李坤，喻鋒，余國慶，陳志龍，王晶

（鄂州市中心醫(yī)院 骨科，湖北 鄂州 436000）

人體中骨代謝的穩(wěn)定性由骨重建維持，包括成骨細胞（Osteoblast,OB）介導(dǎo)的骨形成、破骨細胞（Osteoclast,OC）介導(dǎo)的骨吸收[1]。當骨重建平衡被打破，骨量將異常減少或增加，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎、佩吉特病等骨破壞性疾病，其中骨質(zhì)疏松發(fā)病率居首位，嚴重降低患者生活質(zhì)量[2]。目前骨質(zhì)疏松治療以基礎(chǔ)藥物、抗吸收藥物、骨生成藥物為主，但前兩類藥物無誘導(dǎo)骨生成能力，且安全性有待提升，骨生成藥物可刺激骨生成，但容易導(dǎo)致內(nèi)分泌紊亂。故進一步探討新型治療方式以改善骨質(zhì)疏松療效具有必要性。OC是機體中唯一具有骨吸收作用的細胞，目前調(diào)節(jié)OC活性被認為是治療骨質(zhì)疏松較為直接、有效的方式。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA,LncRNA）是新發(fā)現(xiàn)的一類非編碼RNA分子，幾乎參與mRNA轉(zhuǎn)錄、拼接、降解、翻譯等全部過程，已有國內(nèi)外研究證實其異常表達與OC活性關(guān)系密切[3-5]。但目前鮮有關(guān)于Lnc-AK077216對OC分化成熟的調(diào)控作用及具體機制的研究。鑒于此，本研究通過建立敲低Lnc-AK077216的RAW264.7細胞模型，探討Lnc-AK077216對OC分化成熟的調(diào)控作用，并探討相關(guān)調(diào)控機制，為骨質(zhì)疏松治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑及儀器

RAW264.7小鼠單核巨噬細胞（中國科學(xué)院細胞庫）。MEMα培養(yǎng)基（上海康朗生物科技有限公司），胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（美國Thermo Fisher Scientific公司），磷酸鹽緩沖液（PBS）[西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司]，Trizol試劑盒（北京柏萊斯特科技發(fā)展有限公司），RT-Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]，QIAGEN208054熒光定量試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]，抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase,TRAP）染色試劑盒（美國Sigma公司），Bradford蛋白定量試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司），ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技有限公司），6XD-3光學(xué)顯微鏡（上海光學(xué)儀器一廠），BX61型熒光顯微鏡（日本Olympus株式會社），實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）儀、ChemiDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞培養(yǎng)于MEMα培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%雙抗），于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞經(jīng)胰蛋白酶消化，以8×104個/mL接種于24孔板，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。觀察細胞生長狀態(tài)，當融合度達到50%左右時，吸棄上層培養(yǎng)液，PBS洗滌2次。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作說明書進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染Lnc-AK077216-shRNA、ControlshRNA的細胞分別設(shè)為轉(zhuǎn)染組和空載組。每孔板加入2 mL高糖DMEM培養(yǎng)液（含20%胎牛血清，不含抗生素），繼續(xù)培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡下觀察感染率。未經(jīng)處理的RAW264.7細胞設(shè)為對照組。每組設(shè)置5個復(fù)孔。

1.2.2 轉(zhuǎn)染后Lnc-AK077216 mRNA相對表達量檢測采用qRT-PCR法檢測空載組和轉(zhuǎn)染組的Lnc-AK077216 mRNA相對表達量。收集轉(zhuǎn)染48 h后的RAW264.7細胞，Trizol試劑盒提取細胞總RNA，取2μg樣本逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。采用瓊脂糖凝膠電泳法對產(chǎn)物進行鑒定，實施qRT-PCR。按照QIAGEN208054熒光定量試劑盒說明書設(shè)置反應(yīng)體系：2×SYBR Green Master Mix 10.5μL，正反向引物各0.7μL（10μmol/L），cDNA 1μL，dd H2O 7.6μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性25 s，60℃退火20 s，72℃延伸60 s，重復(fù)40個循環(huán)。Lnc-AK077216正向引物：5'-TGACAGTGCGCATGAGTGC CACGT-3'，反向引物：5'-TGTGGACGTGACGCACG TCTATGC-3'；β-actin正向引物：5'-CCAGATGCCG TGACGGCACAAGTC-3'，反向引物：5'-TGAACTCG TACCATACCGTGCGCA-3'。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。所有實驗重復(fù)3次求Ct均值。

