，過(guò)0.22 μm的水系膜，用液相色譜儀測(cè)定反應(yīng)后阿魏酸含量，計(jì)算阿魏酸酯酶酶活力。

阿魏酸酯酶酶活力計(jì)算公式：

式中，U為阿魏酸酯酶酶活力，U/ml；C為通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線算得的阿魏酸濃度，mg/L；0.004為反應(yīng)總體積，L；1 000為mg與μg的轉(zhuǎn)換系數(shù)；n為樣品的稀釋倍數(shù)；194.19為阿魏酸的摩爾系數(shù)，g/mol；t為反應(yīng)時(shí)間，min；m為樣品的量，ml。

1.3.2阿魏酸含量測(cè)定

色譜條件：色譜柱為安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18，流動(dòng)相為甲醇∶1%乙酸溶液=70∶30，流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為35℃，進(jìn)樣溫度為25℃，進(jìn)樣量為10 μl，運(yùn)行時(shí)間為5 min。

在該色譜條件下測(cè)定阿魏酸含量，對(duì)該方法的線性范圍、檢測(cè)限、定量限、重復(fù)性、加標(biāo)回收率進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3酶活力測(cè)定過(guò)程中最適條件探索

終止液的確定：阿魏酸在弱酸條件下具有良好的穩(wěn)定性，選擇乙酸溶液作為終止液，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%的乙酸溶液，在37℃，反應(yīng)15 min后加入，放置0、10、20、30、60、120、150、180 min測(cè)定阿魏酸的含量，確定終止液能否徹底終止酶促反應(yīng)。

阿魏酸生成量范圍的確定：用pH6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸溶液將阿魏酸酯酶樣品進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋，以0.416 g/L阿魏酸甲酯為底物，在37℃下，進(jìn)行酶促反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)后阿魏酸含量，計(jì)算阿魏酸甲酯的殘余率和單位酶的阿魏酸生成量。

最適溫度的確定：用pH6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制濃度為0.416 g/L阿魏酸甲酯溶液，分別在30、35、40、45、50、55、60、65、70℃條件下，進(jìn)行酶促反應(yīng)15 min，計(jì)算每個(gè)溫度下酶活力，做溫度-酶活力曲線。

最適pH值的確定：分別用pH值為2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制0.416 g/L 阿魏酸甲酯溶液，在37℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)15 min，計(jì)算每個(gè)pH值下酶活力，做pH值-酶活力曲線。

1.3.4阿魏酸酯酶酶活力測(cè)定方法驗(yàn)證

選取10個(gè)不同酶活力的樣品，用pH5.0的緩沖液配制濃度為0.416 g/L的阿魏酸甲酯溶液，在55℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)，計(jì)算每個(gè)樣品的酶活力，重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算其RSD。

2 結(jié)果與討論

2.1 高效液相色譜定量檢測(cè)阿魏酸

實(shí)驗(yàn)首先確定較優(yōu)的色譜條件：色譜柱為安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18，流動(dòng)相為甲醇∶1%乙酸溶液=70∶30，流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為35℃，進(jìn)樣溫度為25℃，進(jìn)樣量為10 μl，運(yùn)行時(shí)間為5 min。色譜出峰結(jié)果如圖1所示。

圖1 阿魏酸與阿魏酸甲酯色譜圖

圖1顯示，在此條件下可實(shí)現(xiàn)阿魏酸與阿魏酸甲酯的有效分離。進(jìn)一步探索可知，阿魏酸的檢測(cè)限(S/N=3)為69.15 μg/L；定量限(S/N=10)為234.78 μg/L；在測(cè)酶活力擬采用的產(chǎn)物濃度范圍10～100 mg/L內(nèi)，線性度良好，R2=0.999 9。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該檢測(cè)方法對(duì)阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)樣檢測(cè)的重復(fù)性(RSD)小于1.0%；加標(biāo)回收率為99.25%。

2.2 酶活力測(cè)定最適條件探索

在確定阿魏酸及阿魏酸甲酯的定量檢測(cè)方法后，酶活的檢測(cè)則基于對(duì)特定條件下過(guò)飽和的底物阿魏酸甲酯與阿魏酸甲酯酶樣在特定條件(溫度、pH值)下反應(yīng)一定的時(shí)間(本試驗(yàn)選取反應(yīng)時(shí)間為15 min)來(lái)進(jìn)行。

