王燦良，鄭育昆，李甲維，朱晨浩，任顯鋒，韋良震，王雪鵬*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018；2.山東省泰安市水產(chǎn)研究所，山東 泰安； 3.曲阜漁豐現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，山東 曲阜）

錦鯉（Cyprinus carpiohaematopterus）在生物學(xué)上屬于鯉科（Cyprinidae）鯉屬，鯉魚(yú)種，錦鯉亞種，全世界共有鯉科魚(yú)類210屬3 700種以上。近年來(lái)我國(guó)的鯉年均產(chǎn)量維持在296萬(wàn)t左右，各養(yǎng)殖場(chǎng)的養(yǎng)殖面積從幾畝到數(shù)十畝和數(shù)百畝甚至千畝不等，其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)形成了巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益（蔣昕彧，2021；霍鳳敏，2010）。

細(xì)菌病是錦鯉養(yǎng)殖中的常見(jiàn)病之一，對(duì)錦鯉產(chǎn)業(yè)造成了較大的危害與經(jīng)濟(jì)損失（溫周瑞，2020）。其中，黃桿菌（Flavobacterium oncorhynchi），屬黃桿菌科（Flavobacteriaceae）黃桿菌 屬（李思泉, 2019）。黃桿菌屬被Bergey提議（Bergey et al, 1923），并于 1996被定義（Bernardet et al, 1996）。黃桿菌是一種革蘭氏陰性菌，其最適溫度為25～30 ℃，能夠引發(fā)多種經(jīng)濟(jì)魚(yú)類爛鰓、體表潰瘍、出血并導(dǎo)致死亡，有鰓絲發(fā)白、不整齊，腹腔有積水，體表潰爛出血等癥狀（趙占春，1984；柴靜茹，2021）。

2020年山東某養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)錦鯉患病現(xiàn)象，為明確病因，本試驗(yàn)從患病錦鯉內(nèi)臟處分離到1株優(yōu)勢(shì)菌CH02，并對(duì)該菌進(jìn)行了理化特性、分類地位、致病性和耐藥性研究，以期為該病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

患病錦鯉采自山東某養(yǎng)殖場(chǎng)，體重100～ 200 g，患病錦鯉體表鱗片脫落，游動(dòng)緩慢，尾柄部皮膚潰爛；剖檢可見(jiàn)肝臟有出血點(diǎn)，脾臟、腎臟腫大，伴有腹水。健康錦鯉購(gòu)自山東濟(jì)寧某養(yǎng)殖場(chǎng)，體重100～200 g，精神狀態(tài)良好，在魚(yú)缸中靜養(yǎng)3 d后，無(wú)異常狀況。

黃桿菌培養(yǎng)基為常規(guī)Shieh培養(yǎng)基，選擇培養(yǎng)基添加托普霉素2 μg/ml、多粘菌素B20 U/ml。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離、純化、染色特性無(wú)菌條件下從患病錦鯉內(nèi)臟處使用接種環(huán)取樣，劃線接種于Shieh培養(yǎng)基上，30 ℃ 靜置培養(yǎng)24～48 h，選擇單獨(dú)的菌落進(jìn)一步純化3次。肉眼觀察菌落形態(tài)、大小、顏色、隆起度等，并進(jìn)行革蘭氏染色觀察（柴靜茹，2021）。

1.2.2 藥敏試驗(yàn)按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）發(fā)布的抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行（張玉蕾，2016）。藥敏片種類共14種，包括復(fù)方新諾明、多粘菌素B、恩諾沙星、氟苯尼考、克林霉素、大觀霉素、多西環(huán)素、頭孢噻肟、阿莫西林、氨芐西林、氨曲南、丁胺卡那、卡那霉素、米諾環(huán)素。

1.2.3 分子鑒定參照Liu等的方法對(duì)所分離的菌株進(jìn)行分子鑒定（Liu Jet al，2012）。采用常規(guī)方法提取細(xì)菌基因組DNA。PCR上游引物序列5'-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3'，下游引物序列5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 5min℃ ；變性95 30℃ sec、退火52 40℃ sec、延伸72 1min℃ ，30個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 5min。 PCR 產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析將CH02菌株16SrDNA測(cè)序得到的部分基因序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLA ST，并利用Megalign軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5 質(zhì)譜分析取上述分離、純化的優(yōu)勢(shì)菌標(biāo)記好，涂布于色譜柱上，而后滴加2 μl甲酸，2 μl基質(zhì)溶液，在超凈臺(tái)內(nèi)自然風(fēng)干后，掃描色譜柱條碼錄入信息后打開(kāi)軟件進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定。

