張清月， 董姝慧， 李胤豪， 趙艷麗， 史彬林， 閆素梅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院；內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018)

隨著我國飼料端全面禁抗的落實(shí)，研發(fā)可在飼料中添加、具有疾病預(yù)防功效的替抗產(chǎn)品便成為飼料行業(yè)備受關(guān)注的熱點(diǎn)。諾麗(MorindacitrifoliaL.，Noni)，藥名海巴戟，是一種在我國東南部地區(qū)廣泛種植的小型灌木。諾麗果具有促進(jìn)絨山羊體外瘤胃發(fā)酵的功效[1]，極具開發(fā)為綠色飼料添加劑及新型替抗產(chǎn)品的前景。國內(nèi)外對于諾麗果的研究證實(shí)其各類提取物都具有良好的抗氧化活性，且主功效成分是諾麗果多糖、多酚和黃酮類物質(zhì)。體外試驗(yàn)表明諾麗果多糖對DPPH和ABTS自由基的清除力均表現(xiàn)出濃度依賴效應(yīng)，并以超聲波輔助法提取的多糖表現(xiàn)最佳[2]。此外，成熟和未成熟諾麗果富多酚提取物均能以劑量依賴性的方式抵消活性氧誘導(dǎo)的人SW872脂肪肉瘤細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激[3]。而諾麗果提取物制備的磷脂復(fù)合物外用凝膠(AMFE-p)對兔子口腔潰瘍模型具有良好的療效，10%AMFE-P的總酚和東莨菪素的累積釋放率最高[4]。此外，經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化所得諾麗果黃酮，在濃度為8.00 mg/mL時(shí)，對DPPH自由基和羥自由基清除率最高[5]。有體外試驗(yàn)表明從諾麗果汁中分離出的蘆丁和五羥黃酮具有良好的抗炎作用，可抑制LPS刺激的巨噬細(xì)胞中NO的產(chǎn)生，并可下調(diào)IKKα/β、I-κB α、NF-κB p65、一氧化氮合酶和環(huán)氧合酶2的蛋白表達(dá)[6]。目前國內(nèi)外對于諾麗果的研究仍集中在其活性成分的提取及純化工藝上，而對于諾麗原果提取物及其分離得到的單體化合物活性的比較研究還不夠充分，尤其是對諾麗果中主功效成分抗氧化能力的強(qiáng)弱及其對諾麗果總抗氧化能力貢獻(xiàn)率的研究仍缺乏相關(guān)資料報(bào)道，而這些方面的研究不僅能為諾麗果各成分與其抗氧化之前的關(guān)系提供參考價(jià)值，還對諾麗資源的綜合利用及集約化養(yǎng)殖中替抗產(chǎn)品的開發(fā)具有重要意義。

本研究利用抗氧化活性綜合(APC)指數(shù)結(jié)合總抗氧化能力(TAC)貢獻(xiàn)率，基于當(dāng)前較成熟的3種體外抗氧化能力評價(jià)方法——1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)法以及鐵離子還原(FRAP)法[7]評價(jià)不同濃度梯度的諾麗果多糖、多酚和黃酮的抗氧化性能，以期為諾麗果資源在飼料領(lǐng)域的綜合利用提供基礎(chǔ)，也為飼料行業(yè)中替抗產(chǎn)品的開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與主要儀器

諾麗果風(fēng)干片，于65 ℃烘干，粉碎后過40目篩，得到諾麗果粉。DPPH、ABTS、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、抗壞血酸(VC)、沒食子酸、蘆丁、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、蒽酮以及葡萄糖等均為國產(chǎn)分析純。超聲波清洗機(jī)(DTC-27J)、全自動(dòng)酶標(biāo)儀(SYNERGY H1)、紫外可見分光光度計(jì)(UV1780)等。

