劉居理，陳勝輝，楊韋華，韓靜，熊雪飛，章夢穎（南昌市生殖醫(yī)院，江西 南昌 330004）

近年來,不孕不育的發(fā)病率不斷攀升，給家庭及社會帶來了極大負(fù)擔(dān)。據(jù)WHO統(tǒng)計,不孕不育將成為僅次于腫瘤和心腦血管疾病的第三大疾?。?］。雖然不孕不育病因復(fù)雜，但遺傳因素是一個不容忽視的要素。隨著人類對自身基因的不斷了解以及基因測序技術(shù)在臨床上的普遍應(yīng)用，越來越多與生育相關(guān)的遺傳因素被闡明，遺傳因素在不孕不育中的作用也越來越受到生殖醫(yī)學(xué)工作者的重視［2］。

遺傳因素主要包括單基因病、多基因病及染色體病。染色體病是指由于染色體數(shù)目的異?；蚪Y(jié)構(gòu)的改變所引起的遺傳性疾?。?］。雖然單病種染色體病的發(fā)病率不高，但由于病種很多，因此綜合發(fā)病率高，危害大。已有研究表明,染色體病是造成不孕不育的一個非常重要的因素。染色體病不僅可導(dǎo)致人類生殖功能受損而無法懷孕，而且會引起流產(chǎn)、死胎及出生缺陷的發(fā)生［4］。如果能在孕前對染色體因素進行篩查，如存在無法生育的情況，則可借助供精或贈卵進行生育而避免無謂的治療；如存在生育困難或生育缺陷患兒的風(fēng)險，則可通過輔助生殖技術(shù)助孕并借助胚胎種植前診斷技術(shù)或產(chǎn)前診斷技術(shù)加以避免［5］。由于產(chǎn)前診斷需進行有創(chuàng)操作，可能對孕婦及胎兒造成損傷，而利用胚胎種植前診斷技術(shù)，則可減輕或避免。因此，對于染色體異常的不孕不育夫婦，最佳的治療手段就是通過輔助生殖技術(shù)助孕，利用種植前基因診斷技術(shù)對胚胎進行甄別，擇優(yōu)移植。

目前，對于正常人群中染色體類型及分布情況的研究較為常見，但對于輔助生殖技術(shù)中不孕不育患者的染色體相關(guān)調(diào)查研究并不多。為進一步了解輔助生殖技術(shù)中不孕不育患者染色體核型異常率、異常類型及分布情況，探討染色體核型異常與不孕不育的關(guān)系，為優(yōu)生及輔助生殖技術(shù)中治療方案的合理選擇提供指導(dǎo)，本文對來我院行輔助生殖技術(shù)助孕的不孕不育患者進行了外周血染色體核型分析。報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2016年5月至2021年4月我院生殖中心收治的8 993例擬行輔助生殖技術(shù)助孕的不育不孕患者,其中男性4 108例、女性4 885例。

1.2 研究方法

1.2.1 血液標(biāo)本采集 利用真空采血法，抽取受檢者靜脈血2 ml于肝素抗凝管。

1.2.2 細胞接種 將0.4 ml血液接種于5 ml淋巴細胞培養(yǎng)基（廣州達暉生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）中。

1.2.3 細胞培養(yǎng) 將培養(yǎng)瓶置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中68～72 h。在終止培養(yǎng)前2 h加入20μl濃度為20μg/ml的秋水仙素。

1.2.4 細胞收獲 將培養(yǎng)液用吸管吸至15 ml尖底離心管中，1 500 rpm離心10 min，棄上清，留沉淀。

1.2.5 低滲處理 在上述沉淀中加入預(yù)溫至37℃的0.075 mol/L KCl溶液8 ml，混勻后放入于37℃水浴25 min。

1.2.6 預(yù)固定 將現(xiàn)配的甲醇、冰醋酸（3：1）固定液1 ml加入離心管，混勻后室溫放置5 min，1 500 rpm離心10 min，棄上清，留沉淀。

