■張 麗 李 川 陳薪芋 邱清華 許蘭嬌 熊小文 溫慶琪 歐陽克蕙

（江西省動物營養(yǎng)重點實驗室，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)與飼料安全創(chuàng)新團隊，江西 南昌 330045）

傳統(tǒng)的反芻動物營養(yǎng)學(xué)認為，瘤胃微生物可合成宿主所需的各種氨基酸，不需要從日糧中額外補充[1]?，F(xiàn)代反芻動物生產(chǎn)中，隨著動物生產(chǎn)性能的提高以及飼料結(jié)構(gòu)的改變，對日糧外源氨基酸的需求也越來越受到關(guān)注。一方面，氨基酸的添加滿足了瘤胃微生物的需要，為高產(chǎn)奶牛和快速生長的肉牛、肉羊提供優(yōu)質(zhì)而足量的微生物蛋白（MCP）來源。有學(xué)者指出，十二指腸的營養(yǎng)來源在很大程度上取決于瘤胃微生物發(fā)酵提供的養(yǎng)分數(shù)量和比例[2]。Schwab等[3]和Atasog?lu 等[4]認為，瘤胃微生物存在限制性氨基酸和必需氨基酸，缺乏某些氨基酸時會影響瘤胃微生物的生長繁殖[5]，降低微生物蛋白的供給。Kong等[6]發(fā)現(xiàn)，賴氨酸缺失改變了微生物氨基酸代謝功能，影響微生物蛋白氨基酸的組成。Abdelmegeid 等[7]發(fā)現(xiàn)，蛋氨酸（Met）可刺激瘤胃微生物的生長，提高纖維的消化率，增強細菌氮與微生物脂肪酸的合成。另一方面，一些氨基酸盡管在動物機體內(nèi)需要量較低，但在機體的生長發(fā)育、新陳代謝與結(jié)構(gòu)功能方面起著特殊功效，被稱為功能性氨基酸[8]。精氨酸（Arg）、谷氨酸（Glu）是反芻動物兩種重要的功能性氨基酸，其在反芻動物生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用[9]。Arg 可通過尿素循環(huán)促進多胺生成，參與DNA和蛋白質(zhì)的合成，促進妊娠時期胚胎發(fā)育，并起到免疫調(diào)節(jié)的作用[10]，提高幼齡反芻動物生長性能[11]和奶牛泌乳性能[12]。Glu及其衍生物N-氨甲酰谷氨酸（NCG）有促進奶牛生產(chǎn)性能、瘤胃發(fā)酵及消化代謝，緩解熱應(yīng)激對奶牛帶來的不利影響[13-14]。目前，反芻動物氨基酸營養(yǎng)多集中在過瘤胃氨基酸對幼齡動物和奶牛生產(chǎn)上的研究，氨基酸對肉牛瘤胃發(fā)酵特別是飼糧結(jié)構(gòu)改變下肥育肉牛中的研究較少。因此，本研究旨在通過體外試驗，探究在肥育肉牛高精料日糧條件下添加Arg、Glu 對瘤胃發(fā)酵特性的影響，為反芻動物生產(chǎn)中氨基酸的營養(yǎng)研究提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗材料

3 頭安裝永久瘤胃瘺管的雜交公牛[西門塔爾（♂）×錦江黃牛（♀），350 kg左右]，單欄飼喂，每日8:00和18:00 飼喂，自由采食和飲水；L-精氨酸（純度≥98%，上海麥克林生化有限公司）；L-谷氨酸（純度≥99.5%，上海麥克林生化有限公司）；發(fā)酵底物為瘺管牛日常飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 發(fā)酵底物的組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用體外法，試驗分為3 組，分別為HC 組（高精料混合料，精粗比8：2）、HCA 組（高精料混合料+0.1%L-精氨酸）、HCG組（高精料混合料+0.1%L-谷氨酸），每組4個重復(fù)，培養(yǎng)3、6、12 h和24 h后終止發(fā)酵。