1.2 諾麗果多糖、多酚和黃酮的制備

諾麗果多糖采用超聲波輔助浸提法提取[2]：將諾麗果粉20 g與蒸餾水以1∶33的比例混勻，于78 ℃超聲浸提82 min(超聲功率：605 W)。之后，6 000 r/min離心15 min得到諾麗果多糖溶液。將溶液于55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至100 mL。冷卻至室溫后，加入3倍體積無水乙醇，在4 ℃沉淀24 h。最后，6 000r/min離心15 min，將所獲沉淀于-50 ℃凍干，粉碎后得到諾麗果多糖(NFS，得率為12.08%)。

諾麗果多酚采用超聲波輔助浸提法[8]提?。簩⒅Z麗果粉20 g與53%的乙醇溶液以1∶32的比例混勻，于50 ℃超聲浸提33 min(超聲功率：605 W)。之后，6 000 r/min離心15 min得到諾麗果多酚溶液。將溶液于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至100 mL。最后，-50 ℃凍干并粉碎得到諾麗果多酚(NFP，得率為35.52%)。

諾麗果黃酮采用超聲波輔助浸提法提取[5]：將諾麗果粉20 g與90%的乙醇溶液以1∶35的比例混勻，70 ℃超聲浸提15 min(超聲功率：605 W)。之后，6 000 r/min離心15 min得諾麗果黃酮溶液。將溶液于60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至100 mL。最后，-50 ℃凍干并粉碎得到諾麗果黃酮(NFF，得率為27.08%)。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 NFS中的總糖、總酚和總黃酮含量

NFS中的多糖含量測定：即多糖含量=總糖含量-還原糖含量?？偺呛坎捎幂焱蛩岱╗9]測定，取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的250 mg/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，補(bǔ)水至2 mL，加入6 mL用88%硫酸配制的4 g/L蒽酮硫酸溶液，漩渦混勻后沸水浴10 min，冷卻至室溫后測定620 nm處的吸光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并求回歸方程。用2 mL蒸餾水配制250 mg/L NFS溶液代替葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，其余操作同上，測定NFS中的總糖含量。

還原糖含量的測定采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[10]并稍作修改。向500 mL 37%酒石酸鉀鈉熱水溶液中依次加入6.3 g DNS、262 mL 8% NaOH溶液、5 g結(jié)晶酚和5 g無水Na2SO3，待溶解冷卻后，蒸餾水定容至1 000 mL，避光放置7 d后即得DNS試劑。分別向刻度試管中加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL的1.0 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，補(bǔ)水至2 mL，加入1.5 mL DNS試劑，混勻后沸水浴準(zhǔn)確加熱5 min，冷卻至室溫后用蒸餾水定容至20 mL，混勻后測定540 nm處的吸光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并求回歸方程。用2 mL蒸餾水配制的2mg/mL NFS溶液代替葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，其余操作同上，測定NFS中還原糖的含量。

NFP中總酚含量采用福林酚法測定[11]。將53%乙醇溶液配制的0.5 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度稀釋至濃度為100、20、10、5、2.5、1.25 μg/mL的沒食子酸工作液。分別取不同濃度梯度的工作液0.5 mL，依次加入1 mL福林酚試劑和4 mL 7.56%碳酸鈉溶液，旋渦混勻后室溫靜置2 h，于波長765 nm比色，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求回歸方程。用0.5 mL 53%乙醇配制的500 μg/mL NFP溶液代替沒食子酸工作液，其余操作同上，測定NFP中總酚的含量。

NFF中的總黃酮含量采用NaNO2-Al(NO3)3顯色法測定[12]。精確移取體積為0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL用90%乙醇配制的200 mg/L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，補(bǔ)加90%乙醇至5mL，混勻后加入0.5 mL 5% NaNO2，混勻后靜置6 min，加入4 mL 4%NaOH，靜置15 min后于波長510 nm處比色，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求回歸方程。用1 mL 90%乙醇配置的200 mg/L NFF溶液代替蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，其余操作同上，測定NFF中總黃酮的含量。