1.2.3 TRAP染色取對數(shù)生長期RAW 264.7細胞以1.5×104個/孔接種于96孔板，待細胞鋪滿底部時采用DMEM高糖培養(yǎng)基（含100 ng/mL RANKL）進行誘導(dǎo)分化，隔天換液，7 d后行TRAP染色。移除孔中培養(yǎng)液，用PBS洗3次后吸除干凈；室溫下用4%多聚甲醛固定液固定20 min，用PBS洗3次后吸除干凈；加入配置好的TRAP染色液，置于37℃孵箱中孵育40 min；棄去培養(yǎng)液，加入PBS 100μL/孔，顯微鏡下觀察染色情況并計數(shù)，以≥3個細胞核，且TRAP染色陽性為OC鑒定標準；使用IPP軟件統(tǒng)計視野下TRAP陽性染色面積，每孔隨機選取3個視野求均值。

1.2.4 各組細胞骨保護蛋白（OPG）/細胞核因子κB受體活化因子配體（RANKL）/細胞核因子κB受體活化因子（RANK）mRNA相對表達量檢測收集各組誘導(dǎo)分化培養(yǎng)3 d的細胞，提取、鑒定總RNA方式及qRT-PCR法同1.2.2。OPG正向引物：5'-TTGTACGTT GCACGCCAGTGCACG-3'，反 向 引 物 ：5'-TACAACCAACTGCCACGTTGCACG-3'；RANKL正 向引物：5'-ACCGTGTCACGTTGCACTGCACGT-3'，反向引 物：5'-GTGACTCCAGTGCCGTGCATGCCA-3'；RANK正向引物：5'-CTGACGTGCACGTGCCACGTGG CA-3'，反向引物：5'-ATTGGAAACGGCACTTGAACTG CA-3'；β-actin正向引物：5'-TGACTGGCAGTCAGCA TGCGTGGC-3’，反向引物：5'-TGTACGTGCACGTGC CACGGCCAC-3'。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。所有實驗重復(fù)3次求Ct均值。

1.2.5 各組細胞OPG、RANKL、RANK蛋白相對表達量檢測采用Western blotting檢測各組細胞OPG、RANKL、RANK蛋白相對表達量。取各組誘導(dǎo)分化培養(yǎng)3 d的RAW264.7細胞，冰上操作，經(jīng)預(yù)冷PBS洗滌2次，棄去PBS。加入蛋白裂解液，置于離心管，冰上裂解30 min，4℃13 000 r/min離心15 min（離心半徑為8 cm），取上清液，使用Bradford蛋白定量試劑盒進行檢測。取50μg樣品加入5×SDSPAGE上樣緩沖液，沸水浴5 min。冰上冷卻后以恒定電壓進行聚偏二氟乙烯膜轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后加入50 g/L脫脂奶粉，室溫搖床孵育2 h。將封閉好的聚偏二氟乙烯膜置入雜交袋，加入一抗（1∶1 000）室溫孵育過夜，TBTS漂洗15 min×3次。再次將聚偏二氟乙烯膜置入雜交袋，加入二抗（1∶8 000）室溫孵育1 h后TBTS漂洗10 min×3次。將ECL A、B液等量混合，放入聚偏二氟乙烯膜，孵育10 s，吸除膜上發(fā)光液，采用ECL化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)對目的條帶進行檢測，以O(shè)PG、RANKL、RANK蛋白灰度值/內(nèi)參β-actin灰度值表示蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RAW264.7細胞轉(zhuǎn)染率

轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡下觀察同一視野里RAW264.7細胞轉(zhuǎn)染情況，轉(zhuǎn)染率＞70%。見圖1。

