盧亞鳳，殷梅

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，云南 昆明 650101）

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea syndrome,OSAS）是一種睡眠呼吸相關(guān)性疾病，可導(dǎo)致全身多系統(tǒng)損傷，特別是認(rèn)知損害。有文獻(xiàn)[1]綜述了中國、美國、西班牙、印度、韓國、日本及瑞典在1993年—2013年的11項基于人口的OSAS患病率的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，男性O(shè)SAS患病率為22%，女性為17%，且患病率隨時間延長而升高。有研究[2]表明，合并OSAS腦卒中患者的認(rèn)知障礙更嚴(yán)重。OSAS患者存在輕度認(rèn)知障礙已被明確肯定[3]，但其具體機(jī)制未明。OSAS治療方法主要為持續(xù)性正壓通氣，能有效改善認(rèn)知障礙[4]，但要求患者有較高的依從性，其他治療手段及療效有限。因此，OSAS致認(rèn)知障礙的研究任重而道遠(yuǎn)。另一方面，早在2005年，LEMASTERS等[5]提出，缺氧、饑餓、能量匱乏等刺激能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生線粒體自噬。有研究[6]也提出，一定程度的缺氧能誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生線粒體自噬異常。慢性間歇性缺氧是OSAS主要的病理生理機(jī)制[7]，而海馬對缺氧的敏感性高[8]。本研究擬檢測OSAS模型大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的線粒體變化。其中，LC3及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ反映了細(xì)胞自噬小體的數(shù)量及線粒體自噬活性，而p62蛋白含量與其自噬活性成反比[9-10]；PINK1-Parkin途徑是線粒體自噬過程中最主要的分子機(jī)制之一[11-12]，也是線粒體質(zhì)量控制途徑[13-14]。目前國內(nèi)外關(guān)于線粒體自噬與OSAS的相關(guān)性研究較少。本研究擬通過檢測上述相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討線粒體自噬在OSAS模型大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞中的變化，可能為研究OSAS導(dǎo)致的認(rèn)知障礙開辟新的方向。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器

成年雄性SD大鼠24只，體重180～230 g/只，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部［生產(chǎn)許可證：SCXK（滇）K2015-0002］。LC3、p62、PINK1、Parkin抗體及β-actin抗體均購自美國CST公司，透明質(zhì)酸鈉凝膠購自上海其勝生物制劑公司，RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（6X）均購自廣州碧云天公司，蛋白酶抑制劑cocktail、Phostop磷酸化蛋白酶抑制劑購自羅氏公司，PVDF膜（0.22μm及0.45μm）、ECL顯色液購自密理博（上海）貿(mào)易有限公司，2.5%戊二醛、乙醇、醋酸雙氧鈾硝酸鉛、Epon812環(huán)氧樹脂均購自西隴化工。多參數(shù)神經(jīng)監(jiān)護(hù)儀購自上海諾誠醫(yī)療器械公司，光學(xué)顯微鏡、JEM-1011 TEM透射電子顯微鏡購自日本JEOL公司。

1.2 模型復(fù)制

將24只SD大鼠隨機(jī)分為對照組（6只）和實驗組（18只）。實驗組復(fù)制OSAS模型，對照組無特殊處理。

1.2.1 OSAS大鼠模型復(fù)制在YU等[15]學(xué)者的研究基礎(chǔ)上，參照周趙德等[16]的方法進(jìn)行模型復(fù)制：模型復(fù)制前，用多參數(shù)神經(jīng)監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測大鼠的血氧飽和度，然后用10%水合氯醛腹腔麻醉后，于大鼠舌根、咽腭弓、舌腭弓處，多點注射透明質(zhì)酸鈉凝膠，3 mL/只。注射完成后將大鼠按組別分籠飼養(yǎng)于SPF實驗動物房，實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，每日光照12 h，室內(nèi)溫度20～26℃，顆粒飼料自由飲食，每日更換墊料1次，保持飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生。

1.2.2 模型復(fù)制成功的標(biāo)準(zhǔn)正常大鼠活動正常，反應(yīng)靈敏，警覺性高，進(jìn)食正常；模型復(fù)制成功后的大鼠反應(yīng)慵懶，警覺性差，進(jìn)食減少，偶有呼吸節(jié)律不規(guī)則等。實驗組大鼠觀察4周后再次進(jìn)行血氧飽和度的監(jiān)測，比較模型復(fù)制前后的最低血氧飽和度及平均血氧飽和度，如果差異有統(tǒng)計學(xué)意義，可判定模型復(fù)制成功。

