田時(shí)雨 張蓓林 雷陽(yáng) 封聞 呂立堂

摘要：生長(zhǎng)素反應(yīng)因子（Auxin response factor）作為調(diào)控生長(zhǎng)素應(yīng)答基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育起著十分重要的作用。研究結(jié)合茶樹(shù)基因組數(shù)據(jù)，使用生物信息學(xué)分析，共鑒定出25個(gè)ARF基因，并將其命名為CsARF1～CsARF25?？蓪⑺鼊澐秩?個(gè)亞族，同一亞族內(nèi)的基序和保守結(jié)構(gòu)域相對(duì)保守。通過(guò)對(duì)CsARF順勢(shì)作用元件的分析，發(fā)現(xiàn)其可能參與茶樹(shù)對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)和調(diào)控茶樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)情況分析，CsARF在茶樹(shù)不同組織的表達(dá)情況有很大區(qū)別，從一定程度上說(shuō)明了CsARF參與調(diào)控茶樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育，qRT-PCR驗(yàn)證分析結(jié)果趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本一致，也從側(cè)面驗(yàn)證了這一結(jié)果。研究結(jié)果可為茶樹(shù)ARF基因家族的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)和參考。

關(guān)鍵詞：茶樹(shù);ARF基因家族;基因表達(dá)分析

Identification and Expression Analysis of

Auxin Response Factor （ARF） Gene Family in

Tea Plants （Camellia sinensis）

TIAN Shiyu1，2， ZHANG Beilin3， LEI Yang1， FENG Wen4， L? Litang2*

1. Guizhou Vocational College of Agriculture， Guiyang 551499， China; 2. College of Tea Science， Guizhou University，

Guiyang 550025， China; 3. Guizhou Polytechnic of Construction， Guiyang 551400， China;

4. Quzhou Lüfeng Industry and Trade Co.， Ltd.， Quzhou 324000， China

Abstract： As a transcription factor that regulates the expression of auxin response genes， auxin response factor （ARF）plays a very important role in regulating plant growth and development. In this study， combining the tea genome data and bioinformatics analysis， a total of 25 ARF genes were identified and named CsARF1-CsARF25 respectively. They could be divided into 5 subfamilies， and the motifs and conserved domains in the same subfamilies are relatively conservative. Through the analysis of the homeopathic elements of CsARFs， it was found that they may participate in the response of tea plants to stresses and regulate the growth and development of tea plants. Through transcriptome gene expression analysis， the expressions of CsARFs in different tissues of tea plants are very different. It also indicates that CsARFs might be involved in regulating the growth and development of tea plants. The trend of qRT-PCR verification and analysis results were basically consistent with the transcriptome data. This study provided acertain theoretical basis and reference for further study of the CsARF gene family.

Keywords： Camellia sinensis， ARF gene family， Gene expression analysis

茶樹(shù)（Camellia sinensis L.）作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，在全世界多個(gè)國(guó)家及地區(qū)廣泛種植[1]。采摘茶樹(shù)鮮葉加工而成的茶葉產(chǎn)品具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。同時(shí)，茶葉的內(nèi)含物質(zhì)，如茶多酚、茶氨酸和茶多糖等，具有清腸胃、助消化、抗菌[2]、清血管、減脂[3]、降三高[4]和抗氧化[5]等保健功能，因而深受?chē)?guó)內(nèi)外廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。茶樹(shù)在生長(zhǎng)過(guò)程中受到很多因素的影響，植物激素是其重要的調(diào)節(jié)因素之一，對(duì)茶樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程起到至關(guān)重要的作用。

生長(zhǎng)素（Auxin）是植物體內(nèi)最為常見(jiàn)的激素之一，在植物的生長(zhǎng)分化過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。而生長(zhǎng)素反應(yīng)因子（ARF）作為調(diào)控生長(zhǎng)素應(yīng)答基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于茶樹(shù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及生長(zhǎng)發(fā)育起到非常重要的作用[6]。植物對(duì)生長(zhǎng)素信號(hào)的傳遞與轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，通常是由生長(zhǎng)素反應(yīng)因子以基因家族的形式來(lái)進(jìn)行調(diào)控的，如Aux/IAA和SAUR基因家族，對(duì)于調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起到了非常重要的意義[7]。ARF大多具有3個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域，即N端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain， DBD）、中間區(qū)域和C端二聚作用結(jié)構(gòu)域（Carboxy-terminal dimerization domain， CTD）[8]。ARF特異性結(jié)合到植物生長(zhǎng)素反應(yīng)基因啟動(dòng)子上的生長(zhǎng)素反應(yīng)元件（Auxin response elements，AuxRE）TGTCTC，從而控制調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素反應(yīng)基因的特異性表達(dá)[9]。6082ADD5-E0B6-4BED-A151-861268587491