1.3 試驗方法

于晨飼前1 h 采集3 頭瘺管牛瘤胃液，保溫瓶中混合保存并迅速轉(zhuǎn)運至實驗室，使用4 層紗布對瘤胃液進行過濾。參考Menke 等[15]的方法配制人工唾液：準確量取0.175 mL A 液（13.2 g CaCl2·2H2O、10 g MnCl2·4H2O、1 g CoCl2·6H2O、8 g FeCl3·6H2O，定容至100 mL）、350 mL B 液（39 g NaHCO3，定容至1 000 mL）、350 mL C液（5.7 g Na2HPO4、6.2 g KH2PO4、0.6 g MgSO4·7H2O，定容至1 000 mL）、1.75 mL D 液（0.1%刃天青）、70 mL E 液（4 mL 1 mol/L NaOH、625 mg Na2S·9H2O，定容至100 mL）、700 mL純化水，充入CO2至溶液從淡藍色轉(zhuǎn)為無色，按瘤胃液：人工唾液=1：2配制混合發(fā)酵液，39 ℃下保存?zhèn)溆?。配制發(fā)酵底物，其中HCA 組中添加了0.1%（W/W）的精氨酸，HCG 組中添加了0.1%（W/W）的谷氨酸。分別稱取底物0.4 g 裝入100 mL 的玻璃發(fā)酵瓶中，然后向每個發(fā)酵瓶加入40 mL混合發(fā)酵液，發(fā)酵瓶注滿CO2，橡膠塞密封。放入恒溫搖床模擬瘤胃發(fā)酵。分別在培養(yǎng)3、6、12 h和24 h后冰浴終止發(fā)酵，測定產(chǎn)氣量，過濾后測定發(fā)酵液pH，收集發(fā)酵液于-20 ℃保存，測定氨態(tài)氮（NH3-N）、MCP及揮發(fā)性脂肪酸（VFA）濃度。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 飼料營養(yǎng)成分測定

參照張麗英[16]的《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》，粗蛋白含量采用凱式定氮法測定，酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量采用濾袋法測定，粗灰分含量采用灼燒法測定，鈣（Ca）含量采用高錳酸鉀滴定法測定，磷（P）含量采用鉬黃比色法測定。

1.4.2 發(fā)酵液pH測定

采用pHS-3S型高精度酸度計測定發(fā)酵液的pH。

1.4.3 發(fā)酵產(chǎn)氣量測定

每隔3 h接通一次玻璃注射器，通過刻度觀察產(chǎn)氣量，記錄完后排氣。獲取3、6、12 h和24 h的總產(chǎn)氣量。

1.4.4 發(fā)酵液NH3-N濃度測定

取瘤胃液4 mL 渦旋振蕩1 min，在1 450×g 下離心10 min，取上清液后參考馮宗慈等[17]方法測定。

1.4.5 發(fā)酵液MCP濃度測定

取3 mL 發(fā)酵液，解凍，在450×g 下離心5 min 后取上清液1.5 mL，隨后在4 ℃離心機中以20 000×g離心30 min，棄上清，在底物中加入1.5 mL 氫氧化鈉（0.5 mol/L），100 ℃水浴15 min，然后在4 ℃環(huán)溫中以20 000×g離心30 min。采用考馬斯亮藍法[18]測定。

1.4.6 發(fā)酵液VFA濃度測定

使用安捷倫7890氣相色譜儀，色譜柱DB-WAX，毛細管柱(長25 m，內(nèi)徑0.32 mm，膜厚0.20 μm)，氮氣作為載氣，流量1.2 mL/min，程序升溫120 ℃保持1 min，以5 ℃/min 的速率升至200 ℃；檢測器FID 溫度300 ℃，氫氣流量40 mL/min，空氣流量400 mL/min，尾吹流量30 mL/min，以2-丁烯酸為內(nèi)標物。參照秦為琳[19]的內(nèi)標法測定VFA濃度。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），并使用Duncan’s法進行多重比較檢驗，以P<0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加Arg、Glu對體外瘤胃發(fā)酵pH的影響（見表2）

表2 高精料混合料下添加Arg、Glu對體外瘤胃發(fā)酵pH、NH3-N、MCP及產(chǎn)氣量的影響

由表2 可知，在高精料混合料下，隨發(fā)酵時間的延長，pH逐漸降低。相較于HC組，HCA組和HCG組在各個時間點均能升高pH，在發(fā)酵前期（3～6 h），HCA組和HCG組的pH顯著升高（P<0.05）。而HCA組和HCG組相比，pH值均差異不顯著（P>0.05）。

