許光輝 萬(wàn)慧琪 陳佩璐 黃亦琦 李 明，3

家蠶（幼蟲(chóng)）的藥用價(jià)值一直受到人們的重視，古代醫(yī)籍《中華本草》《本草綱目》均記載家蠶體入藥可止消渴（糖尿?。F(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)也進(jìn)一步證明了家蠶幼蟲(chóng)體具有保肝、提高免疫、降血糖、降血脂等多種功效。但目前關(guān)于家蠶抗2 型糖尿?。═2DM)的作用機(jī)制研究并不充分。因此，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)家蠶活性成分抗T2DM 的潛在靶點(diǎn)和分子機(jī)制進(jìn)行解析，為更全面地研究家蠶抗T2DM的作用機(jī)制指明方向。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件中國(guó)知網(wǎng)（https://www.cnki.net/）；Medline 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）；TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）；PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swisstargetprediction.ch/）；Gene Card 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）；在線韋恩圖（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）；STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）；DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）；Cytoscape 3.8.0軟件。

1.2 家蠶主要活性成分與T2DM疾病相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集構(gòu)建通過(guò)查閱文獻(xiàn)對(duì)家蠶中的主要活性成分進(jìn)行歸類，建立家蠶活性成分集。通過(guò)檢索PubChem、Swiss Target Prediction 和Gene Card 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取家蠶活性成分與T2DM對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)。

1.3 家蠶抗T2DM潛在靶點(diǎn)篩選利用在線韋恩圖獲取家蠶活性成分與T2DM 靶點(diǎn)的交集則為家蠶抗T2DM的潛在靶點(diǎn)。

1.4 蛋白-蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析（PPI）將潛在靶點(diǎn)上傳至STRING 平臺(tái)，設(shè)置最高置信區(qū)間和隱藏離散靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白相互作用關(guān)系分析，計(jì)算相應(yīng)的拓?fù)鋮?shù)。

1.5 家蠶活性成分抗T2DM的核心靶點(diǎn)篩選將家蠶活性成分抗T2DM 的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中，根據(jù)點(diǎn)度中心值（degree）、接近中心值（closeness）和中介中心值（betweenness）篩選TOP 30個(gè)靶點(diǎn)作為家蠶活性成分抗T2DM 的核心靶點(diǎn)并進(jìn)行可視化展示。

1.6 GO 與KEGG 富集分析將核心靶點(diǎn)上傳至DAVID 6.8 在線數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，以P＜0.01 為顯著性差異篩選家蠶活性成分抗T2DM 涉及的生物過(guò)程及信號(hào)通路，分析其可能的作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 家蠶活性成分及與T2DM相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集現(xiàn)有文獻(xiàn)檢索結(jié)果[1-19]表明，家蠶主要活性成分包括生物堿、黃酮類、氨基酸、維生素、脂肪酸等，各成分的口服生物利用度、類藥性及與T2DM 相關(guān)的靶基因數(shù)目見(jiàn)表1。

表1 家蠶活性成分

2.2 家蠶活性成分抗T2DM 潛在靶點(diǎn)通過(guò)PubChem、Swiss Target Prediction 和Gene Card 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得T2DM對(duì)應(yīng)靶標(biāo)12272個(gè)，氨基酸對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)19400個(gè)，脂肪酸對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)1067 個(gè)，生物堿對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)3822個(gè)，維生素對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)7832個(gè)，黃酮類對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)714個(gè)。161個(gè)交集靶點(diǎn)則為家蠶活性成分抗T2DM的潛在靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 家蠶活性成分與T2DM的靶基因映射

2.3 靶蛋白PPI將161個(gè)潛在靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白互作分析。PPI 結(jié)果顯示，家蠶活性成分抗T2DM 功效PPI 網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)161 個(gè)，平均度值7.25，584條邊，P＜1.0e-16。見(jiàn)圖2。

圖2 潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 核心靶點(diǎn)GO 富集分析對(duì)家蠶活性成分抗T2DM 的30 個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析。根據(jù)P＜0.01，篩選得出家蠶活性成分抗T2DM 核心靶點(diǎn)顯著富集的生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）分別為39 條、6 條和16 條，其中P值最小的Top 10 條生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，家蠶活性成分抗T2DM 靶點(diǎn)顯著富集的生物過(guò)程包括RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、藥物反應(yīng)、一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控、平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控、藥物代謝過(guò)程、ERBB2信號(hào)通路、類固醇代謝過(guò)程、細(xì)胞缺氧反應(yīng)、環(huán)氧化酶P450 途徑、單萜代謝過(guò)程等；顯著富集的細(xì)胞組分有胞質(zhì)溶質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、胞內(nèi)包膜細(xì)胞器、細(xì)胞器膜、內(nèi)體腔、內(nèi)吞囊泡腔等；顯著富集的分子功能包括酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、血紅素結(jié)合、類固醇羥化酶活性、氧結(jié)合、單加氧酶活性、鐵離子結(jié)合、氧化還原酶活性、蛋白磷酸酶結(jié)合、花生四烯酸環(huán)氧化酶活性等。