1.3.2 NFS、NFP和NFF的抗氧化活性

1.3.2.1 DPPH法參照Khan等[13]，并稍作修改進(jìn)行測定。分別吸取2 mL不同濃度的諾麗果各提取物溶液(0.006 25、0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL)，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，混勻后室溫避光反應(yīng)30 min，之后于波長517 nm測定吸光值。以VC為陽性對照。建立不同濃度樣品與對應(yīng)DPPH自由基清除率的回歸方程，計(jì)算對DPPH自由基清除率達(dá)50%時(shí)所需的樣品濃度(mg/ mL)，用EC50表示。

清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A0為提取物溶劑代替樣品的反應(yīng)體系吸光值;A1為提取物樣品的反應(yīng)體系吸光值;A2為提取物溶劑代替DPPH的反應(yīng)體系吸光值。

1.3.2.2 ABTS法參照Aati等[14]方法并稍加修改進(jìn)行測定。將7.0 mmol/L ABTS溶液與2.45mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混勻，室溫避光反應(yīng)16 h得到ABTS自由基貯備液。用各提取物的溶劑對貯備液進(jìn)行稀釋，使其在波長734 nm處的吸光值為(0.070±0.02)，于30 ℃避光平衡30 min后得ABTS自由基工作液(現(xiàn)用現(xiàn)配)。取1 mL不同濃度的各提取物溶液(梯度濃度同1.3.2.1)，加入1 mL ABTS自由基工作液，于30 ℃避光反應(yīng)4 min，測定波長為734 nm的吸光值。以VC為陽性對照。建立不同濃度樣品與相應(yīng)ABTS自由基清除率的回歸方程，計(jì)算對自由基清除率達(dá)50%時(shí)所需的樣品濃度(mg/mL)，用EC50表示。

清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A0為提取物溶劑代替樣品的反應(yīng)體系吸光值；A1為提取物的反應(yīng)體系吸光值；A2為提取物溶劑替代ABTS工作液的反應(yīng)體系吸光值。

1.3.2.3 FRAP法參照Benzie等[15]并稍作修改測定。將0.3 mol/L 醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 3.6)、0.01 mol/L TPTZ溶液和0.02 mol/L FeCl3按照體積比為10∶1∶1混勻，制得FRAP工作液。取0.5 mL不同濃度的各提取物溶液(梯度濃度同1.3.2.1)，加入3 mL于37 ℃預(yù)熱的FRAP工作液，混勻后于37 ℃反應(yīng)15 min，測定波長593 nm處的吸光值。以VC為陽性對照。用不同濃度的FeSO4溶液代替樣品，其余操作同上，建立濃度與吸光度的線性回歸方程，用A1-A0-A2差值計(jì)算出相應(yīng)的FeSO4濃度。根據(jù)不同濃度樣品與對應(yīng)的FeSO4濃度建立回歸方程，計(jì)算與0.1 mmol/L FeSO4溶液具有相同抗氧化活性的樣品濃度(mg/mL)，用EC0.1值表示。

1.3.3 諾麗果不同提取物總抗氧化活性評價(jià)

使用APC指數(shù)[16]結(jié)合不同提取物對諾麗果TAC的貢獻(xiàn)率[17]評價(jià)諾麗果不同提取物的總抗氧化活性。

式中：EAPC(APC指數(shù)當(dāng)量)為每種提取物的APC指數(shù)×每克諾麗果中每種提取物的含量(得率)；TAC為每克諾麗果中所有提取物的EAPC之和。

1.4 統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 各提取物的多糖、總酚與總黃酮含量

總糖和還原糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為圖1和圖2所示。根據(jù)總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算諾麗果多糖中的總糖含量為296.4 mg/g，還原糖含量為25.2 mg/g，則多糖含量為271.2 mg/g。根據(jù)沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)方程計(jì)算NFP中的總酚含量為423.0 mg/g。根據(jù)蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)方程計(jì)算NFF中的總黃酮含量為23.14 mg/g。

圖1 總糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 還原糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 總酚含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 總黃酮含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 諾麗果各提取物的抗氧化能力