近年來(lái)，隨著基因組數(shù)據(jù)的測(cè)定，越來(lái)越多植物種類的ARF家族成員被鑒定出來(lái)，如擬南芥中ARF家族成員23個(gè)[10]、水稻中25個(gè)[11]、玉米中31個(gè)[12]、蘋(píng)果中29個(gè)[13]、梨中31個(gè)[14]、杜仲中18個(gè)[15]、蓮中30個(gè)[16]、煙草中50個(gè)[17]、番茄中17個(gè)[18]、甜橙中19個(gè)[19]等。本研究從茶樹(shù)的ARF基因家族著手展開(kāi)，利用生物信息學(xué)的相關(guān)研究方法和研究軟件，對(duì)茶樹(shù)的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，找到并鑒定其ARF家族成員，并對(duì)其相關(guān)特性及通過(guò)熒光定量PCR鑒定不同組織的表達(dá)情況進(jìn)行相應(yīng)的研究，以期為茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育的相關(guān)研究起到一定的參考作用。

1 ?材料與方法

1.1 ?茶樹(shù)ARF基因家族的篩選與鑒定

從茶樹(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//tpia.teaplant.org）中下載茶樹(shù)ARF基因組相關(guān)數(shù)據(jù)，構(gòu)建本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)。以擬南芥與水稻已經(jīng)鑒定出的ARF蛋白序列為目標(biāo)序列，在茶樹(shù)蛋白庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，設(shè)定閾值為E

將第二次所得到的茶樹(shù)ARF蛋白序列在NCBI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的鑒定，刪除部分不含ARF特征結(jié)構(gòu)域的蛋白序列，最終得到茶樹(shù)ARF基因。在Expasy（https：//web.expasy.org/compute_pi）上鑒定茶樹(shù)ARF蛋白序列的等電點(diǎn)（PI）和相對(duì)分子質(zhì)量。

1.2 ?系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析

利用進(jìn)化樹(shù)分析軟件MEGA7對(duì)水稻、擬南芥和茶樹(shù)的ARF蛋白進(jìn)行比對(duì)，繼而采用臨近法（Boostrap=1 000）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。再將茶樹(shù)ARF蛋白序列提交至MEME（http：//meme-suite.org）進(jìn)行保守序列分析，設(shè)置為20個(gè)模體（motif）數(shù)量，模體寬度范圍設(shè)置為6～50個(gè)氨基酸。將茶樹(shù)ARF基因的DNA序列在GSDS 2.0 （http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析。

1.3 ?茶樹(shù)不同組織ARF的表達(dá)分析

根據(jù)已鑒定的茶樹(shù)ARF基因編號(hào)，在TPIA（http：//tpia.teaplant.org）數(shù)據(jù)庫(kù)上下載它們?cè)诓铇?shù)不同組織（花、莖、根、頂芽、嫩葉、成熟葉、老葉）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（TPM值），對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，再利用TBtools構(gòu)建熱圖進(jìn)行可視化。

1.4 ?茶樹(shù)ARF基因的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

利用模式識(shí)別數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/ bioinf/plant-multi）對(duì)茶樹(shù)ARF蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)[20]。

1.5 ?茶樹(shù)ARF基因順勢(shì)作用元件分析

利用茶樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，截取茶樹(shù)ARF基因上游2 000 bp的基因序列，在PlantCare（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html）中進(jìn)行順式作用元件的分析。