2.2 添加Arg、Glu對體外瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響（見表2）

由表2 可知，隨發(fā)酵時間的延長，產(chǎn)氣量逐漸增加，在發(fā)酵前期（3～6 h），與HC組相比，HCA組產(chǎn)氣量顯著降低（P<0.05），HCG 組產(chǎn)氣量顯著升高（P<0.05），HCA 組和HCG 組相比，HCG 組產(chǎn)氣量顯著高于HCA組（P<0.05）。在發(fā)酵后期（12～24 h），3組之間的產(chǎn)氣量均差異不顯著（P>0.05）。

2.3 添加Arg、Glu 對體外瘤胃發(fā)酵NH3-N 濃度的影響（見表2）

由表2可知，在發(fā)酵后期（12～24 h），12 h HCA組的NH3-N濃度顯著高于HC組（P<0.05），在24 h時，NH3-N濃度有升高但不顯著（P>0.05）。而HCG組相較于HC組，差異不顯著（P>0.05）。HCA組與HCG組相比，在發(fā)酵12 h時，HCA組的氨態(tài)氮濃度顯著高于HCG組（P<0.05）。其他時間段3組間差異不顯著（P>0.05）。

2.4 添加Arg、Glu 對體外瘤胃發(fā)酵MCP 濃度的影響（見表2）

由表2 可知，隨發(fā)酵時間的延長，MCP 濃度呈逐漸增加趨勢。與HC組相比，在發(fā)酵3、24 h時，HCA組和HCG組MCP濃度有所提高但差異不顯著（P>0.05）。在發(fā)酵6 h時，HCG組的MCP濃度顯著高于HC組（P<0.05），12 h 時，HCA 組和HCG 組的MCP 濃度均顯著高于HC 組（P<0.05），HCA 組與HCG 組相比，MCP 濃度差異不顯著（P>0.05）。

2.5 添加Arg、Glu 對體外瘤胃發(fā)酵VFA 濃度的影響（見表3）

表3 高精料混合料下添加Arg、Glu對體外瘤胃發(fā)酵VFA的影響

由表3 可知，隨發(fā)酵時間的延長，3 組的TVFA 濃度逐漸增加。HCA組與HCG組相比，在各個時間點，乙酸、丙酸、異丁酸、異戊酸、TVFA濃度及乙丙比均無差異。在發(fā)酵3 h時，與HC組相比，HCA組和HCG組的乙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸均顯著降低（P<0.05），而丙酸、TVFA 濃度及乙丙比均表現(xiàn)為差異不顯著（P>0.05）。在發(fā)酵6 h 時，與HC 組相比，HCA 組的丁酸濃度顯著降低（P<0.05），HCG組的戊酸顯著升高（P<0.05），HCA組和HCG組的乙酸、丙酸、異丁酸、異戊酸、TVFA 濃度及乙丙比均表現(xiàn)為差異不顯著（P>0.05），HCG 組丁酸和戊酸濃度顯著高于HCA 組（P<0.05）。在發(fā)酵12 h 時，與HC 組相比，HCA 組和HCG 組的乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、TVFA 濃度及乙丙比均表現(xiàn)為差異不顯著（P>0.05）。而在發(fā)酵24 h 時，與HC 組相比，HCA 組和HCG 組的乙酸和乙丙比均顯著降低（P<0.05），丙酸、丁酸及異丁酸均顯著升高（P<0.05），異戊酸、戊酸和TVFA濃度均表現(xiàn)為差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

Arg和Glu作為功能性氨基酸在反芻動物生產(chǎn)上的研究已有報道。Silva等[20]研究表明，在含有賴氨酸和蛋氨酸的代乳粉中補充1%氨基谷氨酸對犢牛采食量和生產(chǎn)性能影響不明顯。而Sato 等[21]在0.5 g 底物中添加5 mg 及以上味精發(fā)酵母液，能對體外瘤胃發(fā)酵有促進作用。Teixeira 等[22]發(fā)現(xiàn)在公牛飼糧上添加約0.08%的精氨酸對生產(chǎn)性能影響不大，但能提高肉品質(zhì)。針對以上研究發(fā)現(xiàn)，本試驗遵循低蛋白日糧原則，選擇在日糧中添加0.1%的Arg 和0.1% Glu，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對體外瘤胃發(fā)酵有一定促進作用。