2.2.1 利用DPPH、ABTS和FRAP法評價(jià)諾麗果提取物自由基清除能力和鐵離子還原力

本研究利用DPPH法、ABTS法和FRAP法檢測了3種諾麗果提取物的抗氧化能力，結(jié)果如圖5所示。3種提取物對DPPH自由基的清除活性隨濃度的增加而增加，其中，NFP和NFS表現(xiàn)出較好的量效關(guān)系(圖5a)。3種提取物對ABTS自由基的清除活性均表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系(圖5b)。與陽性對照VC相比，3種提取物的Fe3+還原力均隨濃度的增加而緩慢上升(圖5c)。其中，NFP的量效關(guān)系略優(yōu)于NFS和NFF。

圖5 3種諾麗果提取物及VC對DPPH和ABTS自由基的清除作用及鐵離子還原力

2.2.2 諾麗果各提取物總抗氧化活性的綜合評價(jià)

EC50值表示對自由基的清除率達(dá)50%時(shí)提取物的濃度，因而該值越小表明提取物的抗氧化活性越強(qiáng)。由表1 所列DPPH EC50可知，3種提取物及VC清除DPPH自由基能力的大小依次為：VC>NFS>NFP>NFF。但隨著濃度的增加，NFP和NFF對ABTS的清除力于0.4mg/mL時(shí)先達(dá)到陽性對照VC的水平。并且由表1中ABTS EC50可知，對ABTS自由基的清除能力由大到小依次為：VC>NFP>NFF>NFS。EC0.1值表示與0.1 mmol/L FeSO4溶液的抗氧化能力相同時(shí)的提取物濃度，因而該值越小表明提取物的抗氧化活性越強(qiáng)。如表1EC0.1所示，3種提取物及VC的Fe3+還原力由大到小依次為：VC>NFP>NFS>NFF。

在EC50和EC0.1的基礎(chǔ)上進(jìn)一步計(jì)算APC指數(shù)，并與不同提取物對諾麗果TAC的貢獻(xiàn)率相結(jié)合，綜合評價(jià)3種諾麗果提取物的總抗氧化活性，結(jié)果如表1所示。以陽性對照VC的APC指數(shù)為100%，則3種提取物的APC指數(shù)由大到小依次為：NFP>NFF>NFS。并且，3種提取物對諾麗果TAC的貢獻(xiàn)率也依次為：NFP(52.59%)>NFF(36.08%)>NFS(11.33%)。

表1 3種諾麗果提取物抗氧化活性的綜合評價(jià)

