石思偉，賈潤清，韓 盧，鄧雄威，梁朝遠(yuǎn)，張曉菲，楊立群，趙維堅(jiān)，申玉蓉，琚 琪，盛 望*

0 引言

腫瘤疫苗在癌癥治療中具有巨大的應(yīng)用前景。固有免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，擁有一種稱為模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)的特殊受體。這些模式識(shí)別受體的配體稱為病原體相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular pattern，PAMPs)[1]。位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的Toll樣受體9(Toll like recepter，TLR9)對(duì)核酸的反應(yīng)在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中得到了廣泛的研究[2]，可以誘導(dǎo)促炎反應(yīng)，從而增強(qiáng)免疫反應(yīng)[3]。胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸的寡脫氧核苷酸(CpG oligonucleotide，CPG-ODNs)能夠促進(jìn)機(jī)體的TH1反應(yīng)，通過與TLR9相互作用發(fā)出信號(hào)，從而觸發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)，提高宿主消除病原體的能力[4-5]。β-葡聚糖(β-glucans)通過刺激粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞發(fā)揮免疫作用[6]?？乖蔬f細(xì)胞(Antigen presenting cells，APCs)表達(dá)各種受體，包括Dectin-1，這些受體可與β-(1-3)-葡聚糖[β-(1-3)-glucans]特異結(jié)合，調(diào)控下游信號(hào)通路，進(jìn)而激活體內(nèi)的免疫反應(yīng)[7-10]。將β-(1-3)-葡聚糖進(jìn)行羧甲基化修飾形成羧甲基化β-(1-3)-葡聚糖(Carboxymethyl β-glucan，CMG)，可提高其水溶性，便于納米顆粒的組裝[11]。腫瘤裂解物中富含腫瘤相關(guān)抗原(Tumor-associated antigen，TAA)和腫瘤特異性抗原(Tumor specific antigen，TSA)，但APCs對(duì)抗原的提呈效率較低，所以需要開發(fā)新型的遞送系統(tǒng)來產(chǎn)生持久的免疫反應(yīng)[12]。MC38是鼠源的結(jié)腸癌細(xì)胞，因其易于培養(yǎng)、成瘤性強(qiáng)，被廣泛用于構(gòu)建結(jié)腸癌動(dòng)物模型。

本研究利用CMG、魚精蛋白硫酸鹽(Protamine sulfate，PS)與CPG-ODNs共組裝形成的負(fù)載CPG的納米顆粒(Nanoparticles-encapsulated CPG，CNP)進(jìn)行體外水平的小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells derived from mouse bone marrow，BMDC)免疫激活實(shí)驗(yàn)，MC38腫瘤裂解物與CNP納米顆粒共同組成納米疫苗進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn),探究腫瘤裂解物納米疫苗抗腫瘤作用，為腫瘤治療探索新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)C57BL/6雌性小鼠60只(13～15 g，6～8周齡)購買于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2019-0010]，飼養(yǎng)于譜尼測(cè)試集團(tuán)股份有限公司動(dòng)物房[SYXK(京)2018-0022]，嚴(yán)格按照其要求進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(動(dòng)物倫理批號(hào)PONY-2020-FL-71)。

MC38細(xì)胞儲(chǔ)存于北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院；CMG、PS均購于美國Sigma公司；恒溫磁力攪拌器購于上海司樂儀器有限公司；CPG-ODN 1826由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其基因序列為:TCCATGACGTTCCTGACGTT；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)；白細(xì)胞介素4(Interleukin 4，IL-4)購于Peprotech公司；CD3抗體、CD4抗體、CD8抗體、CD80抗體和CD86抗體購于BioLegend公司；胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、PBS(Phosphate buffered saline)緩沖液、RPMI-1640購于Gibco公司；青鏈霉素混合液購自Hyclone公司；DNA酶(DNAase)、紅細(xì)胞裂解液購于索萊寶公司；膠原酶V購于Sigma Aldrich公司；70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)、淋巴細(xì)胞分離液、鼠白細(xì)胞介素6(Interleukin 6，IL-6)、鼠白細(xì)胞介素12p40(Interleukin 12p40，IL-12p40)、鼠腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor，TNF-α)、鼠γ干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)ELISA試劑盒均購于達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司；EDTA抗凝管購于BD Biosciences公司；動(dòng)態(tài)光散射激光粒度儀購于馬爾文儀器有限公司；FACS流式細(xì)胞儀購于BD公司。

