覃韋寧，谷春明，楊方紅，張河燕，楊恩澤，武福云，柯鏡

（湖北醫(yī)藥學院基礎醫(yī)學院，湖北 十堰 442000）

惡性腫瘤是臨床上常見的導致患者死亡的原因，目前癌癥治療包括手術(shù)、化療、放療、生物、激素治療等。然而，這些治療主要存在的問題是其昂貴的成本和副作用[1]?？鼓[瘤肽因其具有多種優(yōu)勢而得到了廣泛開發(fā)和應用。目前，從植物、動物及微生物中分離出了多種抗腫瘤活性肽，如罌粟花粉中分離的十三肽能夠抑制肝癌及乳腺癌細胞的增殖。茜草科植物寒丁子中分離的多肽RAVⅡ具有抗腫瘤活性，在日本作為抗癌藥已經(jīng)進入臨床I期[2-3]。許多動物來源的多肽也具有很好的抗腫瘤活性，特別是海洋動物。如海綿和海鞘等的次生代謝產(chǎn)物，因其含有一些特殊的氨基酸，具有抗腫瘤活性[4]。除了天然的活性多肽，利用噬菌體展示技術(shù)及化學合成的多種多肽都被報道具有抗腫瘤作用[5]。多肽藥物具有多種優(yōu)勢，如免疫原性低、受體結(jié)合率高、制備成本低且易于改造和聯(lián)合應用等，同時抗腫瘤肽又能通過多種機制發(fā)揮作用，如抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤細胞壞死、抑制微管合成等[6-8]。目前，一種新的多肽藥物研發(fā)策略是阻斷蛋白質(zhì)相互作用。因為大部分的蛋白質(zhì)都是和伴侶分子一起作用或是與其他蛋白質(zhì)形成復合物來發(fā)揮作用的。蛋白質(zhì)相互作用幾乎在整個細胞生命活動過程中發(fā)揮功能，如DNA合成、蛋白質(zhì)翻譯、信號轉(zhuǎn)導過程等，蛋白質(zhì)相互作用構(gòu)成了細胞生命活動及信號轉(zhuǎn)導的分子網(wǎng)絡。蛋白質(zhì)相互作用異常導致基因表達異常、蛋白質(zhì)功能異常及信號轉(zhuǎn)導異常，是多種疾病的發(fā)病基礎。因此，蛋白質(zhì)相互作用已成為多種疾病治療的潛在靶點[9-10]。在腫瘤發(fā)生發(fā)展中，有很多經(jīng)典的蛋白質(zhì)相互作用發(fā)揮了重要作用，基于阻斷這些蛋白質(zhì)相互作用的抗腫瘤多肽已經(jīng)取得了極大的研究進展。

表1 抗腫瘤藥物的特性比較

1 阻斷P53-MDM2相互作用抗腫瘤肽

P53是一個重要的抑癌基因，參與多種細胞生命活動，如基因轉(zhuǎn)錄、DNA損傷修復、細胞衰老及凋亡等。大約50%的腫瘤中，P53基因發(fā)生了突變或缺失，從而失去了對細胞生長、凋亡及DNA修復的調(diào)控[11]。泛素化E3連接酶MDM2是P53最主要的負調(diào)控因子，通過N端與P53相互作用，使P53泛素化降解。目前，抑制P53-MDM2相互作用的一些小分子抑制劑，如Nutlins、MI-219，通過靶向MDM2 N端的P53結(jié)合位點，維持P53的穩(wěn)定并激活P53信號通路，發(fā)揮了較好的抗腫瘤作用[12]。除此之外，基于阻斷P53-MDM2相互作用的抗腫瘤肽也得到了開發(fā)。PAZGIER等[13]利用噬菌體展示技術(shù)篩選到溶解度高且特異性強的抑制P53-MDM2相互作用的多肽PMI（TSFAEYWNLLSP）。LIU等[14]利用鏡像噬菌體展示技術(shù)（Mirror imagephage display）篩選出與MDM2分子鏡像對映體相互作用的Lpeptide配體，之后通過固相合成等手段合成出與篩選出來的L-peptide配體鏡像對應的D-peptide配體、DPMI-γ（DWWPLAFEALLR），D-peptide對目標分子的親和力與其對應篩選出的L-peptide與目標分子的親和力相同，但可以抵抗蛋白酶降解。這些多肽都能夠阻斷P53-MDM2相互作用，促進P53依賴的細胞死亡途徑有效激活，發(fā)揮抗腫瘤作用。