圖1 熒光顯微鏡下觀察RAW264.7細胞轉(zhuǎn)染率（×100）

2.2 轉(zhuǎn)染后細胞Lnc-AK077216 mRNA相對表達量下降

轉(zhuǎn)染48 h后對照組、空載組、轉(zhuǎn)染組細胞Lnc-AK077216 mRNA相對表達量分別為（0.74±0.08）、（0.71±0.09）、（0.47±0.05），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=19.324，P=0.000），轉(zhuǎn)染組Lnc-AK077216 mRNA相對表達量均低于對照組和空載組（P＜0.05）；對照組與空載組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染后各組Lnc-AK077216 mRNA相對表達量（±s）

2.3 誘導(dǎo)分化RAW 264.7細胞后的形態(tài)學(xué)變化

誘導(dǎo)分化前RAW264.7細胞多呈圓形且形態(tài)規(guī)則，誘導(dǎo)分化7 d后經(jīng)TRAP染色，可觀察到呈陽性的多核巨細胞，細胞有偽足、突起，且體積較大，表明生成OC。見圖3。

圖3 RAW 264.7細胞誘導(dǎo)分化前、誘導(dǎo)分化7 d后TRAP染色結(jié)果（×100）

2.4 各組OC數(shù)、陽性染色面積比較

各組OC數(shù)、陽性染色面積比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），轉(zhuǎn)染組OC數(shù)少于對照組和空載組（P＜0.05），陽性染色面積小于對照組和空載組（P＜0.05）；對照組與空載組OC數(shù)、陽性染色面積比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1和圖4。

表1 各組OC數(shù)、陽性染色面積比較（±s）

表1 各組OC數(shù)、陽性染色面積比較（±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與空載組比較，P＜0.05。

組別對照組空載組轉(zhuǎn)染組F值P值OC數(shù)/個237.58±29.97 235.01±30.14 106.86±11.25①②43.344 0.000陽性染色面積/μm2 322 567.56±42 561.32 311 635.12±46 964.21 207 561.20±25 682.94①②12.924 0.000

圖4 各組細胞TRAP染色結(jié)果（×100）

2.5 各組細胞OPG、RANKL、RANK mRNA相對表達量比較

各組細胞OPG、RANKL、RANK mRNA相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），轉(zhuǎn)染組OPG mRNA相對表達量高于對照組和空載組（P＜0.05），RANKL、RANK mRNA相對表達量低于對照組和空載組（P＜0.05）；對照組和空載組OPG、RANKL、RANK mRNA相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組細胞OPG、RANKL、RANK mRNA相對表達量比較（±s）

表2 各組細胞OPG、RANKL、RANK mRNA相對表達量比較（±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與空載組比較，P＜0.05。

組別對照組空載組轉(zhuǎn)染組F值P值OPG mRNA 0.46±0.05 0.48±0.07 0.71±0.08①②20.978 0.000 RANKL mRNA 0.62±0.08 0.59±0.06 0.32±0.04①②35.302 0.000 RANK mRNA 0.70±0.08 0.69±0.09 0.42±0.05①②22.265 0.000

2.6 各組細胞OPG、RANKL、RANK蛋白相對表達量比較

各組細胞OPG、RANKL、RANK蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），轉(zhuǎn)染組OPG蛋白相對表達量高于對照組和空載組（P＜0.05），RANKL、RANK蛋白相對表達量低于對照組和空載組（P＜0.05）；對照組和空載組OPG、RANKL、RANK蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3和圖5。

表3 各組細胞OPG、RANKL、RANK蛋白相對表達量比較（±s）

表3 各組細胞OPG、RANKL、RANK蛋白相對表達量比較（±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與空載組比較，P＜0.05。

組別對照組空載組轉(zhuǎn)染組F值P值OPG蛋白0.51±0.06 0.49±0.05 0.82±0.09①②36.162 0.000 RANKL蛋白0.79±0.08 0.78±0.09 0.35±0.06①②52.293 0.000 RANK蛋白0.85±0.09 0.82±0.07 0.41±0.05①②58.484 0.000