1.6 ? 茶樹(shù)ARF家族基因的qRT-PCR表達(dá)分析

取茶樹(shù)嫩葉、老葉和莖提取總RNA，使用改良CTAB法提取RNA，使用Genenode公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成操作，以茶樹(shù)肌動(dòng)蛋白基因?yàn)閮?nèi)參基因（Sense ： 5'-CAGACCGTATGAGCAAGGAAAT-3'，Antisense：5'-GTGCTTAGGGATGCAAGGATAG-3'），采用Primer Premier v6.0軟件設(shè)計(jì)候選基因特異性引物（表1），qRT-PCR實(shí)驗(yàn)在CFX100 Realtime PCR System（Bio-Rad，CA，USA）上進(jìn)行。反應(yīng)條件為95 ℃30 s、95 ℃15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40次循環(huán)，溶解溫度55～95 ℃，5 s，4 ℃保存。反應(yīng)體系按照SYBR Green Realtime-PCR Mastermix說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，結(jié)果通過(guò)相對(duì)定量2-ΔΔCT方法計(jì)算，最后利用Excel作圖。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?茶樹(shù)CsARF基因家族鑒定及其理化性質(zhì)

根據(jù)擬南芥ARF蛋白序列，在茶樹(shù)基因組蛋白序列中通過(guò)2次BLAST比對(duì)后，再通過(guò)保守結(jié)構(gòu)域的篩選，去除部分不含ARF特征結(jié)構(gòu)域的蛋白序列，共得到25個(gè)茶樹(shù)ARF基因。

為便于后續(xù)研究，以CsARF1-25對(duì)茶樹(shù)ARF基因進(jìn)行命名。CsARF基因編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)如表2。由表2可知茶樹(shù)CsARF蛋白中最長(zhǎng)為1 077個(gè)氨基酸（CsARF15），最短為353個(gè)氨基酸（CsARF7），相對(duì)分子質(zhì)量在39 444.98（CsARF7）至120 236.32（CsARF14）之間。較為有趣的一點(diǎn)是，CsARF蛋白的等電點(diǎn)大多小于7，可知組成CsARF蛋白的氨基酸多為酸性氨基酸。對(duì)CsARF蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)的結(jié)果可以看出，所有的CsARF蛋白都定位在細(xì)胞核內(nèi)，這與其作為轉(zhuǎn)錄因子的功能相符合。

2.2 ?CsARF系統(tǒng)進(jìn)化分析

將擬南芥ARF基因家族25個(gè)成員、水稻ARF基因家族25個(gè)成員與茶樹(shù)ARF基因家族的25個(gè)成員進(jìn)行多序列比對(duì)，并利用臨近法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖1）。由圖1可得，根據(jù)擬南芥ARF基因家族的劃分，可將茶樹(shù)25個(gè)ARF分為5個(gè)亞組。其中8個(gè)CsARF基因分入Ⅰ亞組（CsARF2、CsARF6、CsARF9、CsARF14、CsARF15、CsARF17、CsARF22和CsARF25）;3個(gè)CsARF基因劃入Ⅱ亞組（CsARF11、CsARF18和CsARF16）;8個(gè)CsARF基因劃入Ⅲ亞組（CsARF4、CsARF5、CsARF8、CsARF12、CsARF19、CsARF21、CsARF23和CsARF24）;1個(gè)CsARF基因劃入Ⅳ亞組（CsARF3）;5個(gè)CsARF基因劃入Ⅴ亞組（CsARF1、CsARF7、CsARF10、CsARF13和CsARF20）。6082ADD5-E0B6-4BED-A151-861268587491

從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中不難發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)ARF基因與擬南芥ARF基因同源性較高，而與水稻ARF基因則相對(duì)疏遠(yuǎn)，暗示了茶樹(shù)與擬南芥ARF基因的進(jìn)化時(shí)間要晚于茶樹(shù)與擬南芥的物種分化時(shí)間，而茶樹(shù)與水稻的情況則相反。

2.3 ?CsARF基因的染色體定位

利用茶樹(shù)基因組的注釋信息，可將CsARF基因定位在茶樹(shù)染色體上（圖2）。從圖2可知，CsARF在茶樹(shù)染色體上的定位并不均勻，其中7個(gè)CsARF基因不能定位在染色體上（CsARF3、CsARF5、CsARF6、CsARF7、CsARF13、CsARF22和CsARF25）。其余的18個(gè)CsARF基因不均等定位在各個(gè)茶樹(shù)染色上，其中3號(hào)、5號(hào)、9號(hào)和15號(hào)染色體上沒(méi)有CsARF基因，8號(hào)染色體上最多共有3個(gè)CsARF基因（CsARF2、CsARF17和CsARF16），其他染色體上均有1～2個(gè)CsARF基因。這種分布情況的出現(xiàn)有可能是源自CsARF基因在茶樹(shù)的進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了復(fù)制或丟失。