2.2.1終止液乙酸濃度的確定

在酶活力測(cè)試過(guò)程中，當(dāng)酶反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)需采用恰當(dāng)?shù)姆绞浇K止反應(yīng)才能為后續(xù)的反應(yīng)產(chǎn)物定量提供有效的樣品。通常酶活力測(cè)試的終止液往往采用該酶的抑制劑。因阿魏酸酯酶的抑制劑方面目前相關(guān)報(bào)道較少，因此本研究嘗試采用低pH環(huán)境(用高濃度乙酸溶液來(lái)實(shí)現(xiàn))促使蛋白質(zhì)變性的方法來(lái)終止反應(yīng)，結(jié)果如圖2。

圖2顯示，當(dāng)終止液乙酸濃度小于20%時(shí)，在其加入后的時(shí)間里，產(chǎn)物阿魏酸的含量仍呈逐步增長(zhǎng)趨勢(shì)，說(shuō)明此時(shí)不能完全終止酶反應(yīng)。乙酸濃度大于等于25%時(shí)，放置30 min，阿魏酸含量比較穩(wěn)定；對(duì)4個(gè)終止液濃度下所測(cè)得的4組阿魏酸含量進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果表明這些數(shù)據(jù)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明濃度大于等于25%的乙酸溶液能終止酶反應(yīng)。

圖2 乙酸濃度與阿魏酸含量關(guān)系圖

為了進(jìn)一步考察酶促反應(yīng)是不是徹底終止，選擇延長(zhǎng)放置時(shí)間，結(jié)果如圖3所示。乙酸濃度為25%時(shí)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，阿魏酸含量還在增加，說(shuō)明酶促反應(yīng)終止的不徹底；乙酸濃度大于等于30%的3組，放置240 min，阿魏酸含量無(wú)明顯變化。顯著性分析結(jié)果表明，這3組數(shù)據(jù)在長(zhǎng)時(shí)間背景下均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明酶促反應(yīng)已被徹底終止?？紤]高濃度乙酸溶液可能對(duì)儀器設(shè)備產(chǎn)生較大的損壞，最終選擇30%乙酸溶液作為終止液。

圖3 乙酸濃度與阿魏酸含量關(guān)系圖

2.2.2產(chǎn)物阿魏酸生成量控制范圍

實(shí)驗(yàn)中阿魏酸甲酯加入量已提前設(shè)定，如測(cè)試體系中阿魏酸酯酶酶活較高則可能出現(xiàn)底物過(guò)飽和度不夠。根據(jù)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，此時(shí)的產(chǎn)物生成量將不與酶活之間呈線性關(guān)系。本方法為防止這一問(wèn)題出現(xiàn)，采用對(duì)酶樣提前稀釋的做法。根據(jù)上述機(jī)理，只要稀釋后產(chǎn)物阿魏酸的生成量得到較好的控制，則在特定阿魏酸甲酯加入量下，測(cè)試體系的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)仍在線性區(qū)。為此本研究對(duì)試驗(yàn)條件下阿魏酸生成量范圍進(jìn)行了探索，結(jié)果如圖4所示。

圖4 單位酶的阿魏酸生成量

圖4所示為某待測(cè)樣品在不同稀釋倍數(shù)下的阿魏酸甲酯殘余率和單位酶的阿魏酸生成量。結(jié)果顯示，當(dāng)稀釋倍數(shù)小于7 500倍時(shí)，單位酶的阿魏酸生成量隨著稀釋倍數(shù)的增加而增加，阿魏酸甲酯殘余率也在增加(從20.8%提升至71.3%)。這首先說(shuō)明稀釋倍數(shù)小于7 500倍時(shí)，阿魏酸甲酯過(guò)飽和度明顯不夠。其次，所計(jì)算出的阿魏酸生成量其實(shí)就和后續(xù)的阿魏酸酯酶酶活測(cè)量結(jié)果是線性相關(guān)，此時(shí)該數(shù)字并未穩(wěn)定，說(shuō)明該區(qū)域不是可以進(jìn)行酶活測(cè)試的適宜區(qū)域。