1.2.6 回歸試驗(yàn)利用MS222麻醉試驗(yàn)魚(yú)，后按照0.5 ml/尾的劑量進(jìn)行腹腔注射，菌液濃度為1.7×108CFU/ml，陰性對(duì)照組按每尾0.5 ml注射PBS緩沖液。注射后連續(xù)10 d記錄其臨床癥狀和死亡情況。取瀕死的病魚(yú)內(nèi)臟器官進(jìn)行細(xì)菌再分離和鑒定。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離純化及革蘭氏染色結(jié)果

30 ℃ 下，經(jīng)24 h培養(yǎng)，Shieh培養(yǎng)基上出現(xiàn)了表面上沿著線蔓延生長(zhǎng)的黃色菌落。CH02株在Shieh培養(yǎng)基上呈黃色菌落、邊緣不整齊、中央較厚、呈顆粒狀，如圖1。經(jīng)革蘭氏染色后觀察，可見(jiàn)菌體呈直桿狀或彎曲桿狀、呈紅色，如圖2。

圖1 患病魚(yú)細(xì)菌分離純化結(jié)果

圖2 細(xì)菌革蘭氏染色圖（100倍）

2.2 細(xì)菌鑒定

PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，如圖3。PCR產(chǎn)物序列BLAST比對(duì)，與NR117031.1和FR 870076.1、DQ778317.1的同源性分別為99.86 %、99.86 %、99.78 %。質(zhì)譜結(jié)果顯示為黃桿菌。使用Megalign構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖4。

圖3 16S rDNA 基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖4 分離菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 藥敏試驗(yàn)

根據(jù)藥敏紙片說(shuō)明推薦的抑菌范圍（20 mm以上為極敏，15～20 mm為高敏感性，10～14 mm為中敏感性，10 mm以下為低敏感性，0為不敏）判斷，克林霉素、復(fù)方新諾明、恩諾沙星和大觀霉素在本次藥敏試驗(yàn)中展現(xiàn)了極好的抗菌效果；多西環(huán)素、頭孢噻肟、丁胺卡那和米諾環(huán)素亦有較好的療效；對(duì)氨芐西林和氨曲南類基本沒(méi)效果。結(jié)果如表1所示。

表1 CH02菌株對(duì)14種藥敏片敏感程度結(jié)果

2.4 回歸感染及LD50測(cè)定

注射CH02菌株后，逐漸出現(xiàn)爛鰓和死亡情況。注射后死亡或?yàn)l臨死亡試驗(yàn)魚(yú)的鰓部癥狀，如圖5。

圖5 注射后死亡試驗(yàn)魚(yú)鰓部癥狀

3 討論

本研究對(duì)患病錦鯉進(jìn)行細(xì)菌分離后，發(fā)現(xiàn)所分離菌株的優(yōu)勢(shì)菌落較為明顯，推測(cè)可能是細(xì)菌感染造成的。進(jìn)一步對(duì)該優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色、生化鑒定和分子鑒定等，推測(cè)此次錦鯉患病的病原體為鉤吻黃桿菌（Flavobacterium oncorhynchi）。黃桿菌廣泛存在于水環(huán)境中，是多種魚(yú)類的主要致病菌，也可以感染大鯢等多種動(dòng)物，但大鯢分離株對(duì)復(fù)方新諾明、頭孢唑啉為不敏感（王昕曦，2016），而本試驗(yàn)中分離的菌株對(duì)克林霉素、復(fù)方新諾明、恩諾沙星和大觀霉素非常敏感，對(duì)多西環(huán)素、頭孢噻肟、丁胺卡那和米諾環(huán)素較敏感，對(duì)氨芐西林和氨曲南類不敏感。這可能是柱狀黃桿菌和鉤吻黃桿菌的菌體差異造成的。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果和農(nóng)業(yè)部國(guó)家獸醫(yī)局推薦的水產(chǎn)動(dòng)物藥物使用指南，建議用恩諾沙星治療鉤吻黃桿菌引起的細(xì)菌病。

錦鯉養(yǎng)殖不同于畜牧業(yè)的養(yǎng)殖，因?yàn)殄\鯉主要在水下活動(dòng)，在直觀性上會(huì)受到極大的限制，因此錦鯉疾病應(yīng)以預(yù)防為主、治療為輔，防患于未然，才能夠保證養(yǎng)殖的綜合效益（唐偉林,2021）。此外，錦鯉養(yǎng)殖者還應(yīng)當(dāng)學(xué)習(xí)先進(jìn)的水質(zhì)調(diào)控技術(shù)，先進(jìn)的管理模式和病害防控技術(shù)，以保證錦鯉養(yǎng)殖利益的最大化。本研究發(fā)現(xiàn)的黃桿菌高敏抗生素為錦鯉爛鰓病的治療具有一定的指導(dǎo)意義。