2.4 ?CsARF基因保守結(jié)構(gòu)域分析

利用NCBI-CDD和MEME分析CsARF蛋白保守結(jié)構(gòu)域如圖3，可以看出同一亞組之中，保守結(jié)構(gòu)域的組成和排序基本相同，其中Ⅳ亞組中沒(méi)有3號(hào)模體，而其他亞組中的第一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域均為3號(hào)模體，暗示了Ⅳ亞組的CsARF基因在進(jìn)化過(guò)程中可能出現(xiàn)了部分丟失的情況。各個(gè)亞組之中的CsARF蛋白的保守結(jié)構(gòu)域也基本一致，大部分CsARF都含有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（DBD、ARF和CTD），其中較為有趣的是Ⅴ亞組之中的CsARF7，作為唯一個(gè)不含ARF結(jié)構(gòu)域的CsARF基因，經(jīng)對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)域7后所連為結(jié)構(gòu)域8，其間缺少了部分重要結(jié)構(gòu)域，因而它不含ARF保守結(jié)構(gòu)域，暗示它可能在茶樹(shù)進(jìn)化過(guò)程中基因片段發(fā)生了部分丟失。

2.5 ?CsARF基因結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)茶樹(shù)基因組注釋信息，可得CsARF基因的基本結(jié)構(gòu)（圖4）。從圖4中可以發(fā)現(xiàn)所有的CsARF都具有2個(gè)以上的外顯子;其中同一亞組之中的基因結(jié)構(gòu)也基本一致，Ⅲ亞組的外顯子數(shù)目最少，只有2～3個(gè);其他亞組的外顯子數(shù)目則相對(duì)較多，最多為17個(gè)。

2.6 ?CsARF基因順式作用元件的分析

取CsARF基因上游2 000 bp的啟動(dòng)子區(qū)域序列，在PlantCare對(duì)其進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，結(jié)果如表3。所有的CsARF基因都具有光相應(yīng)元件，說(shuō)明CsARF基因家族與茶樹(shù)響應(yīng)光照方面具有很大聯(lián)系。絕大部分CsARF基因都具有響應(yīng)各種植物激素的作用，如赤霉素、乙烯、生長(zhǎng)素和水楊酸，證明了其在調(diào)控茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育方面起到了重要的作用。而且部分CsARF基因還具有響應(yīng)茶樹(shù)生長(zhǎng)逆境如干旱、寒冷和鹽脅迫的順式作用元件。暗示了CsARF基因可能不止與調(diào)控茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)，可能在茶樹(shù)抗逆性上也起到了一定的作用。

2.7 ?CsARF基因在不同組織中的表達(dá)情況分析

為進(jìn)一步了解CsARF在茶樹(shù)不同組織的表達(dá)情況，從TPIA上下載了茶樹(shù)不同組織轉(zhuǎn)錄組的TPM表達(dá)數(shù)據(jù)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并對(duì)其結(jié)果構(gòu)建熱圖進(jìn)行分析研究，結(jié)果如圖5。CsARF3、CsARF19、CsARF23、CsARF12和CsARF24在茶樹(shù)各個(gè)組織中幾乎不表達(dá)。而CsARF2、CsARF6、CsARF7、CsARF17、CsARF13和CsARF10則在茶樹(shù)各個(gè)組織之中的表達(dá)量相對(duì)較高。CsARF15、CsARF14、CsARF9、CsARF22和CsARF1則在各組織之中有較弱表達(dá)。其中CsARF2、CsARF6和CsARF17（屬Ⅰ亞組）在莖與花中表達(dá)量最高，其他組織中的表達(dá)相對(duì)較低，而CsARF10和CsARF13（屬Ⅴ亞組）則在成熟葉、老葉、嫩葉和果實(shí)中表達(dá)量最高。這種不同的表達(dá)趨勢(shì)，可能暗示了不同亞組的CsARF基因可能參與了茶樹(shù)不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)。