1.2.7 固定 將固定液8 ml加入離心管，混勻后室溫放置5 min，1 500 rpm離心10 min，棄上清，留沉淀。再次重復(fù)此步驟1次。

1.2.8 滴片 用適量固定液將沉淀重懸后在冰片上滴片，并放入65℃烤箱過夜。

1.2.9 顯帶與染色 采用0.25%胰酶進行消化，利用Giemsa溶液進行染色。

1.2.10 核型分析 在顯微鏡下計數(shù)30個中期分裂相，分析5個細胞核型，染色體異常者計數(shù)加倍。核型結(jié)果根據(jù)人類細胞遺傳學(xué)國際命名體制標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 男、女性染色體核型結(jié)果分析（1）在所檢測的8993例擬行輔助生殖技術(shù)助孕患者中，共檢出330例染色體核型異常，異常率為3.67%：其中常染色體異常64例，占19.39%；性染色體異常266例，占80.61%。其染色體異常率明顯高于正常人群水平（0.5%～1.0%）。其中男性患者染色體異常率明顯高于女性患者（6.69%vs 1.12%）,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。在染色體核型異常方面：男性患者性染色體異常率要明顯高于常染色體異常率（87.27%vs 12.73%），差異具有顯著性；而女性患者性染色體異常率與常染色體異常率比較（47.27%vs 52.73%），無顯著差異。見表1、表2。（2）在所檢測的8993例擬行輔助生殖技術(shù)助孕患者中，共檢出134例染色體核型多態(tài)，多態(tài)率為1.49%，稍低于正常人群水平（2.16%）：其中男性染色體多態(tài)77例，多態(tài)率1.87%；女性染色體多態(tài)57例，多態(tài)率1.17%。男女性多態(tài)率具有顯著性差異。見表1。

表1 男、女性染色體核型結(jié)果分析（n）

表2 男、女性染色體核型異常分析[n，（%）]

2.2 染色體核型異常類型分布 在所檢出的330例異常染色體核型患者中：男性、女性的構(gòu)成比分別為83.33%和16.67%，男性異常占比明顯高于女性；其中最常見的性染色體異常類型為數(shù)目增加（構(gòu)成比62.43%），其次為性反轉(zhuǎn)（構(gòu)成比9.09%）；最常見的常染色體異常類型為結(jié)構(gòu)異常，主要為平衡易位及羅氏易位,其構(gòu)成比分別為10.91和4.55。在所檢出的275例男性異常染色體核型患者中：最常見的性染色體異常類型為數(shù)目增加（其中最為常見的核型為47，XXY，共192例），其次為性反轉(zhuǎn)（46，XX，共28例）。在所檢出的55例女性異常染色體核型患者中：最常見的性染色體異常類型為嵌合體（13例），其次為數(shù)目增加（5例）。而男、女性最常見的常染色體異常類均為結(jié)構(gòu)異常，且以平衡易位及羅氏易位為主。見表3。

表3 染色體核型異常類型分布

2.3 染色體核型多態(tài)性分布 在所檢出的134例染色體多態(tài)核型中：男性、女性的構(gòu)成比分別為57.46%vs 42.54%，男性占比高于女性,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；常染色體中最常見的多態(tài)類型為9號染色體倒位（構(gòu)成比46.27%），其次為次縊痕延長（構(gòu)成比17.92%）；性染色體中最常見的多態(tài)類型為小Y（構(gòu)成比11.94%），其次是Y染色體倒位（構(gòu)成比7.46%）。見表4。

表4 染色體核型多態(tài)性分布

3 討論

據(jù)WHO統(tǒng)計，不孕不育在己婚夫婦中的發(fā)病率約為15%［6］。有研究表明，男性不育癥患者約15%是由于染色體異常導(dǎo)致的［7］，不良孕產(chǎn)史夫婦約14%存在染色體異常［8］。在人類的生殖過程中，遺傳物質(zhì)通過男女雙方配子結(jié)合的方式傳遞給后代。染色體作為遺傳物質(zhì)的重要載體,對人類的生殖健康起著決定性作用。染色體異常將給人體帶來諸多影響，如不孕不育、發(fā)育異常、智力缺陷、死亡等。染色體異常主要包括常染色體異常、性染色體異常及染色體多態(tài)［9］。

