劉繼軍,于林君,王 博,王連友*,劉會(huì)麗

0 引言

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是一種復(fù)雜的進(jìn)行性慢性炎癥疾病,是多種急性心腦血管疾病的主要誘因[1]。AS斑塊的形成使得血管管腔狹窄,此外,斑塊自身的易損性和易破性是導(dǎo)致缺血性腦卒中發(fā)生的關(guān)鍵原因[2],但是目前其潛在的致病機(jī)制尚不明確。巨噬細(xì)胞極化在AS進(jìn)展中具有至關(guān)重要的作用,其不同于單核細(xì)胞的免疫細(xì)胞,在AS的所有階段均有發(fā)現(xiàn),并與炎性介質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)[3]。為了響應(yīng)環(huán)境刺激,巨噬細(xì)胞可被激活為涉及不同功能特征的幾種亞型,包括具有促炎性M1型和抗炎性M2型的2種表型細(xì)胞。例如,M1型巨噬細(xì)胞能夠產(chǎn)生誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)，促進(jìn)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致斑塊發(fā)生易感性;而M2型巨噬細(xì)胞能夠分泌精氨酸酶1(Arg-1)來增強(qiáng)粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性。M1型和M2型巨噬細(xì)胞之間的相對(duì)比率是AS中的關(guān)鍵事件[4-5]。因此,調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化是防治AS的潛在策略。沙格列汀是一種二肽基肽酶4抑制劑,由于其具有升高腸降血糖素激素-胰高血糖素樣肽1(GLP-1)而降低血糖的能力，被臨床用于2型糖尿病的治療。此外,沙格列汀還具有抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)的作用[6]。本研究以巨噬細(xì)胞極化作為切入點(diǎn),進(jìn)一步探討沙格列汀對(duì)AS的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 將8周齡的健康、清潔級(jí)ApoE-/-小鼠和野生型C57BL/6小鼠飼養(yǎng)在溫度為(23±2)℃、12 h/12 h的光照/黑暗周期的無菌飼養(yǎng)箱中,自由飲水、攝食。

1.1.2 主要材料與試劑 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所),沙格列汀(英國AstrZeneca公司),AMPK抑制劑Compound C(美國 MCE 公司),DMEM 培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素、胰蛋白酶、胎牛血清(美國 GIBCO公司),TC、TG、LDL-C和HDL-C試劑盒(四川邁克生物公司),HE染色試劑、免疫組織化學(xué)染色試劑、油紅O染色液、ECL發(fā)光液以及BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物研究所),TRIzol試劑(美國 Invitrogen公司),SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒(日本Takara),免疫熒光染色試劑盒(南京建成生物工程研究所),抗體iNOS、Arg-1、AMPK、p-AMPK、PPARα、CD206(英國Abcam公司),抗體GAPDH和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔(美國CST公司),其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型建立與給藥處理 將30只 ApoE-/-小鼠按照數(shù)字表法隨機(jī)分為2組,包括模型組和沙格列汀組,每組15只,均給予高脂飼料喂養(yǎng);以15只野生型C57BL/6小鼠作為對(duì)照組,給予普通飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)8周后,沙格列汀組予以15 mg/(kg·d)的沙格列汀灌胃,模型組和對(duì)照組小鼠同時(shí)給予等量生理鹽水灌胃。12 周后,各組小鼠通過腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后,心臟穿刺收集血液,分離小鼠腹主動(dòng)脈至主動(dòng)脈,一部分固定于4%多聚甲醛,另一部分置于液氮迅速冷凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱中。

1.3 血脂水平檢測(cè) 治療12周后,小鼠禁食12 h,采用腹腔注射50 mg/kg 戊巴比妥鈉麻醉,通過心臟穿刺取血,離心后收集血清,利用全自動(dòng)生化分析儀分析TC、TG、LDL-C和HDL-C的水平,操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.4 組織處理染色