2 抗腫瘤肽靶向EGF，阻斷EGF-EGFR相互作用

表皮生長因子受體（EGFR或Her1/ErbB1）是ErbB細胞膜受體家族的4個成員之一，EGFR廣泛分布于哺乳動物細胞表面，通過其細胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體發(fā)生構(gòu)象變化，導致同型或異型寡聚化而被激活，從而參與細胞的增殖和分化[15]。表皮生長因子EGF是一種包含53個氨基酸的小肽，是EGFR的配體，通過與EGFR的特異性結(jié)合，并通過促進EGFR的二聚化和自磷酸化來啟動一系列信號級聯(lián)反應促進細胞增殖，如MAPK、Akt、JNK信號通路等。相關報道表明已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)EGF和EGFR的異常表達及EGFR的突變，導致EGFR信號途徑過度激活。EGFR與腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關，是腫瘤化療的重要靶點[16-17]。目前，針對EGFR的藥物有西妥昔單抗和帕尼單抗，通過與EGFR胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合從而阻斷EGFR激活；以及小分子藥物吉非替尼和厄洛替尼，通過阻斷EGFR的自磷酸化從而阻斷下游的致癌途徑[18]。但是這些針對EGFR的藥物最大的問題是其副作用和產(chǎn)生的耐藥性。GUARDIOLA等[19]利用分子對接技術(shù)和EGFR受體熱點模擬技術(shù)設計并合成了一條EGF結(jié)合肽cp28（CQGTSNKLTQLGTFE DHFLSLQRMEFNNC），該多肽能夠與EGF結(jié)合從而阻斷EGFR與EGF的相互作用，并抑制乳腺癌細胞的增殖。這一研究為小分子蛋白的藥物多肽開發(fā)提供了基礎。

3 阻斷PD-1/PD-L1相互作用的腫瘤免疫治療肽

腫瘤免疫治療是一種新的腫瘤治療方法。目前，主要是通過抑制免疫檢查點來治療，其中較為有代表性的就是CTLA-4拮抗劑和PD-1/PD-L1抑制劑。CTLA-4是首個被發(fā)現(xiàn)的“免疫檢查點”，而PD-1/PD-L1被認為是目前腫瘤免疫治療最有希望的重要靶點。程序性細胞死亡受體1（PD-1）是一種在免疫細胞上表達的重要的免疫抑制分子，通過向下調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)對人體細胞的反應，以及通過抑制T細胞炎癥活動來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)并促進自身耐受。PD-L1是PD-1的配體之一，在多種腫瘤細胞中過表達。PD-L1與PD-1的結(jié)合導致T細胞免疫抑制的激活，并誘導T細胞凋亡，使腫瘤細胞開啟免疫逃逸[20-21]。目前，靶向PD-1/PD-L1免疫檢查點的藥物通過阻斷腫瘤細胞和T細胞結(jié)合，使T細胞能正常發(fā)揮作用，持續(xù)識別腫瘤細胞并清除。針對PD-1批準上市的單克隆抗體藥有Nivolumab和Pembrolizumab，適用于黑色素瘤、非小細胞肺癌、頭頸鱗狀細胞癌等。而PD-L1的單克隆抗體抑制劑Atezolizumab、Durvalumab及Avelumab也已經(jīng)被批準上市。盡管這些針對免疫抑制檢查點的抗體藥對部分腫瘤具有一定的療效，但隨后產(chǎn)生的耐藥性，及其高成本對免疫治療這一新興療法提出了挑戰(zhàn)。LI等[22]通過細菌表面展示技術(shù)，篩選到了具有高親和力且特異性結(jié)合PD-L1的多肽TPP-1（SGQYASYHCWCWRDPGRSGGSK），TPP-1多肽能夠阻斷PD-1/PD-L1相互作用，并使T細胞活化，體外裸鼠致瘤實驗表明該多肽具有抗腫瘤效應。LIU等[23]利用噬菌體展示技術(shù)結(jié)合一種新的生物篩選程序得到了能夠特異性結(jié)合PD-L1的CLP002肽（WHRSYYTWNLNT），該肽能夠特異性地結(jié)合PDL1與PD-1相互作用的殘基，并阻斷PD-1/PD-L1在腫瘤細胞中的相互作用，從而激活T細胞發(fā)揮抗癌作用。