1.2.3 實驗取材實驗組大鼠模型復(fù)制成功后分別于2、4、6周脫頸處死，即為2周組、4周組和6周組，每組6只；對照組直接脫頸處死。酒精消毒，暴露并剔除顱骨取腦，在冰面上快速分離出海馬組織，一半置于EP管中放入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)鋀estern blotting檢測，一半置于2.5%戊二醛中避光后放入4℃冰箱中保存?zhèn)湫型干潆娮语@微鏡觀察。

1.3 Western blotting檢測大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞LC3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62、PINK1及Parkin的蛋白相對表達(dá)量

取大鼠海馬組織，每100 mg組織中加入500μL的RIPA裂解液（含50μL蛋白酶抑制劑），用無菌眼科剪剪碎后，冰浴環(huán)境下，用超聲細(xì)胞破碎儀勻漿20 s，冰浴上靜置裂解20 min。4℃下，12 000 r/min離心10 min，收集上清液。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定濃度，然后灌膠與上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用濕轉(zhuǎn)模法轉(zhuǎn)模；再將PVDF膜置于5%的牛血清白蛋白中，室溫（20～30℃）封閉1 h，于脫色搖床上，TBST漂洗3次，每次5 min，盡量吸干BSA液，加入一抗5 mL，裝入雜交袋中，將剪好的PVDF膜置于其中，捆綁于靜音混合儀上，放置4℃冰箱中過夜；去除一抗，加入TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min；加入酶標(biāo)二抗，室溫孵育2 h；洗膜后進(jìn)行ECL顯色。采集圖像，用Image J軟件測定海馬神經(jīng)細(xì)胞LC3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62、PINK1及Parkin蛋白相對表達(dá)量。β-actin為內(nèi)參。

1.4 透射電子顯微鏡觀察

取2.5%戊二醛4℃固定的海馬組織，用PBS緩沖液沖洗3次，每次10 min；用鋨酸固定后進(jìn)行乙醇系列梯度脫水，即用30%、50%、70%、90%、100%濃度的乙醇脫水，每次10 min，其中用100%的酒精進(jìn)行2次脫水；再用Epon812環(huán)氧樹脂包埋，分別在37℃、45℃、65℃的溫箱固化，每級溫度固化24 h；然后用UltracutE超薄切片機(jī)切片，再用醋酸雙氧鈾硝酸鉛染色后上機(jī)測試；最后用JEM-1011 TEM透射電子顯微鏡觀察并采集圖像。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較用t檢驗，多組比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OSAS對大鼠血氧飽和度的影響

實驗組大鼠模型復(fù)制前后最低血氧飽和度和平均血氧飽和度比較，采用配對t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。說明OSAS大鼠模型復(fù)制成功。

表1 實驗組大鼠模型復(fù)制前后最低血氧飽和度和平均血氧飽和度比較（%，±s）

表1 實驗組大鼠模型復(fù)制前后最低血氧飽和度和平均血氧飽和度比較（%，±s）

時間模型復(fù)制前模型復(fù)制后t值P值最低血氧飽和度87.1±2.2 75.2±1.7 19.242 0.000平均血氧飽和度94.9±1.6 84.8±2.3 19.116 0.000

2.2 OSAS對大鼠海馬細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

對照組、2周組、4周組和6周組大鼠的海馬神經(jīng)細(xì)胞LC3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62、PINK1及Parkin蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，2周組、4周組和6周組大鼠的海馬神經(jīng)細(xì)胞LC3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1及Parkin蛋白相對表達(dá)量均高于對照組（P＜0.05），p62蛋白相對表達(dá)量低于對照組（P＜0.05）；4周組LC3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1及Parkin蛋白相對表達(dá)量高于2周組（P＜0.05），p62表達(dá)均低于2周組（P＜0.05）；6周組LC3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1及Parkin蛋白相對表達(dá)量高于4周組（P＜0.05），p62表達(dá)低于4周組（P＜0.05）。見表2和圖1。

圖1 各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

表2 4組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量比較（n=6，±s）

表2 4組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量比較（n=6，±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與2周組比較，P＜0.05；③與4周組比較，P＜0.05。