圖5 各組細胞OPG/RANKL/RANK通路蛋白表達

3 討論

骨質(zhì)疏松好發(fā)于老年群體，研究認為高齡、內(nèi)分泌異常、肥胖、偏食、缺乏運動、遺傳等均為其發(fā)生的危險因素[6-7]。骨質(zhì)疏松的直接病因是OC過度激活或破骨前體細胞向OC過度分化，導(dǎo)致骨吸收過程加速，并以骨組織顯微結(jié)構(gòu)變化、骨量降低等為主要病理改變[8]。OC經(jīng)過細胞成熟和極化，骨吸收面細胞中生成肌動蛋白環(huán)，促使細胞膜形成微皺褶，與骨表面形成封閉區(qū)域，進而發(fā)揮骨吸收功能，參與骨質(zhì)疏松進程。因此，研究影響OC分化活性的基因?qū)τ诠琴|(zhì)疏松治療具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組Lnc-AK077216 mRNA相對表達量低于對照組和空載組；轉(zhuǎn)染組OC數(shù)少于對照組和空載組，TRAP陽性染色面積小于對照組和空載組，提示敲低LncRNA-AK077216可顯著抑制RAW264.7細胞向OC分化。LncRNA具有基因表達調(diào)控功能，廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)行為過程[10]。WANG等[11]表明，LncRNA LINC00311可通過調(diào)控Notch信號通路促進骨質(zhì)疏松模型大鼠中OC的增殖、分化。洪宇桁等[12]研究證實，LncRNA NEAT1在OC分化過程中過表達，且可促進OC分化并抑制OB分化進而誘發(fā)骨質(zhì)疏松。表明調(diào)控LncRNA可能作為影響OC分化的途徑之一。Lnc-AK077216可通過介導(dǎo)相關(guān)信號通路調(diào)控OB形成，其異常表達可影響破骨前體細胞向OC分化的活性，導(dǎo)致骨量紊亂。本研究結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后OC數(shù)量減少。由此可見，敲降Lnc-AK077216可顯著阻斷RAW264.7細胞向OC分化的過程，該基因可能成為骨質(zhì)疏松治療的潛在靶點。

本研究結(jié)果提示敲低Lnc-AK077216對RAW264.7細胞向OC分化的抑制作用可能與調(diào)控OPG、RANKL、RANK表達有關(guān)。OPG/RANKL/RANK信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)的OC分化過程中重要的信號傳導(dǎo)通路，該通路被激活后可延緩OC凋亡，通過復(fù)雜的機制促進骨基質(zhì)吸收，引發(fā)骨質(zhì)疏松[13-14]。破骨前體細胞或OC細胞表面RANK與RANKL結(jié)合后，介導(dǎo)信號激活破骨前體細胞向成熟OC分化，并抑制OC凋亡[15]。OPG可競爭性結(jié)合RANKL，阻斷RANKL與RANK結(jié)合，抑制破骨前體細胞分化，促使成熟OC凋亡。LIU等[16]研究證實，Lnc-AK077216可促進NFATc1表達，而NFATc1是OC形成過程中必需的轉(zhuǎn)錄因子，且去卵巢小鼠骨髓中Lnc-AK077216、NFATc1表達均上調(diào)。而NFATc1是RANKL/RANK信號系統(tǒng)下游關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[17]，故結(jié)合本研究結(jié)論推測Lnc-AK077216可通過介導(dǎo)OPG/RANKL/RANK信號通路影響OC分化。

綜上所述，敲低Lnc-AK077216可抑制RAW264.7細胞向OC分化，其調(diào)控機制可能與上調(diào)OPG mRNA及蛋白表達，下調(diào)RANKL和RANK mRNA及蛋白表達有關(guān)，提示Lnc-AK077216基因及其靶蛋白OPG、RANKL、RANK可能成為骨質(zhì)疏松及其他骨破壞相關(guān)疾病治療的潛在靶點，為臨床治療提供理論依據(jù)。Lnc-AK077216對OC分化的調(diào)控可能存在其他機制，仍需進一步研究。