1.2 CNP納米佐劑的制備及表征 用去離子水配制CMG(1 mg/ml)、PS(1 mg/ml)，0.22 μm微孔濾膜過濾后，將PS溶液緩慢逐滴加入CMG溶液中，磁力攪拌30 min后靜置5 min，12 000 g離心15 min，棄上清溶解于超純水中，完成空納米顆粒(Nanoparticles，NP)的制備。將CPG-ODN(1 μg/μl)溶于CMG(1 mg/ml)溶液中形成混合液，重復(fù)滴加PS等后續(xù)操作即可完成CNP制備，所含CPG濃度為20 μg/ml。用動(dòng)態(tài)光散射激光粒度儀對(duì)CNP進(jìn)行表征。

1.3 MC38細(xì)胞裂解物制備 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的MC38用胰酶消化，終止消化后PBS重懸離心，用PBS調(diào)整細(xì)胞密度至107個(gè)/ml，將細(xì)胞懸液置于凍存管中，將凍存管置于液氮5 min后放于37 ℃水浴鍋5 min，重復(fù)5次。2 000 g離心15 min，棄去沉淀，采用BCA法測(cè)定蛋白含量后備用。

1.4 體外刺激BMDC成熟實(shí)驗(yàn) 將6周左右的C57BL/6小鼠處死，剝離其脛骨與股骨，浸于70%乙醇中，用RPMI-1640多次沖洗骨髓，收集骨髓細(xì)胞，在培養(yǎng)箱中放置30 min后，收集非貼壁細(xì)胞，得到BMDC。用樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DC)培養(yǎng)基(RPMI-1640+20 ng/ml GM-CSF+1 ng/ml IL-4)調(diào)整細(xì)胞密度為106個(gè)/ml，于6孔板中每孔鋪4 ml細(xì)胞懸液，每間隔2 d更換DC培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d。第7天將細(xì)胞以106個(gè)/ml的密度鋪于24孔板中，并分為4組進(jìn)行加藥刺激，分別為PBS組、NP組(β-葡聚糖200 μg/ml)、CPG(4 μg/ml)組和CNP組(CPG 4 μg/ml)，每組分別給藥10 μl。培養(yǎng)24 h后收集上清與BMDC進(jìn)行后續(xù)測(cè)定。

1.5 體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn) 將C57BL/6雌性小鼠適應(yīng)性生長1周。培養(yǎng)MC38細(xì)胞至對(duì)數(shù)期，胰酶消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為3×106個(gè)/ml，每只小鼠的右后肢皮下接種100 μl的MC38細(xì)胞。用CNP溶液將MC38細(xì)胞裂解物濃度調(diào)整至500 μg/ml，混合物即為裂解物納米疫苗(vaccine)。用PBS將MC38細(xì)胞裂解物濃度調(diào)整至500 μg/ml，即為lysate。篩選出腫瘤體積為50 mm3、大小相近的24只小鼠，并隨機(jī)分為4組(PBS組、lysate組、CNP組和vaccine組)。每組頸部皮下注射藥物100 μl，此時(shí)記為第0天。每過7 d免疫1次，免疫期間每2 d測(cè)量腫瘤最大直徑(d)和最小直徑(r)，根據(jù)公式d×r2/2計(jì)算腫瘤體積。

1.6 取材處理 在最后1次免疫3 d后，對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，用眼眶取血法收集外周血于EDTA抗凝管中，4 000 r/min離心10 min,分別收集上清和紅細(xì)胞。離心后收集的外周血用淋巴細(xì)胞分離液分離，收集淋巴細(xì)胞，PBS潤洗1次后進(jìn)行流式抗體染色。用脫頸法處死小鼠，解剖出小鼠腹股溝淋巴結(jié)和脾臟，將淋巴結(jié)剪碎后在37 ℃條件下用RPMI -1640、膠原酶Ⅴ(41.75 μg/ml)和DNA酶(2 μg/ml)消化30 min。將消化完全的淋巴結(jié)組織分別置于70 μm篩網(wǎng)中研磨，RPMI-1640沖洗后離心，淋巴細(xì)胞分離液分離收集淋巴細(xì)胞，PBS潤洗1次后進(jìn)行流式抗體染色。將脾臟置于70 μm篩網(wǎng)中加入PBS研磨，沖洗后離心，紅細(xì)胞裂解液處理后收集剩余白細(xì)胞，PBS潤洗1次后進(jìn)行流式抗體染色。