1.4.1 HE染色 將小鼠主動(dòng)脈組織在4%多聚甲醛中固定后,取出進(jìn)行修剪、包埋,利用梯度乙醇脫水和二甲苯透明后,切成厚度為 5 μm的石蠟切片,經(jīng)過脫蠟、復(fù)水后,進(jìn)行HE染色,并使用中性樹膠進(jìn)行封片,于光學(xué)顯微鏡下觀察主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)變化并采集圖像。

1.4.2 油紅O染色 通過4%甲醛溶液固定好主動(dòng)脈組織后,使用PBS緩沖液沖洗組織,將整個(gè)主動(dòng)脈血管內(nèi)壁切開,放入新鮮配置的0.05%油紅O工作溶液中,室溫下避光染色1 h后,棄去染液,PBS緩沖液沖洗主動(dòng)脈,使用75%乙醇浸泡,直至斑塊呈現(xiàn)紅色,PBS緩沖液再次沖洗,然后將主動(dòng)脈固定于黑色蠟皿上,采用立式顯微鏡觀察并采集圖像,通過Image J 軟件測(cè)量動(dòng)脈斑塊面積。

1.4.3 免疫組織化學(xué)染色 取制備好的主動(dòng)脈石蠟切片,通過免疫組織化學(xué)方法評(píng)估iNOS和Arg-1蛋白的表達(dá)。將切片分別用梯度乙醇和二甲苯進(jìn)行脫蠟水化,置于檸檬酸鹽緩沖液中煮沸15 min(溫度保持在95 ℃左右)以進(jìn)行抗原修復(fù)。用3%H2O2去除組織內(nèi)源性過氧化物酶,接著用5%山羊血清進(jìn)行封閉。將切片分別與兔抗iNOS(1∶500)和抗Arg-1(1∶100)在4 ℃下孵育過夜。次日,PBS緩沖液沖洗,與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔(1∶1 000)在室溫下孵育1 h,PBS 緩沖液沖洗后,加入DAB顯色液,蘇木精復(fù)染,使用中性樹膠進(jìn)行封片,于光學(xué)顯微鏡下觀察組織中的陽性表達(dá)情況,胞質(zhì)染成黃色至棕色即為陽性細(xì)胞,隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野(400×)計(jì)數(shù),計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)所占總細(xì)胞數(shù)的百分比，即陽性表達(dá)率。

1.5 Western blot 在各組小鼠主動(dòng)脈組織中加入RIPA裂解液進(jìn)行裂解,離心并收集上清液,根據(jù)BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組樣品蛋白的濃度。通過10%SDS-PAGE電泳分離各組蛋白,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。TBST緩沖液洗膜后,采用5%脫脂牛奶在室溫下封閉1 h,然后加入抗iNOS(1∶1 000)、Arg-1(1∶1 000)、AMPK(1∶1 000)、p-AMPK(1∶1 000)、PPARα(1∶1 000)為第一抗體,放置在4 ℃下孵育過夜。次日,TBST緩沖液清洗,然后加入對(duì)應(yīng)二抗,在室溫下孵育2 h。TBST緩沖液再次洗膜,采用ECL發(fā)光液曝光,通過Image J 軟件分析各條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參,計(jì)算各蛋白表達(dá)水平。

1.6 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)、分組與處理 取小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，采用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清與1%青霉素-鏈霉素)培養(yǎng),置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)傳代,采用對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。調(diào)整RAW264.7細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml,取100 μl接種于6孔板,培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后,用LPS(1 μg/ml)和IFN-γ(20 ng/ml)分別誘導(dǎo)24 h。實(shí)驗(yàn)分組：①對(duì)照組：細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng);②誘導(dǎo)組：細(xì)胞按照上述方法進(jìn)行誘導(dǎo)處理;③沙格列汀組：細(xì)胞誘導(dǎo)后,使用含1 μmol/L沙格列汀的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h;④AMPK抑制劑組：10 μmol/L AMPK抑制劑Compound C預(yù)處理細(xì)胞2 h,再進(jìn)行誘導(dǎo)和沙格列汀處理。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用TRIzol試劑提取各處理組RAW264.7細(xì)胞總RNA,采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的RNA濃度與純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作,以獲得cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn),檢測(cè)各基因表達(dá)水平,步驟嚴(yán)格按照SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒說明進(jìn)行,以GAPDH 作為內(nèi)參基因。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 3 min,1個(gè)循環(huán);95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。通過2-ΔΔCt法分析計(jì)算各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。使用的引物由上海生工生物有限公司合成,具體序列見表1。