圖3 核心靶點(diǎn)GO富集分析

2.5 藥物-成分-疾病-核心靶點(diǎn)-通路分析圖4為家蠶抗T2DM的成分-疾病-核心靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D。結(jié)果顯示，家蠶體中活性成分主要通過(guò)作用于CYP1A1、SRC、AKT1、PPARGC1A、PIK3CA、APOA1、TP53、CYP2C19、INS、CYP3A4、MAPK8、CTNNB1、EDN1、PPARA、CYP2E1、IRS1、PLCG1、EGF、HSP90AA1、APOB、APP、CYP2B6、EGFR、EP300、KNG1、TNF、MTOR、JUN、MAPK14、CYP2C9 等靶點(diǎn)，進(jìn)而調(diào)節(jié)癌癥通路、ErbB信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、胰島素抵抗、FoxO 信號(hào)通路、非酒精性脂肪肝（NAFLD）、Rap1 信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、2 型糖尿病、mTOR 信號(hào)通路等多條途徑參與改善T2DM。

圖4 藥物-成分-疾病-核心靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

家蠶作為一種經(jīng)濟(jì)資源昆蟲(chóng)，其藥用價(jià)值一直受到人們的重視，古代醫(yī)籍《中華本草》《本草綱目》中均有家蠶體入藥可治療糖尿病的相關(guān)記載[20]?，F(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)也進(jìn)一步證明了家蠶體的藥用價(jià)值，揭示了其具有保肝、提高免疫、抗腫瘤、降血糖、降血脂等作用[1]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于多種技術(shù)的綜合應(yīng)用，利用多種數(shù)據(jù)庫(kù)和平臺(tái)，闡釋疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程或者疾病與藥物的相互作用關(guān)系并指導(dǎo)新藥發(fā)現(xiàn)的一門(mén)學(xué)科，在新藥研究、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制的研究等方面提供了諸多便利[21]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)對(duì)家蠶體中的生物堿、黃酮類、氨基酸、脂肪酸、維生素5大類共31種主要活性成分抗T2DM的作用靶點(diǎn)、分子機(jī)制進(jìn)行解析，結(jié)果表明家蠶可通過(guò)作用于PI3K-Akt信號(hào)通路、非酒精性脂肪肝通路、FoxO信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、II 型糖尿病、mTOR 信號(hào)通路等多條途徑改善2 型糖尿病。

氨基酸和維生素是機(jī)體進(jìn)行正常生理活動(dòng)所必需的物質(zhì)，根據(jù)既往研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸代謝異常與T2DM的發(fā)生密切相關(guān)。張志軍等[22]通過(guò)氫譜磁共振代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)2 型糖尿病患者尿液中的代謝物進(jìn)行監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)氨基酸、脂肪代謝異常和維生素B12 缺乏導(dǎo)致尿液中的甲基丙二酸水平升高。有文獻(xiàn)報(bào)道，長(zhǎng)期服用二甲雙胍、羅格列酮等藥物會(huì)導(dǎo)致T2DM 患者體內(nèi)缺乏維生素B12[23]。另外，孫愛(ài)麗等[14]發(fā)現(xiàn)，維生素B12 的缺乏會(huì)導(dǎo)致T2DM 患者更容易發(fā)生周?chē)窠?jīng)病變。王晉飛[24]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，T2DM 小鼠血清中的谷氨酰胺、纈氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和丙氨酸5種氨基酸含量較正常小鼠明顯降低。家蠶不僅有顯著的降血糖作用，而且富含高蛋白和維生素，對(duì)糖尿病患者大有裨益。

亞麻酸和亞油酸為人體必需脂肪酸，對(duì)維持機(jī)體正常生命活動(dòng)起著至關(guān)重要的作用。α-亞麻酸為ω-3 系列多不飽和脂肪酸，具有顯著的藥理作用和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。從食物中獲取的α-亞麻酸可在體內(nèi)合成一系列代謝產(chǎn)物，其中最重要的是具有調(diào)節(jié)血脂、抗炎、抗氧化、提高免疫力等生理活性的二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）[25]。朱麗麗等[26]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，富含亞麻酸的膳食亞麻籽油可顯著增加T2DM 大鼠外周血和脾臟中的髓源抑制細(xì)胞，降低血漿中白介素1β 和TNF-α 水平，減少炎癥反應(yīng)，改善T2DM。此外，α-亞麻酸能夠顯著降低糖尿病大鼠血清中炎癥因子含量和丙二醛水平，增加血清一氧化氮含量、超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性，具有抗炎和抗氧化作用[27]。另有研究[28]表明，共軛亞油酸可通過(guò)激活PPARα轉(zhuǎn)錄因子，下調(diào)肝臟CD36表達(dá)水平，調(diào)節(jié)脂代謝異常，明顯改善ob/ob小鼠脂肪肝和糖耐量異常，對(duì)糖尿病并發(fā)癥具有一定的防治作用。

黃酮類化合物主要通過(guò)清除機(jī)體自由基，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂，減少炎癥反應(yīng)，進(jìn)而改善T2DM，是具有極高應(yīng)用價(jià)值的天然活性產(chǎn)物。生物堿類主要通過(guò)調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，提高外周組織對(duì)胰島素的敏感性，減少氧化應(yīng)激以及胰島素抵抗等參與糖尿病的發(fā)展進(jìn)程[29]。張立雯[30]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，桑葉生物堿類成分蕎麥堿在糖尿病大鼠體內(nèi)的吸收較DNJ 更快，且停留時(shí)間更長(zhǎng)，對(duì)疾病改善有良好的作用。

綜上，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)闡釋了家蠶可通過(guò)多成分-多靶點(diǎn)-多途徑調(diào)控機(jī)制改善T2DM。