3 討論

動(dòng)物機(jī)體中所產(chǎn)生的活性氧自由基若不能被及時(shí)清除，便會(huì)因積聚而誘發(fā)氧化應(yīng)激，進(jìn)而對機(jī)體產(chǎn)生危害?？寡趸瘎┛勺饔糜谘踝杂苫瑢⑵鋸募?xì)胞中清除或使其失活。DPPH法、ABTS法和FRAP法是3種常用的測試物質(zhì)抗氧化能力的方法[7]。DPPH與ABTS均是比較穩(wěn)定的自由基，DPPH法和ABTS法的目的即是分別測定抗氧化物質(zhì)對這兩種自由基清除能力的強(qiáng)弱，清除能力越強(qiáng)，則該物質(zhì)的抗氧化能力越強(qiáng)。而FRAP法則是測定抗氧化物質(zhì)對Fe3+還原力的強(qiáng)弱，還原力越強(qiáng)，則抗氧化性能越高。并且，這3種方法的親脂性和親水性均較佳，對脂溶性和水溶性物質(zhì)的抗氧化性能測定效果均較好。因此，本研究選用上述3種方法測定不同濃度的NFP、NFS以及NFF的抗氧化能力。結(jié)果表明NFP、NFS和NFF均具有一定的抗氧化能力，但不同方法測得的抗氧化活性較強(qiáng)的提取物并不一致。清除DPPH自由基能力較強(qiáng)的為NFS；清除ABTS自由基能力較強(qiáng)的為NFP和NFF，分別是NFS的3.4和3.3倍；而Fe3+還原力較強(qiáng)的是NFP。這可能是由于3種提取物化學(xué)成分的固有復(fù)雜性及不同測試方法所響應(yīng)的反應(yīng)物并不一致造成的[16]。因而僅用一種方法難以準(zhǔn)確評價(jià)不同提取物的抗氧化能力，因此本試驗(yàn)采用APC指數(shù)法將3種測試結(jié)果降維表示。結(jié)果表明3種提取物的綜合抗氧化能力雖較陽性對照VC仍存在一定差距，但NFP和NFF的抗氧化綜合能力在三者中較強(qiáng)，分別是NFS的2.1倍和1.9倍。因而僅就提取物本身的抗氧化活性而言，NFP和NFF較優(yōu)。類似的研究也發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草提取液中多酚和黃酮的含量與其清除DPPH自由基的EC50值呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.886和-0.852；而得率最高的多糖，其含量則與EC50無顯著相關(guān)性[18]。研究桑黃子實(shí)體抗氧化活性成分的試驗(yàn)也表明，其抗氧化活性物質(zhì)存在于醇提物中，并且多糖在抗氧化中所起作用小，多酚和黃酮類為其主要抗氧化活性物質(zhì)，二者的含量與抗氧化活性呈線性正相關(guān)[19]。這或許說明，多酚類和黃酮類物質(zhì)本身的抗氧化活性優(yōu)于多糖，具體機(jī)理還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3種提取物對諾麗果TAC貢獻(xiàn)率由大到小的順序與APC指數(shù)一致，均為NFP>NFF>NFS，但由于多酚的得率較高，三者之間的差距加大，NFP的貢獻(xiàn)率分別是NFF和NFS的1.5倍和4.6倍。因此，在這3種諾麗果提取物中，具有較強(qiáng)抗氧化活性且對諾麗果TAC貢獻(xiàn)率較高的是NFP。近期國內(nèi)外對于諾麗抗氧化及抗炎成分的研究多集中于諾麗發(fā)酵果汁、諾麗葉及諾麗果渣上，較少見對于諾麗原果中抗氧化成分的研究。有學(xué)者采用生物驅(qū)動(dòng)測定技術(shù)及植物化學(xué)分析技術(shù)分離出了諾麗發(fā)酵果汁中的5種抗炎成分，分別為車葉草苷酸、蘆丁、(2E,4E,7Z)-deca-2,4,7-trienoate-2-O-β-d-glucopyranosyl-β-d-glucopyranoside和五羥黃酮，其中以蘆丁和五羥黃酮的得率較高，為3 mg/L[6]。這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果不盡相同，可能是因?yàn)樯鲜鲅芯康脑囼?yàn)材料為諾麗發(fā)酵果汁，而在發(fā)酵過程中，由于微生物的作用，諾麗果中原活性成分及含量會(huì)發(fā)生一定的變化，從而與原果不同。研究強(qiáng)化諾麗果發(fā)酵的試驗(yàn)表明，在諾麗果自然發(fā)酵基礎(chǔ)上接種植物乳桿菌可顯著提高其總酚、總黃酮及槲皮素的含量，并提高發(fā)酵果汁的抗氧化能力[20]。本實(shí)驗(yàn)中NFP發(fā)揮抗氧化活性的具體功效物質(zhì)尚不清楚，但關(guān)于諾麗發(fā)酵果渣的研究表明，諾麗果渣中含有16種酚類化合物，并以Isorhamnetin-3-O-rutinoside的含量最高[21]。但諾麗果渣為諾麗原果發(fā)酵產(chǎn)汁后的剩余部分，其功效成分可能隨果汁浸出，或與原果所含化合物存在差異，因此NFP中發(fā)揮抗氧化活性的物質(zhì)還需進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

3種提取物的綜合抗氧化活性及其對諾麗果TAC貢獻(xiàn)率由大到小的順序均為NFP>NFF>NFS，以NFP的貢獻(xiàn)率較高且綜合抗氧化能力較強(qiáng)。