表1 各基因引物序列

1.8 免疫熒光染色 將各處理RAW264.7細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種于24孔板內(nèi)的無菌玻片上,用4%多聚甲醛固定后,PBS緩沖液洗滌,使用0.3% TritonX-100試劑進(jìn)行透膜處理,室溫下孵育15 min,并用10%山羊血清室溫封閉2 h。加入特異性一抗兔抗iNOS(巨噬細(xì)胞的M1標(biāo)記)和小鼠抗CD206(巨噬細(xì)胞M2標(biāo)記)進(jìn)行標(biāo)記,置于4 ℃下孵育過夜。第2天,PBS緩沖液洗滌后,加入對(duì)應(yīng)的熒光二抗,暗室室溫下孵育1 h,PBS緩沖液再次洗滌,加入DAPI染色10 min,使用中性樹膠封片,在熒光顯微鏡下觀察陽性表達(dá)并采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血脂水平比較 與對(duì)照組比較,模型組小鼠血清中TG、TC、 LDL-C水平升高(P<0.05),血清中HDL-C水平降低(P<0.05);與模型組比較,沙格列汀組小鼠血清中TG、TC、LDL-C水平降低(P<0.05),而HDL-C水平升高(P<0.05),見圖1。

2.2 各組小鼠主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)變化 HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組小鼠的主動(dòng)脈內(nèi)膜完好無損,沒有出現(xiàn)明顯增生或管腔狹窄的現(xiàn)象。模型組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚,形成斑塊,且面積較大;沙格列汀組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜增生較模型組明顯改善,斑塊面積減少,管腔狹窄程度降低,見圖2。

圖1 各組小鼠血脂水平變化

圖2 HE染色檢測(cè)各組小鼠主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)變化

2.3 各組小鼠主動(dòng)脈斑塊面積變化 油紅O染色結(jié)果顯示,對(duì)照組小鼠脂質(zhì)積聚少,相對(duì)斑塊面積較小;模型組小鼠脂質(zhì)積聚較多,相對(duì)斑塊面積較對(duì)照組顯著增加(P<0.05);沙格列汀組小鼠脂質(zhì)蓄積較模型組明顯減少,相對(duì)斑塊面積也顯著減小(P<0.05),見圖3。

圖3 油紅O染色觀察各組小鼠主動(dòng)脈面積變化

2.4 各組小鼠主動(dòng)脈iNOS和Arg-1表達(dá)比較 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組小鼠主動(dòng)脈中iNOS陽性表達(dá)率增加(P<0.05),Arg-1陽性表達(dá)率減少(P<0.05);與模型組比較,沙格列汀組小鼠主動(dòng)脈中iNOS陽性表達(dá)率減少(P<0.05),而Arg-1陽性表達(dá)增加(P<0.05),見圖4。

圖4 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組小鼠主動(dòng)脈iNOS和Arg-1表達(dá)

2.5 各組小鼠主動(dòng)脈iNOS、Arg-1、AMPK-PPARα途徑蛋白表達(dá)比較 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組小鼠主動(dòng)脈中iNOS蛋白水平上調(diào)(P<0.05),Arg-1、p-AMPK及PPARα蛋白水平下調(diào)(P<0.05);與模型組比較,沙格列汀組中iNOS蛋白水平下調(diào)(P<0.05),Arg-1、p-AMPK及PPARα蛋白水平下調(diào)(P<0.05),見圖5。