4 靶向Bcl2-BH結(jié)構(gòu)域，誘導腫瘤細胞凋亡多肽

Bcl-2是凋亡調(diào)節(jié)蛋白家族中起關鍵作用的成員，通過與其他凋亡蛋白相互作用，發(fā)揮細胞凋亡主開關的作用。Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白兩大類。Bcl-2蛋白具有4個BH結(jié)構(gòu)域（BH1-4），這是大多數(shù)抗凋亡家族成員所特有的，而促凋亡家族成員僅具有BH1-3結(jié)構(gòu)域（例如Bax和Bak）。另外一些促凋亡蛋白，如Bim則僅具有BH3結(jié)構(gòu)域，充當激活Bax或Bak的前哨，進而通過透化線粒體外膜并釋放細胞色素c觸發(fā)細胞凋亡。Bcl-2通過結(jié)合這些促凋亡蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域形成異源二聚體，從而抑制細胞凋亡。Bcl-2蛋白在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)表達升高，從而增加了腫瘤細胞的凋亡抗性[24-25]。目前，針對Bcl-2蛋白的癌癥治療藥物主要是模擬BH3結(jié)構(gòu)域的小分子藥物，如ABT-737、ABT-263（Navitoclax）和ABT-199（Venetoclax），通過競爭性地抑制Bcl-2與促凋亡蛋白BH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，從而誘導腫瘤細胞凋亡[26]。除此之外，來源于促凋亡蛋白Bax、Bad、Bim等的BH3結(jié)構(gòu)域的抗腫瘤多肽得到了大量的開發(fā)。除此之外，最新研究還開發(fā)了針對Bcl-2的BH4結(jié)構(gòu)域的多肽來誘導腫瘤細胞凋亡。Bcl-2能夠通過其BH4結(jié)構(gòu)域與肌醇1，4，5-三磷酸受體（IP3R）結(jié)合，抑制細胞內(nèi)鈣離子濃度升高而發(fā)揮抗凋亡的作用。LAVIK等[27]合成了阻斷Bcl-2與IP3R相互作用的多肽BIRD-2（RKKRRQRRRGGNVYTEIKCNSLLPLAAIVRV），能夠誘導多種淋巴瘤細胞的凋亡，而且聯(lián)合模擬BH3結(jié)構(gòu)域的小分子藥物ABT-263和ABT-199，腫瘤細胞凋亡效果更加明顯。

5 抑制離子通道活化的抗腫瘤肽

鈣庫調(diào)控的鈣通道Orai1與多種腫瘤密切相關，如乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等。在腫瘤細胞內(nèi)，Orai1蛋白的表達量明顯上調(diào)，鈣電流升高，鈣信號被異常激活，促進腫瘤細胞的侵襲遷移，影響細胞增殖，增加腫瘤血管生成。Orai1鈣通道的激活依賴于與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白STIM1的相互作用。鈣離子信號與腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展密切相關，Orai1已經(jīng)成為治療腫瘤的新的有效靶點[28]。但是，目前研究使用的Orai1鈣通道抑制劑，如2-APB和SKF-96365，并沒有特異性，在抑制Orai通道的同時，也會抑制其他一些鈣通道。我們課題組合成了與STIM1相互作用區(qū)域的Orai3-CT多肽，并偶聯(lián)了細胞穿透肽TAT，成功將TAT-Orai3CT多肽（YGRKKRRQRRRGGRSLVAHKTDRYKQELEELNRLQ GELQAV）導入乳腺癌細胞內(nèi)，并阻斷了Orai1與STIM1的相互作用，抑制了細胞內(nèi)的鈣內(nèi)流，而且有效抑制了乳腺癌細胞的增殖[29]。

6 展望

目前，蛋白質(zhì)相互作用已經(jīng)成為了重要的抗腫瘤靶點，通過阻斷蛋白質(zhì)相互作用從而抑制相關受體的過度激活、促進免疫細胞活化以及誘導細胞凋亡等，給腫瘤帶來了新的治療策略。很多針對蛋白質(zhì)相互作用開發(fā)的小分子藥物取得了較好的療效，但特異性差及耐藥性是其主要問題。另外針對蛋白質(zhì)相互作用開發(fā)的單克隆抗體應用到了臨床，但成本太高，其次開發(fā)難度大，很多蛋白質(zhì)相互作用的表面比較大而且相對平坦，并沒有很好的抗體結(jié)合區(qū)域，因此這是單克隆抗體藥物開發(fā)的局限性，而小分子多肽則具有很大的優(yōu)勢[30]。首先，針對蛋白質(zhì)相互作用位點合成的多肽已被證明能夠有效阻斷蛋白質(zhì)相互作用，發(fā)揮抗腫瘤作用；其次，抗腫瘤肽分子量小，易于侵入腫瘤細胞；再次，抗腫瘤肽易于合成，成本低，且免疫原性低，副作用?。蛔詈?，抗腫瘤肽靶向性好，而且可以通過納米藥物傳輸系統(tǒng)進行靶向釋放。但小分子多肽的主要缺陷是其不穩(wěn)定性，易于降解。針對這一問題有兩種策略能夠提高多肽的構(gòu)象穩(wěn)定性。一種是通過環(huán)化作用，多肽可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)、“訂書釘”肽等新的更加穩(wěn)定的構(gòu)象，另一種是通過修飾作用，將多肽鏈中參入D型氨基酸或者β氨基酸分別合成D型多肽和β型多肽，也可將多肽側(cè)鏈與氮原子相連，形成類肽。這些修飾的多肽能夠更加穩(wěn)定且有效地阻斷重要蛋白之間的相互作用，從而發(fā)揮更好的抗腫瘤作用[31]?？傊谧钄嗟鞍踪|(zhì)相互作用的抗腫瘤肽以其獨有的優(yōu)勢在腫瘤治療中具有廣闊的前景。