1.7 ELISA測(cè)定BMDC上清與血清細(xì)胞因子含量 按照ELISA試劑盒說明書操作，測(cè)定BMDC上清中IL-6、IL-12p40含量，測(cè)定小鼠血清中IFN-γ、TNF-α含量。

1.8 流式細(xì)胞術(shù) 對(duì)BMDC進(jìn)行CD80、CD86的流式抗體染色，對(duì)血白細(xì)胞、脾臟淋巴細(xì)胞、腹股溝淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞進(jìn)行CD3、CD4及CD8的流式抗體染色，利用BD-FACS流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 CNP納米顆粒表征 如圖1所示，CNP納米顆粒zeta電位為(-23.1±0.4) mV，納米顆粒粒徑約為(213.2±0.8) nm，尺寸適用于進(jìn)行體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)。

圖1 CNP納米顆粒表征

2.2 CNP納米顆粒激活DC成熟 DC作為機(jī)體內(nèi)主要的抗原提呈細(xì)胞，在其未成熟時(shí)缺乏對(duì)抗原的提呈能力，只具有一定的抗原捕獲能力，而成熟的DC具有很強(qiáng)的抗原提呈能力，促進(jìn)T細(xì)胞分化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。體外激活BMDC實(shí)驗(yàn)如圖2所示，CD80、CD86是DC表面成熟標(biāo)志物分子，CNP組(18.9%±0.7%)與CPG組(12.2%±0.2%)相比，對(duì)DC的促成熟作用有顯著性差異(P=0.011 6)，CNP組與PBS組(8.1%±0.9%)相比,能顯著促進(jìn)DC成熟(P=0.005 1)。單獨(dú)的空納米顆粒刺激DC成熟作用不顯著。圖3所示,CPG可以刺激DC產(chǎn)生大量IL-12p40(10 100.7±378.2)pg/ml和IL-6(84 746.8±2 657.7)pg/ml，與CPG組比較，CNP顯著增強(qiáng)了BMDC對(duì)IL-12p40[(15 111.2±1 844.3)pg/ml]和IL-6[(190 402.1±11 524.8)pg/ml]的分泌(P=0.019 7，P<0.000 1)。

2.3 荷瘤小鼠腫瘤體積變化 4種給藥方式處理后的腫瘤體積變化如圖4所示。與PBS組比較，lysate單獨(dú)作用下腫瘤體積減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.38，P=0.94)；CNP單獨(dú)作用下，腫瘤體積具有一定程度的減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.94，P<0.01);Vaccine組腫瘤體積明顯減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.76，P<0.01)。

2.4 小鼠血清IFN-γ及TNF-α含量 4種給藥方式處理后的小鼠血清IFN-γ及TNF-α含量結(jié)果見圖5，MC38裂解物納米疫苗免疫后，小鼠的IFN-γ和TNF-α分別為PBS組的3倍和1.5倍(P=0.040 6，P=0.019 7)；lysate組小鼠IFN-γ與TNF-α的含量無顯著變化(P=0.615 2，P=0.066 1)；CNP組小鼠IFN-γ與TNF-α的含量無顯著變化(P=0.359 6，P=0.059 0)。

圖2 DC細(xì)胞在不同藥物刺激下成熟情況

圖3 DC上清IL-6(A)、IL-12p40(B)的含量

圖4 各組腫瘤體積增長曲線

2.5 小鼠外周血T淋巴細(xì)胞百分比 使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如圖6，MC38腫瘤裂解物納米疫苗和PBS組相比，輔助性T淋巴細(xì)胞變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.191 3)，但產(chǎn)生了更多的殺傷性T淋巴細(xì)胞，vaccine組的CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞約為PBS組的2.5倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007 9)。CNP組的CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞約為對(duì)照組的2倍，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.095 6)。lysate組與PBS組相比，外周血CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞百分比、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.771 5、P=0.184 9)。