3.1 Arg和Glu對體外瘤胃發(fā)酵pH的影響

瘤胃pH對維持瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、保證瘤胃微生物生命活動的正常進行起重要作用。瘤胃液的pH主要受日糧性質(zhì)、唾液量、氨氮含量、VFA的生成和利用等因素的綜合影響[23]。宋良榮等[24]認為添加不同氨基酸組成的三肽能有效降低瘤胃液pH，其原因是促進了瘤胃碳水化合物的發(fā)酵，增加了酸的產(chǎn)量。Bahram[25]、劉玉潔等[26]及宋鈺等[27]發(fā)現(xiàn)添加Arg、Glu或谷氨酸渣均能提高瘤胃液的pH，但均未闡明其作用機制。在本試驗中，在高精料中分別添加Arg或Glu對發(fā)酵3、6、12 h 和24 h 時的pH 均有所升高，結(jié)果與Bah?ram[25]、劉玉潔等[26]及宋鈺等[27]研究一致，而與宋良榮等[24]的結(jié)果不一致。其原因可能是發(fā)酵底物不同所致。當反芻動物飼喂高精料日糧時，瘤胃pH會降低[28]。Marquis等[29]和Higuchi等[30]報道在培養(yǎng)基中添加Arg或Glu，各種鏈球菌、銅綠假單胞菌和乳酸桿菌通過精氨酸脫氨酶（ADI）系統(tǒng)和谷氨酸脫羧酶（GAD）系統(tǒng)分別代謝生成堿性物質(zhì)NH3和γ-氨基丁酸（GABA），最終提高了培養(yǎng)液的pH。本試驗中添加Arg或Glu可以提高發(fā)酵液pH的作用機制可能與上述研究一致。

3.2 Arg和Glu對體外瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

產(chǎn)氣量是評價日糧體外瘤胃發(fā)酵程度的重要指標，在一定程度上反映了微生物的生長速率及底物的可利用性[31]。Menke 等[32]利用體外發(fā)酵法評價得出產(chǎn)氣量與體內(nèi)有機物質(zhì)的消化率具有非常顯著的正相關(guān)性。Bahram等[25]的研究結(jié)果表明在精粗比為55：45的條件下添加1 mmol/L Arg能顯著增加12、24 h后的發(fā)酵產(chǎn)氣量。并且Sato等[21]也發(fā)現(xiàn)味精副產(chǎn)物對瘤胃體外發(fā)酵產(chǎn)氣量有正相關(guān)性。而姜寧等[33]發(fā)現(xiàn)在日糧中添加不同包被方式的蛋氨酸和賴氨酸對24 h 時體外發(fā)酵產(chǎn)氣量沒有顯著影響，其產(chǎn)氣量還略有所降低。本試驗中，在發(fā)酵3、6 h時，HCG組的產(chǎn)氣量高于高精料組，而在發(fā)酵12、24 h 時的產(chǎn)氣量沒有顯著影響，與Bahram[25]結(jié)果相一致。說明發(fā)酵前期（3～6 h），添加Glu 有促進發(fā)酵、提高產(chǎn)氣量的效果；但在發(fā)酵后期（12～24 h），由于底物消耗較大，添加Glu 對產(chǎn)氣量沒有影響。本試驗中，HCA 組的產(chǎn)氣量低于對照組，在發(fā)酵前期（3～6 h）達到顯著水平，這一結(jié)果與姜寧等[33]結(jié)果相一致。以上結(jié)果說明不同氨基酸（AA）對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量影響不同。