組別對照組2周組4周組6周組F值P值LC3 0.764±0.030 0.912±0.062①1.056±0.067①②1.193±0.056①③15.502 0.004 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ0.713±0.087 0.931±0.066①1.117±0.025①②1.343±0.182①③10.044 0.012 p62 0.997±0.075 0.859±0.024①0.712±0.041①②0.500±0.051①③60.305 0.000 PINK1 0.645±0.124 0.859±0.031①1.043±0.102①②1.251±0.054①③24.201 0.001 Parkin 0.623±0.052 0.802±0.072①0.949±0.062①②1.121±0.135①③8.440 0.018

2.3 OSAS對大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體的影響

與對照組比較，2周組、4周組和6周組大鼠海馬區(qū)可見被雙層或多層磷脂雙分子層包裹的線粒體自噬體（見圖2及圖中箭頭所指）。

圖2 各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體透射電鏡圖（×20 000）

3 討論

慢性間歇性缺氧可致大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞受損，破壞海馬結(jié)構(gòu)[17]，而海馬在機(jī)體情緒和認(rèn)知中發(fā)揮重要作用[18]。本課題組前期研究[16]表明，咽腔注射透明質(zhì)酸鈉凝膠的方法可復(fù)制OSAS大鼠模型，且OSAS可致大鼠空間記憶力損害，飼養(yǎng)時間越長受損程度越重?？梢?，OSAS對認(rèn)知功能造成的影響不容忽視。本研究從OSAS最主要的病理機(jī)制——慢性間歇性缺氧出發(fā)，運(yùn)用同樣的方法復(fù)制OSAS大鼠模型，結(jié)果顯示，模型復(fù)制后的OSAS大鼠反應(yīng)遲鈍，警覺性較差，且血氧飽和度低于對照組，說明模型復(fù)制成功。

另一方面，線粒體自噬，俗稱“自己吃自己”，能通過自噬迅速清除自身功能失調(diào)線粒體和已損壞的細(xì)胞器[19]。在人體內(nèi)，衰老、局部活性氧的積累、暴露于毒素、缺氧等條件下均可發(fā)生線粒體損傷[14]；本研究在電鏡下觀察到OSAS大鼠海馬細(xì)胞被雙層或多層磷脂雙分子層包裹的線粒體自噬體，進(jìn)一步檢測其自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組比較，2周組、4周組、6周組LC3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1及Parkin蛋白表達(dá)均升高，p62表達(dá)均下降，說明模型復(fù)制后繼續(xù)飼養(yǎng)時間越長，OSAS大鼠線粒體自噬相關(guān)蛋白LC3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1及Parkin的表達(dá)越高，p62蛋白表達(dá)越低，OSAS引起細(xì)胞自噬活性增加，自噬體生成增多，這和電鏡下觀察到的自噬小體增多的結(jié)果一致，證實了OSAS引起大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)線粒體自噬，這也與缺氧引起細(xì)胞線粒體自噬存在一致性。

一定程度的缺氧能導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生大量的活性氧[20]，而活性氧的過量積累會破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，引起多臟器細(xì)胞的損傷[21]，而神經(jīng)細(xì)胞突觸部分的能量需求來源于線粒體網(wǎng)[22-23]，這對神經(jīng)元的影響較為顯著。并且，線粒體自噬異常（線粒體過度自噬或缺失），均會損傷神經(jīng)細(xì)胞，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，最終損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)[24]。在本研究中，模型復(fù)制后繼續(xù)飼養(yǎng)時間越長，OSAS大鼠線粒體自噬相關(guān)蛋白LC3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1及Parkin的表達(dá)越高，p62蛋白表達(dá)越低，表明其線粒體自噬程度隨飼養(yǎng)時間延長而加重。這不排除隨著模型復(fù)制后時間的延長，可能存在線粒體的過度自噬，這種自噬異常有可能損傷神經(jīng)系統(tǒng)。

線粒體自噬也被稱為自噬-溶酶體途徑，自噬體的明顯增多可能是過度自噬，也可能是損害了自噬-溶酶體途徑[25]，了解線粒體自噬過程中具體的分子機(jī)制及其在神經(jīng)元動態(tài)平衡中的具體影響至關(guān)重要[14]。而本研究不足之處在于未能檢測其他自噬途徑及相關(guān)蛋白，但不可否認(rèn)的是，本研究也為進(jìn)一步研究線粒體自噬與OSAS大鼠海馬受損的相關(guān)性開辟了新的方向。