圖5 Western blot檢測(cè)各組小鼠主動(dòng)脈iNOS、Arg-1及AMPK-PPARα途徑相關(guān)蛋白表達(dá)

2.6 各組RAW264.7巨噬細(xì)胞PPAR-α、TNF-α、IL-6、TGF-β、Arg-1 mRNA表達(dá)水平比較 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,誘導(dǎo)組RAW264.7細(xì)胞中PPAR-α、TGF-β、Arg-1 mRNA表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05),TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05);與誘導(dǎo)組比較,沙格列汀組中PPAR-α、TGF-β、Arg-1 mRNA表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05),TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05);而AMPK抑制劑組中PPAR-α、TGF-β、Arg-1 mRNA表達(dá)水平較沙格列汀組下調(diào),TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05),見表2。

表2 各組巨噬細(xì)胞PPAR-α、TNF-α、IL-6、TGF-β、Arg-1 mRNA表達(dá)水平比較

2.7 各組巨噬細(xì)胞M1型標(biāo)志物iNOS與M2型標(biāo)志物CD206熒光染色比較 免疫熒光染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,誘導(dǎo)組RAW264.7細(xì)胞中M1型標(biāo)志物iNOS陽性比例升高(P<0.05),M2型標(biāo)志物CD206陽性比例下降(P<0.05);與誘導(dǎo)組比較,沙格列汀組細(xì)胞中iNOS陽性比例下降,CD206陽性比例升高(P<0.05)。經(jīng)過AMPK抑制劑預(yù)處理后,與沙格列汀組比較,細(xì)胞中iNOS陽性比例升高(P<0.05),CD206陽性比例下降(P<0.05),見圖6。

圖6 免疫熒光染色檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞iNOS與CD206表達(dá)(100×)

3 討論

AS是導(dǎo)致心血管疾病發(fā)展的重要病理過程,可引起缺血性心臟病、中風(fēng)以及周圍血管疾病等。AS作為大中型動(dòng)脈的慢性炎癥性病變,也是全世界常見的死亡原因之一,給社會(huì)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。AS特征是免疫細(xì)胞浸潤形成,該免疫細(xì)胞浸潤由載脂的巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞和T細(xì)胞主導(dǎo),并引起脂質(zhì)滯留和動(dòng)脈壁中低密度脂蛋白的氧化修飾[3]。此外,高血壓、糖尿病、高脂血癥和吸煙等多種因素會(huì)促進(jìn)AS發(fā)展[7]。AS是一個(gè)長期綜合性過程,病理機(jī)制尚未完全明確,探究新的有效藥物及相關(guān)分子蛋白機(jī)制,為AS的治療提供新的細(xì)胞與分子靶點(diǎn)。

作為一種高效、可逆的選擇性DPP-4抑制劑,沙格列汀能夠通過升高胰高血糖素樣肽1來降低血糖,目前已應(yīng)用于2型糖尿病的治療中[6]。除降低血糖水平外,沙格列汀還可以通過改善胰島素抵抗代謝紊亂來有效改善脂質(zhì)代謝和肝功能。此外,多項(xiàng)研究表明,沙格列汀在多種疾病中具有重要的抗炎能力。Birnbaum等[8]研究表明,沙格列汀可通過抑制NLRP3炎性體的形成和促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18的產(chǎn)生來預(yù)防糖尿病性腎病。Brown等[9]研究顯示,沙格列汀能夠誘導(dǎo)表達(dá)CD11c的白細(xì)胞和CD8+淋巴細(xì)胞的獨(dú)特轉(zhuǎn)變,從而減輕了AngⅡ誘導(dǎo)的心臟舒張功能障礙、纖維化以及炎癥反應(yīng)。Connelly等[10]通過心肌梗死動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn),沙格列汀可顯著降低手術(shù)后的死亡率并恢復(fù)心臟功能。上述研究表明,沙格列汀可能在心血管疾病中發(fā)揮有益作用。本研究顯示,給予AS小鼠沙格列汀治療后,小鼠血脂水平改善,主動(dòng)脈斑塊減少,管腔狹窄程度減小,表明沙格列汀對(duì)AS具有一定的改善作用。