圖5 小鼠血清中的IFN-γ(A)和TNF-α(B)含量

圖6 小鼠外周血T淋巴細(xì)胞比例

2.6 小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞百分比 小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞流式結(jié)果如圖7所示。與PBS組比較，vaccine組CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例顯著上升(P=0.046 5)；lysate組脾臟CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.702 7，P=0.293 8)；CNP組脾臟CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.737 1，P=0.322 2)。

圖7 小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞比例

2.7 小鼠腹股溝淋巴結(jié)T淋巴細(xì)胞百分比 各組腹股溝淋巴結(jié)T淋巴細(xì)胞流式結(jié)果如圖8。與PBS組比較，vaccine組CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞比例升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026 9)。單獨(dú)使用lysate或CNP免疫條件下，與PBS組相比，CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.907 4，P=0.184 2)。與PBS組相比，lysate組、CNP組、vaccine組的CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.233 1，P=0.338 3，P=0.965 1)。

圖8 小鼠腹股溝淋巴結(jié)T淋巴細(xì)胞比例

3 討論

CPG具有直接激活B細(xì)胞和單核細(xì)胞(巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)的能力,同時(shí)可以間接激活NK細(xì)胞和T細(xì)胞等多種免疫效應(yīng)細(xì)胞[4,13]。CPG-ONDs這一特性決定了其作為免疫佐劑的巨大潛力。傳統(tǒng)免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療效果不理想正是源于CD8+T淋巴細(xì)胞缺失[14]。完整腫瘤細(xì)胞裂解產(chǎn)物是TAA的廣泛來源，這將會(huì)促進(jìn)形成CD4+輔助性T淋巴細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。BMDC成熟實(shí)驗(yàn)表明，CNP納米佐劑有效地促進(jìn)了DC的成熟，提高DC的抗原提呈能力。因此，腫瘤裂解物輔以適當(dāng)?shù)淖魟┛梢哉T導(dǎo)更加完整高效的免疫反應(yīng)，用于癌癥的治療。

單獨(dú)使用CNP納米顆粒和MC38細(xì)胞裂解物雖具有一定的抗腫瘤效果，但二者組成的納米疫苗抗腫瘤效果最優(yōu)，腫瘤體積增加幅度最小，同時(shí)納米疫苗還提高外周血及脾臟中CD8+T淋巴細(xì)胞比例，提高腹股溝淋巴結(jié)CD4+T淋巴細(xì)胞比例，表明有效免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，需要同時(shí)具備CNP激活DC與裂解物提供抗原2種條件。IL-6在健康免疫和多種疾病調(diào)理的過程中具有重要的作用[15]，可以刺激B細(xì)胞、T細(xì)胞的增殖，從而產(chǎn)生抗體和CTL分化，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫活性。IL-12同樣具有免疫治療及抗腫瘤的潛力[16]。IFN-γ具有細(xì)胞抑制、促凋亡和抗增殖功能，其在細(xì)胞免疫的激活以及隨后的抗腫瘤免疫反應(yīng)的過程中起著關(guān)鍵作用[17]。TNF-α是一種多效細(xì)胞因子，參與控制炎癥、抗腫瘤反應(yīng)和免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)控制等一系列生理過程[18]。本研究設(shè)計(jì)的MC38腫瘤裂解物納米疫苗體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠體內(nèi)多種細(xì)胞因子含量得到了顯著的提升，改善了腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)了機(jī)體的抗腫瘤免疫水平。

本研究利用納米技術(shù)構(gòu)建CNP納米佐劑，并與MC38腫瘤裂解物共同組成抗腫瘤納米疫苗，本納米疫苗在體內(nèi)及體外水平均具有良好的免疫激活能力，以及明顯的結(jié)腸癌抑制能力，可以有效抑制腫瘤的生長，提高多種細(xì)胞因子含量，提升脾臟及外周血CD8+T淋巴細(xì)胞比例，提升腹股溝淋巴結(jié)CD4+T淋巴細(xì)胞比例，大幅增強(qiáng)小鼠腫瘤免疫水平。本研究為結(jié)腸癌的免疫治療提供了新的技術(shù)思路。