隨著稀釋倍數(shù)的繼續(xù)增加，單位酶的阿魏酸生成量和阿魏酸甲酯殘余率均不再明顯增加，而是保持在一個(gè)比較穩(wěn)定的水平。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，這些數(shù)據(jù)已無(wú)顯著性差異(P>0.05)。在此條件下，對(duì)反應(yīng)后體系中的阿魏酸生成量進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果表明，當(dāng)該值在15～25 mg/L時(shí)，酶活測(cè)量結(jié)果(即單位酶的阿魏酸生成量)穩(wěn)定。

2.2.3溫度的確定

溫度與酶活力關(guān)系見(jiàn)圖5。

圖5 溫度與酶活力關(guān)系

由圖5可見(jiàn)，酶樣在各溫度下的活力測(cè)量結(jié)果。在30～55℃時(shí)，酶活力隨著溫度增加而增加，55℃時(shí)酶活力達(dá)到最高；在55～70℃時(shí)，酶活力隨著溫度增加逐步下降。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明，55℃是該酶樣的最適溫度。為使酶活測(cè)定結(jié)果具有盡可能高的精確度，酶活力測(cè)定過(guò)程中反應(yīng)溫度一般選擇55℃。

2.2.4pH值的確定

圖6所示為酶樣在各pH值下的活力測(cè)量結(jié)果。pH值在2.0～5.0時(shí)，酶活力隨著pH值的增加而增加，pH5.0時(shí)，酶活力測(cè)量值達(dá)到最大；pH值在5.0～8.0時(shí)，酶活力隨pH值增大而下降。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明，pH5.0是該酶最適pH值。因此，為使酶活測(cè)定結(jié)果具有盡可能高的精確度，酶活力測(cè)定過(guò)程中pH值一般選擇5.0。

圖6 pH與酶活力關(guān)系

2.3 阿魏酸酯酶酶活力測(cè)定方法驗(yàn)證

在上述確定的酶反應(yīng)條件下，本實(shí)驗(yàn)對(duì)10個(gè)阿魏酸酯酶樣品進(jìn)行了酶活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明酶活力測(cè)定值的RSD均小于3.0%(見(jiàn)表1)，符合酶制劑檢測(cè)方法建立的要求，證明了高效液相色譜法測(cè)定阿魏酸酯酶酶活力的方法是準(zhǔn)確可靠的。

表1 阿魏酸酯酶酶活力測(cè)定方法驗(yàn)證

3 結(jié)論

本研究以阿魏酸甲酯為底物，擬通過(guò)反應(yīng)后生成物阿魏酸的含量來(lái)進(jìn)行酶活測(cè)定。所研究方法首先基于Waters高效液相色譜儀(E2695、2489)，采用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱，建立了阿魏酸定量方法。該方法以甲醇∶1%乙酸=70∶30作為流動(dòng)相，等度洗脫(柱溫35℃，流速1.0 ml/min，進(jìn)樣量10 μl)，在254 nm下測(cè)定阿魏酸含量，其檢測(cè)限為69.15 μg/L，定量限為234.78 μg/L。待測(cè)酶活擬選產(chǎn)物阿魏酸的濃度在10～100 mg/L線性度良好(R2=0.999 9)，重復(fù)性(RSD)小于1.0%，加標(biāo)收回率為99.25%。

在高效液相色譜法測(cè)定阿魏酸含量的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步建立了阿魏酸酯酶酶活力測(cè)定方法。試驗(yàn)首先選擇了簡(jiǎn)便易得的乙酸溶液作為終止液，確定了終止液乙酸濃度為30%，進(jìn)而確定當(dāng)體系內(nèi)阿魏酸生成量在15～25 mg/L范圍時(shí)，酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)處于線性區(qū)，可用于酶活測(cè)定。最后確定酶樣的最適溫度為55℃，最適反應(yīng)pH值為5.0。在該條件下，對(duì)阿魏酸酯酶酶活力測(cè)定方法進(jìn)行驗(yàn)證，10個(gè)樣品酶活力測(cè)定值的RSD均小于3.0%，說(shuō)明高效液相色譜法測(cè)定阿魏酸酯酶酶活力是準(zhǔn)確可靠的。