巨噬細(xì)胞在AS的發(fā)生以及動(dòng)脈斑塊的生長和破裂中起著核心作用,能夠通過分泌促炎性細(xì)胞因子和趨化因子以及產(chǎn)生活性氧來幫助維持局部炎癥反應(yīng)。此外,巨噬細(xì)胞與主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞之間的串?dāng)_,通過產(chǎn)生其他促炎性細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)成分?jǐn)U大炎性循環(huán),從而進(jìn)一步促進(jìn)脂蛋白保留[11]。巨噬細(xì)胞在斑塊中遷移能力降低,防止炎癥消退并促進(jìn)一系列復(fù)雜反應(yīng),導(dǎo)致斑塊的破裂。在持續(xù)的炎癥反應(yīng)驅(qū)動(dòng)下,巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡,并導(dǎo)致在沒有有效胞吐作用的情況下，細(xì)胞碎片和凋亡細(xì)胞不斷積累,從而促進(jìn)AS斑塊中壞死核心的形成[12]。巨噬細(xì)胞分為經(jīng)典激活(M1)和交替激活(M2)表型。M1型巨噬細(xì)胞響應(yīng)干擾素、toll樣受體配體、病原體相關(guān)分子復(fù)合物和脂蛋白而極化,可分泌促炎因子,例如IL-1β、IL-6和TNF-α。M2型巨噬細(xì)胞由細(xì)胞因子IL-4和IL-13誘導(dǎo)所激活,并分泌抗炎因子,如：IL-1受體激動(dòng)劑、IL-10和TGF-β[4-5]。研究表明,在AS病變中,M1型巨噬細(xì)胞位于容易破裂和不穩(wěn)定的區(qū)域,促進(jìn)AS和不穩(wěn)定斑塊的發(fā)展,而M2型巨噬細(xì)胞位于更穩(wěn)定的區(qū)域,促進(jìn)組織修復(fù)、斑塊穩(wěn)定性和斑塊消退[13]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)過沙格列汀治療的AS小鼠主動(dòng)脈中,M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS表達(dá)減少,M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物Arg-1表達(dá)增加,由此推測(cè),沙格列汀可能誘導(dǎo)了AS中巨噬細(xì)胞向M2型極化,從而發(fā)揮減輕AS的作用。

本研究顯示,AS小鼠主動(dòng)脈中p-AMPK、PPARα蛋白水平均下調(diào),而經(jīng)過沙格列汀治療后兩者表達(dá)均上調(diào)?；罨蟮腁MPK可通過影響脂質(zhì)代謝相關(guān)基因和蛋白質(zhì)(如PPARα)的表達(dá),抑制脂肪酸、膽固醇、三酰甘油的合成,并促進(jìn)脂肪酸攝取和β-氧化[14]。PPARα激活后,調(diào)控多個(gè)參與脂肪酸的攝取、氧化以及脂質(zhì)代謝過程中的基因表達(dá)。已有研究表明,激活PPARα信號(hào)通路在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵的抗AS作用[15-16]。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)抑制AMPK信號(hào)通路的激活，觀察巨噬細(xì)胞極化情況,結(jié)果顯示,在AMPK抑制劑Compound C預(yù)處理的巨噬細(xì)胞中，PPAR-α、TGF-β、Arg-1表達(dá)下調(diào),TNF-α、IL-6表達(dá)上調(diào),同時(shí),M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS表達(dá)增加,而M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206表達(dá)減少。表明沙格列汀給藥后可能激活了AMPK-PPARα途徑,從而調(diào)控巨噬細(xì)胞向M2型極化,以發(fā)揮改善AS的作用。

綜上所述,沙格列汀能夠激活A(yù)MPK-PPARα途徑，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化,以減輕AS斑塊的進(jìn)展。本研究為進(jìn)一步探究沙格列汀調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化在AS中的作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),為AS的治療提供了新思路。