常染色體和性染色體異常主要表現(xiàn)為數(shù)目和結(jié)構(gòu)的異常。數(shù)目異常主要類型有整倍體異常、非整倍體異常和嵌合體。由于整倍體異常個體不能存活，因此不孕不育患者中染色體數(shù)目異常均表現(xiàn)為非整倍體異常和嵌合體異常。本文共檢出染色體數(shù)目異常240例，其中常染色體數(shù)目異常10例（21三體7例、標(biāo)記染色體3例），性染色體數(shù)目異常230例（男性211例、女性19例）。性染色體數(shù)目異常中男性以47，XXY核型為主（192例），女性以45，X0/46，XX嵌合體（10例）和47，XXX(7例)核型為主。以上結(jié)果說明：來我院就診的不孕不育患者中，常染色體數(shù)目異常比例不高，主要以性染色體數(shù)目異常為主，且男性性染色體數(shù)目異常率明顯高于女性，其中絕大部分為Klinefelter綜合癥患者。以往認(rèn)為此類患者一般不能生育［10］。但隨著輔助生殖技術(shù)的提高及睪丸顯微取精、微量精子冷凍技術(shù)的應(yīng)用，臨床上已有不少Klinefelter綜合癥患者睪丸中發(fā)現(xiàn)了精子并借助輔助生殖技術(shù)獲得了自己后代的報道［11-13］。另外，在染色體結(jié)構(gòu)異常方面，本文共檢出常染色體結(jié)構(gòu)異常54例，其中男性28例、女性26例，平衡易位36例、羅氏易位15例、倒位、片段缺失及增加各1例。此結(jié)果提示：在常染色體結(jié)構(gòu)異常中，易位是導(dǎo)致不孕不育發(fā)生的主要類型，且發(fā)生率與性別無關(guān)。本文共檢出性染色體結(jié)構(gòu)異常36例，其中男性29例（性反轉(zhuǎn)28例、X等臂染色體1例），女性7例（性反轉(zhuǎn)2例、X等臂染色體2例、X染色體部分缺失3例）。說明在性染色體結(jié)構(gòu)異常中，性反轉(zhuǎn)是導(dǎo)致不孕不育發(fā)生的主要類型，且男性發(fā)生率遠高于女性。對于此類患者，需避免盲目治療，只能通過贈卵或供精進行生育。

染色體異常類型中的多態(tài)比較特殊，由于染色體多態(tài)一般發(fā)生在異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中，而該區(qū)域不含功能基因，因此傳統(tǒng)觀點認(rèn)為染色體多態(tài)不會引起表型效應(yīng)［14］。但隨著對染色體多態(tài)的研究報道不斷增多，也有觀點認(rèn)為，其可導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎及不孕不育［15-16］。本文共檢出134例染色體多態(tài)，多態(tài)率為1.49%，稍低于正常人群水平（2.16%）［17］。本文結(jié)果并不能為染色體多態(tài)會導(dǎo)致不孕不育的觀點提供支持。在本研究中，男、女性染色體多態(tài)的構(gòu)成比分別為57.46%vs 42.54%，男性占比高于女性,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。其主要原因在于染色體多態(tài)存在性別差異，由于Y染色體多態(tài)較為常見，而X染色體多態(tài)極少，故男性染色體多態(tài)率總體上要高于女性。本文共檢出Y染色體多態(tài)33例，而X染色體多態(tài)未檢出。Y染色體多態(tài)占男性染色體檢出多態(tài)的42.86%，類型為Y染色體倒位、大Y及小Y；共檢出常染色體多態(tài)101例，包括次縊痕延長、DG組隨體延長或縮短及9號染色體倒位。其中9號染色體倒位最為常見，占常染色體多態(tài)的61.39%。多態(tài)的類型及分布情況與有關(guān)文獻報道基本一致。

從本文研究結(jié)果來看，在8993例擬行輔助生殖技術(shù)助孕患者中，共檢出330例（不含多態(tài)）染色體核型異常，異常率為3.67%。染色體異常率要顯著高于正常人群水平（0.5%～1.0%）［18］，提示染色體異常與不孕不育密切相關(guān)。在我院擬行輔助生殖助孕的這些不孕不育患者中，絕大部分染色體異?；颊卟o明顯臨床表現(xiàn)，對生活影響也不大，因此其致病風(fēng)險很容易被忽視。而不孕不育患者若不能及時明確病因則可能進行無謂治療，甚至生育患有遺傳性疾病的后代，將對個體的生存及生活質(zhì)量產(chǎn)生很大影響。因此，在輔助生殖技術(shù)過程中有必要對夫妻雙方進行染色體核型篩查，并根據(jù)核型結(jié)果決定治療方案，以避免盲目治療、不良妊娠及缺陷后代的出生。