3.3 Arg和Glu對體外瘤胃發(fā)酵NH3-N濃度的影響

氨態(tài)氮是反芻動物瘤胃微生物將飼料中含氮物質(zhì)發(fā)酵生成的主要物質(zhì)，也是合成瘤胃微生物蛋白的主要來源[34]。瘤胃液中氨態(tài)氮濃度反映了飼料中含氮物質(zhì)降解和微生物合成利用之間的平衡狀態(tài)。Colmenero 等[35]認為日糧中蛋白質(zhì)水平的提高有利于提高瘤胃液中NH3-N 水平。而李晴等[36]研究認為補充支鏈氨基酸有助于瘤胃微生物脫氨生成NH3-N。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后期（12～24 h），高精料中添加Arg和Glu都能提高發(fā)酵液NH3-N濃度，且Arg組高于對照組。這與Bahram等[25]的研究結(jié)果一致。而本次試驗中3、12 h和24 h在高精料中添加Glu對氨態(tài)氮含量有所提高，但差異不顯著，這與Sato等[21]針對味精副產(chǎn)物的研究結(jié)果一致。高精料添加Arg 和Glu 發(fā)酵6 h后，NH3-N濃度有所下降，但差異不顯著。與宋鈺等[27]在日糧中添加谷氨酸渣飼喂肉牛及Padunglerk等[37]使用富含谷氨酸的味精副產(chǎn)品替代20%豆粕飼喂奶牛能降低瘤胃NH3-N濃度的結(jié)果相一致，這可能是因為在6 h時添加Arg或Glu幫助了提高瘤胃發(fā)酵及NH3-N的快速利用，提高了MCP的合成。

3.4 Arg和Glu對體外瘤胃發(fā)酵MCP濃度的影響

高精料日糧下，非結(jié)構(gòu)性碳水化合物發(fā)酵菌增多，其生長更多依賴于氨基酸[38]。Guliye等[39]研究表明在缺失酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、亮氨酸（Leu）、蛋氨酸（Met）時會導(dǎo)致瘤胃發(fā)酵率下降，并且支鏈氨基酸（BCAA）可能是影響瘤胃微生物蛋白合成量的最大因素。張斌等[40]在釀酒發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵前后Arg 和Glu 含量分別降低96.37%和87.69%，表明微生物生長對Arg 和Glu 的需求量大，同時還發(fā)現(xiàn)補充Glu 有助于微生物發(fā)酵。Schwab 等[3]研究表明，在缺乏Glu時，瘤胃微生物的生長速率降低；而在肉牛日糧中添加谷氨酸渣可顯著提高MCP 含量。本試驗中，在高精料組中添加Arg 或Glu 均能有效提高MCP 含量，這表明在高精料日糧中添加Arg 或Glu 有利于提高瘤胃發(fā)酵速率和MCP 合成，這與以上的研究結(jié)果一致。但Bahram等[25]的研究表明，在底物精粗比為55：45 的瘤胃發(fā)酵液中添加Arg，培養(yǎng)12、24 h時，MCP含量顯著降低，其原因尚未被解釋清楚。

3.5 Arg和Glu對體外瘤胃發(fā)酵VFA濃度的影響

VFA 是反芻動物主要的能量來源，其中乙酸、丙酸、丁酸約占瘤胃發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸的95%左右[41]。徐愛秋等[42]研究證明不同氨基酸模式對瘤胃微生物生長及發(fā)酵效率有影響。Abbasi等[43]利用瘤胃模擬技術(shù)和體外消化技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在低蛋白日糧中添加高劑量過瘤胃蛋氨酸能提高瘤胃pH，并增加真胃和回腸中的TVFA及丙酸含量。而Zhang等[44]研究發(fā)現(xiàn)添加3種支鏈氨基酸（纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸）發(fā)酵72 h能顯著降低瘤胃體外發(fā)酵過程中乙酸和丙酸比值，并且顯著提高TVFA 濃度。而在本次試驗中，高精料日糧中添加Arg或Glu能顯著降低24 h時的乙丙比，這與Zhang等[44]、常樂[45]的研究結(jié)果一致；但對TVFA 總量無明顯影響，與Sato 等[21]在濃縮料中添加味精副產(chǎn)物對體外發(fā)酵48 h后的TVFA含量無顯著影響的結(jié)果相一致。并且本次試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)在24 h時顯著提高丙酸、丁酸、異丁酸含量，這表明在高精料中添加Arg或Glu促進了瘤胃微生物對非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的發(fā)酵利用。

4 結(jié)論

在高精料混合料中添加Arg或Glu有助于提高瘤胃液pH，增加發(fā)酵后期瘤胃液NH3-N濃度，促進瘤胃微生物生長和MCP的生成，并且能改變VFA組成，但對TVFA濃度無影響。