2.8 ?RT-PCR驗(yàn)證CsARF基因在茶樹(shù)不同組織的表達(dá)情況

根據(jù)CsARF的轉(zhuǎn)錄組情況，篩選出7個(gè)有顯著性差異的CsARF基因，分別為CsARF2、CsARF6、CsARF17、CsARF9、CsARF22、CsARF20和CsARF10。

對(duì)其進(jìn)行不同組織的RT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖6所示，CsARF基因在各組織的表達(dá)情況與茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果具有一定差異，但其趨勢(shì)基本保持一致。

3 ?討論

通過(guò)對(duì)茶樹(shù)全基因組的生物信息分析，共鑒定出25個(gè)CsARF基因，不同物種的ARF基因數(shù)量差距很大，如在大豆中有51個(gè)ARF基因[21]，而茶樹(shù)與水稻中則只有25個(gè)[11]。與蘋(píng)果[13]和杜仲[15]一致，絕大部分CsARF蛋白等電點(diǎn)（PI）都小于7，屬酸性蛋白。作為轉(zhuǎn)錄因子CsARF蛋白定位預(yù)測(cè)全部都位于細(xì)胞核，這與其他物種情況不同，如煙草的ARF定位就有部分定位于葉綠體和線粒體[17]。與擬南芥亞族的劃分一樣，可將CsARF劃分入5個(gè)亞族之中[10]，其中Ⅰ亞組和Ⅲ亞族基因數(shù)量最多，均有8個(gè)，Ⅳ亞族最少，僅有1個(gè)。通過(guò)分析結(jié)構(gòu)域和保守結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)CsARF具有3個(gè)結(jié)構(gòu)域（DBD、ARF和CTD），3號(hào)模體結(jié)構(gòu)域可以與DNA結(jié)合[22]，進(jìn)而與生長(zhǎng)素反應(yīng)基因啟動(dòng)子上的作用元件結(jié)合，其Auxin_resp結(jié)構(gòu)域通過(guò)與生長(zhǎng)素的結(jié)合調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)[8]。而通過(guò)對(duì)結(jié)構(gòu)域的研究不難發(fā)現(xiàn)，不同亞族中的模體種類和數(shù)量基本一致，不同亞族之間則差距較大，這可能是茶樹(shù)在進(jìn)化過(guò)程中部分基因發(fā)生了丟失和保留。25個(gè)CsARF基因共存在7個(gè)基因?qū)?，說(shuō)明茶樹(shù)在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了不同染色體之間的復(fù)制[23]。對(duì)基因結(jié)構(gòu)的分析可以使得物種的進(jìn)化關(guān)系更為明確[24]，通過(guò)對(duì)CsARF基因結(jié)構(gòu)的分析，可知CsARF基因由2～17個(gè)外顯子構(gòu)成，雖然不同亞族之間的外顯子個(gè)數(shù)變化較大，但其與其他物種的ARF基因外顯子數(shù)量范圍基本一致，如蘋(píng)果[13]、水稻[11]、番茄[25]等，說(shuō)明ARF在物種的進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守。通過(guò)對(duì)CsARF基因的順式作用元件的分析發(fā)現(xiàn)，其對(duì)于調(diào)控茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)逆境環(huán)境也可能起到一定的作用。ARF基因?qū)τ谥参锏纳L(zhǎng)發(fā)育有著至關(guān)重要的作用[26]，通過(guò)對(duì)茶樹(shù)不同組織的CsARF基因的表達(dá)量研究發(fā)現(xiàn)，不同亞族的表達(dá)量不盡相同，有些在花和莖中表達(dá)量高（CsARF2、CsARF6和CsARF17），有些則在葉片中表達(dá)量較高（CsARF10和CsARF13）。篩選出其中表達(dá)量較高的7個(gè)基因，RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致。其他物種的ARF基因在不同器官的表達(dá)情況也有所區(qū)別，如擬南芥AtARF1在花中表達(dá)量最高[27]，AtARF12在果實(shí)中表達(dá)量最高[10]，AtARF19則在新葉和根中表達(dá)量最高[28]，這種不同亞族的表達(dá)量的差別原因及表達(dá)意義也是下一步的重點(diǎn)研究方向。6082ADD5-E0B6-4BED-A151-861268587491

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